CC BY
52
УДК 549.753.1
Мищенко Е.В., Каракатенко Е.Ю., Королёва М.Ю., Бабусенко Е.С.
ВЛИЯНИЕ ЦИТРАТА НАТРИЯ НА СИНТЕЗ Ag-ЗАМЕЩЕННОГО ГИДРОКСИАПАТИТА
Мищенко Екатерина Валерьевна, студент 4 курса факультета технологии неорганических веществ и высокотемпературных материалов
Каракатенко Елена Юрьевна, аспирант, ведущий инженер кафедры наноматериалов и нанотехнологии Королёва Марина Юрьевна, д.х.н., профессор кафедры наноматериалов и нанотехнологии, e-mail: m.yu.kor@gmail.com
Бабусенко Елена Сергеевна, к.б.н., доц., доцент кафедры биотехнологии Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская площадь, д. 9
В работе было проведено исследование влияния цитрата натрия на синтез наночастиц Ag-замещенного гидроксиапатита. Было установлено, что при низких концентрациях стабилизатора 0,05-0,15 М происходило образование наностержней длиной от 80 до 120 нм. С помощью ИК-спектроскопии и рентгенофлуоресцентного анализа изучен качественный состав образцов и степень замещения ионов кальция ионами серебра. Полученные образцы Ag-замещенного гидроксиапатита проявляли антибактериальную активность как на грамотрицательные, так и на грамположительные бактериях.
Ключевые слова: наночастицы, гидроксиапатит, Ag-замещенный гидроксиапатит, цитрат натрия, контролируемое осаждение, антибактериальные свойства.
INFLUENCE OF SODIUM CITRATE ON SYNTHESIS OF SILVER-INCORPORATED HYDROXYAPATITE
Miushchenko. E.V., Karakatenko E.Y., Koroleva M.Y.,Babusenko E.S. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
In this study, we investigated the effect of sodium citrate on the synthesis of Ag-substituted hydroxyapatite nanoparticles. It was found that at low stabilizer concentrations of 0.05-0.15 M, nanorods with a length from 80 to 120 nm were formed. Using IR spectroscopy and X-ray fluorescence analysis, the qualitative composition of the samples and the degree of substitution of calcium ions were studied. The samples obtained showed antibacterial activity on both gram-negative and gram-positive bacteria in the whole range of the studied concentrations of sodium citrate.
Keywords: nanoparticles, hydroxyapatite, Ag-substituted hydroxyapatite, sodium citrate, controlled precipitation, antibacterial properties.
Биокерамические покрытия на основе гидроксиапатита (ГАП) улучшают взаимодействие поверхности имплантатов с костной тканью путем стимулирования остеогенеза, особенно в начале послеоперационного периода [1]. Состав ГАП (химическая формула - Са10(РО4)6(ОН)2) схож с основным минеральным компонентом костной ткани - биологическим нестехиометрическим кальций-дефицитным апатитом. Стехиометрический ГАП обладает недостатками, которые ограничивают его использование в имплантатах, такими как хрупкость, низкая износостойкость и низкая скорость резорбции. Поэтому современные исследования направлены на синтез наноразмерного ГАП, соответствующего строению биологического ГАП [2, 3]. Уменьшить различия в содержании ионов кальция возможно путем легирования синтетического ГАП небольшим количеством другого металла (1-2%). Замещения могут изменять свойства, включая степень кристалличности, морфологию, параметры кристаллической решетки, стабильность, растворимость и механические
характеристики ГАП. Постепенное высвобождение ионов, включенных в ГАП, может способствовать восстановлению кости путем улучшения цитосовместимости и условий для адгезии остеобластов [4].
При имплантации в организм различные белки, аминокислоты и другие органические вещества легко адсорбируются на поверхности ГАП, что способствует адсорбции и репликации бактерий, впоследствии индуцирующих инфекции. Включение противомикробных агентов в структуру ГАП может предотвратить или ограничить инфекции, высвобождая противомикробные вещества в локальные области прилегающих к имплантату тканей. Серебро проявляет высокую бактерицидную активность как по отношению к аэробным и анаэробным микроорганизмам, так и к некоторым вирусам и грибам [5]. Известно, что одну из основных ролей в формировании наночастиц ГАП в организме человека играет цитрат натрия [6]. Поэтому целью настоящей работы являлось получение наночастиц Ag-замещенного ГАП (Ag-
ГАП) в присутствии цитрата натрия и исследование антибактериальных свойств полученных
материалов.
Для синтеза наночастиц может быть использован метод контролируемого осаждения, в котором ограничение роста наночастиц происходит при адсорбции на их поверхности молекул поверхностно-активных веществ или ионов [7-9].
В данной работе в качестве источника серебра использовался нитрат серебра AgNO3. Источниками Са2+ и РО43- являлись нитрат кальция Ca(NO3)2 и гидрофосфат натрия Na2HPO4, соответственно. В качестве стабилизатора роста наночастиц использовался цитрат натрия Na3C6H5O7. рН реакционной смеси контролировали с помощью водного раствора NH4OH. Все реактивы поставлялись Sigma-Aldrich и были использованы без дополнительной очистки.
Синтез наночастиц Ag-ГАП проводили методом следующим образом. Водный раствор Ag(NO3) добавляли к 1 М раствору Ca(N03)2. Молярное соотношение в растворе Ag/(Ag+Ca) = 1,5. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке со скоростью 1200 об/мин в течение 10 минут при постоянном значении рН, равном 10. Водный раствор цитрата натрия в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,30 М добавляли в сосуд, содержащий Ag(NO3) и Ca(N03)2. Затем к смеси по каплям добавляли водный раствор Na2HPO4. Молярное соотношение в растворе (Ag+Ca)/P=1,67. Температуру поддерживали постоянной и равной 40°С. Раствор перемешивали в течение 2 ч, полученный осадок старили в маточном растворе в течение 48 ч. После многократно промывали бидистиллированной водой, полученный материал сушили при температуре 120°С в течение 3 ч.
Антибактериальные свойства изучали в отношении грамположительных бактерий B. subtilis и грамотрицательных E. coli. 1 г порошка Ag-ГАП вносили в 50 мл питательного бульона, затем добавляли посевной материал. Инкубирование проводили на качалка при 20 об/мин и температуре 37°С в течение 24 ч. Затем делали высев на агаризованную питательную среду и инкубировали в термостате при 37°С в течение 48 ч. Результат оценивали по количеству выросших колоний бактерий.
Микрофотографии образцов были получены с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM-6700. Измерение Z-потенциала производили на приборе Zetasizer Nano (Malvern). ИК-спектры регистрировали на инфракрасном Фурье-спектрометре «Nicolet 380». Спектральное разрешение 4 см-1, диапазон 4000-400 см-1, общее время регистрации каждого спектра 1 мин. Элементный состав продукта был определен с помощью приставки к растровому электронному микроскопу SDX-MAX.
На рисунке 1, в качестве примера, представлены микрофотография (А) и данные
рентгеноспектрального микроанализа (Б) наночастиц Ag-ГАП, полученных методом
контролируемого осаждения в присутствии 0,15 М цитрата натрия.
А) /1
Щ^Ш Лг*
*
ШШ yf й N áff
100 нм
> ' É f
Рис. 1. Микрофотография наночастиц Ag-ГАП (А) и энергодисперсионный спектр образца (Б), полученного в присутствии 0,15 М цитрата натрия. Время старения образца в маточном растворе 48 ч
При концентрации цитрата натрия 0,05-0,15 М водные дисперсии Ag-ГАП были устойчивы к седиментации в течение длительного времени. Повышение концентрации стабилизатора от 0,05 до 0,20-0,30 М приводило к снижению ^-потенциала от -28 мВ до -7 мВ и образованию крупных агрегатов наночастиц Ag-ГАП. Частицы имели стержнеобразную форму длиной от 80 до 100 нм. Результаты РФлА показали, что с повышением концентрации цитрата натрия при синтезе Ag-ГАП степень замещения ионов кальция ионами серебра незначительно снижается.
Для изучения состава полученных образцов был использован метод ИК-спектроскопии. На рисунке 2 представлен ИК-спектр пропускания порошка Ag-ГАП, синтезированного при концентрации цитрата натрия 0,15 М.
100 90
а до
и
^ 30
с
2 20
"" 10
2649
■ ■
3575 160B * \ L ш
1423
960 "
A
805 A
a\ 565
OH 1091 t
■
A PO< 1031 A
★ COj
3200 2SOO 2400 2000
Волновое число, см-1
Рис. 2. ИК-спектр Ag- ГАП полученного при концентрации цитрата натрия 0,15 М. Время старения образца в маточном растворе 48 ч
На ИК-спектре присутствуют характерные полосы для ГАП: узкая полоса при 3575 см-1 соответствует колебанию гидроксильных групп; широкая полоса в области 2649-3650 см-1 относится к деформационным колебаниям молекул воды, а при 1800-2400 см-1 к деформационным колебаниям карбонатных групп, абсорбированных из углекислого газа воздуха. Полосы поглощения карбонатных групп присутствуют так же в области 1350-1700 см-1. Характерные полосы поглощения для вибрационных колебаний (Р04)3- 1031 и 1091 см-1 и деформационных (Р04)3- 565 и 605 см-1.
При добавлении Ag-ГАП происходит значительное ингибирование клеток В. subtilis и Е. соН (Таблица 1). При этом антибактериальные свойства порошков Ag-HAP практически не зависят от концентрации цитрата натрия, присутствующего в реакционной среде при их синтезе.
Таблица 1. Антибактериальные свойства наночастиц Ag-HAP, синтезированных при различных концентрациях
Образец Концентрация цитрата при синтезе наночастиц, М Культуры микроорганизмов
E. coli (109 КОЕ/мл) B. subtilis (1010 КОЕ/мл)
Концентрация клеток, КОЕ/мл
Питательный бульон/ГАП - 1011 1010
Питательный бульон/Ag-rAn 0,05 120 ±5 14 ±1
Питательный бульон/Ag-rAn 0,25 124 ±5 13 ±1
Можно заключить, что цитрат натрия оказывает влияние на размер, морфологию и степень замещения ионов кальция ионами серебра Синтезированные наночастицы Ag-HAP могут быть использованы в качестве антибактериального компонента покрытий стоматологических имплантатов.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ -грант 10.4702.2017 и РФФИ - грант 16-03-00658.
Список литературы
1. Li H., Khor K.A, Cheang P.-Titanium dioxide reinforced hydroxyapatite coatings deposited by high velocity oxy-fuel (HVOF) spray // Biomaterials - 2002-V. 23, No 1. - P. 85-91.
2. Фадеева Е.Ю., Королева М.Ю. Синтез наночастиц фосфатов кальция, стабилизированных цитратом натрия // Успехи в химии и химической технологии. - 2015. - Т. 29, №. 6. - С. 128-129.
3. Королева М.Ю., Фадеева Е.Ю., Катасонова О.Н., Шкинев В.М., Юртов Е.В. - Синтез наночастиц гидроксиапатита методом контролируемого осаждения в водной фазе // Ж. неорганической химии - 2016 - Т. 61, № 6 - 710-716.
4. Thomas J. Webster. Osteoblast response to hydroxyapatite doped with divalent and trivalent cations // Biomaterials - 2004. - V. 25, No 11- P. 2111-2121.
5. Liming F., Yang L., Ping G., Processing and mechanical properties of HA/UHMWPE nanocomposites// Biomaterials. - 2006. - V. 27, No. 20. - P. 3701-3707.
6. Hu Y.Y., Rowal A., Shmidt-Rohr K. Strongly bound citrate stabilizes the apatite nanocrystals in bone // PNAS - 2010. - V. 107, No 52. - P. 22425-22429.
7. Фадеева Е. Ю., Леткин Е. А., Королева М. Ю. Синтез наночастиц гидроксиапатита методом контролируемого осаждения в присутствии цетилтриметиламмоний бромида // V Международная конференция-школа по химической технологии. - 2016. - С. 314-316.
8. Фадеева Е.Ю., Леткин Е.А., Королёва М.Ю. Синтез наночастиц гидроксиапатита, стабилизированных Brij 30 //Успехи в химии и химической технологии. - 2016. - Т. 30., №. 12. - С. 46-48.
9. Koroleva M.Yu., Gulyaeva E.V., Yurtov E.V., Synthesis of CdS, ZnS and Ag2S nanoparticles stabilized by sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate and polyoxyethylenesorbitan monooleate in aqueous medium//Russian J. Inorganic Chemistry-2013- V. 58, No. 9 - P. 1034-1039
9
