CC BY
49
Том 147, кн. 3
Естественные науки
2005
УДК 582.282.22
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КАЛЬЦИЙ-МОДУЛИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS А WAMORI
О.В. Козлова, А.В. Черемных, С.Ю. Егоров, Ф.Г. Куприянова-Ашина
Аннотация
Была изучена взаимосвязь между характером роста культуры Aspergillus awamori в среде Вогеля и уровнем цитозольного кальция, меняющегося под влиянием различных кальций-модуляторов. Было установлено, что физиологические стимулы (механическое воздействие, гипоосмотический шок и увеличение концентрации хлористого кальция в среде), индуцирующие кратковременное повышение уровня кальция в клетках микромицет, не оказывали значительного влияния на скорость разрастания колоний, спорообразование и морфологию гифов. Кальций-антагонисты, эффективные ингибиторы активности Са2 каналов, при добавлении в среду в высоких концентрациях угнетали процесс спорообразования и рост колоний микромицета. Кальций-агонисты, индуцирующие бифазный Са2 ответ клеток (первичный - за счет механического воздействия, вторичный - вследствие действия агониста), не влияли на степень ветвления гифов, но ингибировали процесс разрастания колоний микромицета. Продолжительные кальциевые вспышки, вызываемые фармакологическим препаратом А23187, в значительной степени препятствовали росту и ветвлению гифов и даже приводили к их гибели, о чем свидетельствуют результаты подсчета числа живых (окрашены в зеленый цвет) и мертвых (красные при люминесцентной микроскопии) клеток. Так, ионофор А23187 (10 мкМ) способствовал гибели 50% клеток, в то время как в среде с кофеином (5мМ) погибало приблизительно 5% клеток. В контрольных образцах культур оставались живыми 95% клеток.
Введение
В литературе широко представлена информация о роли кальция как вторичного мессенджера, с помощью которого осуществляется трансдукция различных внешних стимулов и гормональных сигналов в клетках млекопитающих и растений [1, 2]. Однако имеются очень скудные сведения об этом участнике клеточной регуляции у мицелиальных грибов, что обусловлено, в том числе, различиями в архитектонике клеток низших и высших эукариот. Анализ Са2-ответа мицелиальных грибов методом рекомбинантного экворина на воздействия ряда физико-химических факторов, а также фармакологических препаратов (блокаторов и стимуляторов кальциевых каналов) показал, что при формировании кальциевого ответа микромицеты обладают несколькими системами транспорта Са , обеспечивающими лабильность уровня этих ионов в цитозоле, а именно такими, как поступление кальция из среды роста и (или) из внутриклеточных резервуаров [3, 4]. Уровень внутриклеточного кальция определяется балансом его поступления, выведения, аккумуляции в резервных клеточных органеллах, соединения с Са2-связывающими белками и другими кле-
точными компонентами. Хотя все эти процессы разделены, они могут быть скоординированы друг с другом и тонко регулировать уровень внутриклеточного кальция, а с другой стороны - контролироваться общим регуляторным механизмом.
Вместе с тем, в литературе мало данных о зависимости скорости роста ми-целиальных грибков от изменения уровня Са в клетках. Имеются лишь единичные сообщения относительно активного участия Са2+ в регулировании роста окончаний гифов мицелия, а также их ветвления [5, 6]. Тем не менее, неизвестно, какое влияние на спорообразование и морфологию гифов мицелиаль-ных грибов оказывают кальциевые вспышки, возникающие в клетках под действием внешних стимулов.
В соответствии с вышеизложенным, целью настоящей работы было выяснение взаимосвязи между клеточным ростом и изменением пула внутриклеточного кальция микромицетов в ответ на внешние воздействия.
1. Условия эксперимента
Объектом исследования был штамм Aspergillus awamori 66А, полученный из лаборатории исследования клеток микромицетов Эдинбугского университета. Штамм A. awamori 66А представляет собой мутант с экспрессированным фотобелком - экворином [7], который при взаимодействии с Са распадается на апоэкворин и селентрамид с выделением энергии в голубой части спектра, а интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации Са2+ в цитозо-ле[8].
Культуру A. awamori 66А выращивали в жидкой среде Вогеля в каплях среды (50 мкл) на покровных стеклах, помещенных во влажную камеру, а также в чашках Петри на агаризованной среде (2% агара в среде Вогеля) при температуре 30°С. Исходная концентрация спор 5х105/ мл после достижения экспоненциальной фазы роста микромицетов (24 ч) культуру подвергали внешним воздействиям.
Физиологические стимулы находились в пределах толерантных для исследуемого штамма аспергилла. Высокие концентрации Са + создавались дополнительным внесением в среду Вогеля СаС12 до конечного уровня 0.005-50 мМ. Осмотический шок вызывали разбавлением среды в 3 раза, а механический шок - «взбалтыванием» культур в течение 5 мин. при 140 об./мин. [3].
Фармакологические препараты: Са -антагонисты (La - ингибитор активности кальциевых каналов, КР4 - ингибитор активности кальциевых каналов у микромицетов, ВАРТА хелирует кальций) и Са -агонисты (А23187 - ионофор селективного действия ионов кальция, Бг-А23187 - аналог А23187 - нефлурес-центный, кофеин - стимулятор транспорта ионов кальция из внутриклеточных резервуаров кальция, циклопиазоновая кислота - ЦПК-ингибитор Са АТФазы, способствующей заполнению внутриклеточных резервуаров кальция), использованные в экспериментах, добавляли в среду Вогеля (25 мкл) за 5 мин. до физико-химического воздействия. Препараты вносили в минимально эффективных концентрациях (мМ, мкМ), как показано в работе [3]. В контрольном варианте среда содержала добавленный в нее растворитель препарата в соответствующей концентрации.
Количественный анализ результатов воздействия фармакологических веществ на рост и спорообразование культур А. ам>атоп осуществляли при выращивании микромицета в плотной среде Вогеля в чашках Петри. Инокуляцию осуществляли с помощью специальных дисков диаметром 6 мм, которые пропитывали споровой суспензией (5х105 спор/мл) и помещали поверх фильтровальной бумаги в центре чашки Петри. Культуру выдерживали при 30°С в течение 24 ч, после чего диск снимали и помещали в среду Вогеля, содержащую исследуемые фармакологические препараты. Контрольные варианты включали растворитель препаратов в соответствующей концентрации. Измерения диаметра колонии микромицета и уровня спорообразования проводили через каждые 24 ч в течение 8 дней.
Исследование ветвления гифов культуры А. ам>атоп осуществляли после выращивания ее в жидкой среде Вогеля на покровном стекле в течение 24 ч при 30°С и последующем воздействии внешних факторов: а) внесение в 5% или 100%-ную среду Вогеля хлористого кальция в количестве 10 мМ /50 мкл (при конечной концентрации экзогенного кальция - 5 мМ); б) добавление препарата А23187 в двух концентрациях - 10 и 50 мкМ; в) наблюдение за контрольным образцом. Анализ частоты ветвления гиф проводился с помощью световой микроскопии через 1, 3, 5, и 7 ч после каждого воздействия.
Разрастание ветвления гифов определяли после выращивания культуры А. ам>атоп в плотной среде Вогеля на целлофане. Для этого кусочки целлофана диаметром 8.5 см пропитывали дистиллированной водой, покрывали алюминиевой фольгой и автоклавировали (1 атм./30 мин.). Затем каждый кусочек стерильного целлофана переносили на поверхность среды в чашку Петри и наносили бактериальной петлей суспензию спор А. ам>атоп. Чашки выдерживали в темноте при 30°С в течение 24 ч, после чего целлофан переносили в среду Во-геля, содержащую исследуемое вещество. Пробы отбирали на покровное стекло вместе с целлофаном и анализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Морфология культуры изучалась с использованием красителя БМ4064. С этой целью плотную среду Вогеля засевали суспензией спор, инкубировали 24 ч при 30°С, затем содержащие мицелий кусочки агара вырезали из среды и помещали в перевернутом виде на среду, содержащую исследуемый фармакологический препарат. В контрольных образцах кусочки агара помещали на среду Вогеля с растворителем препарата. По истечении 30 мин. и далее через каждый час анализировали микроскопическое изображение клеток.
Жизнеспособность клеток определяли с помощью окрашивания живых и убитых микроорганизмов [9]. Данный тест основан на способности иодида про-пидиума определять целостность плазматической мембраны, а препарата флуо-ресцин диацетата (ФДА) - выявлять специфические реакции ферментов в цито-золе. Основные растворы препаратов в концентрации 3 мг/мл готовили отдельно. Иодид пропидиума растворяли в дистиллированной воде, ФДА - в ацетоне и оба препарата смешивали в равных объемах непосредственно перед внесением в культуру. Окрашенные культуры изучали под флуоресцентным микроскопом и регистрировали убитые или поврежденные клетки, излучающие красный цвет, а также живые - окрашенные в зеленый цвет.
Эксперименты проводили в пятикратной повторности, при обработке полученных результатов применяли метод вариационно-статистического анализа с использованием уровня значимостир < 0.05.
2. Результаты и обсуждение
Для характеристики роста и морфологии микромицетов, подвергнутых воздействию физико-химических и фармакологических стимулов, изменяющих, как показано [3] пул внутриклеточного кальция, предварительно анализировали рост культуры А. ам>атоп в жидкой среде Вогеля без какого-либо воздействия на клетки (контроль). В экспериментах из протестированных четырех концентраций спор в 1 мл инокулята (5-10 - 5-10) оптимальной для анализа роста микроколоний была концентрация 5-105 спор/мл. Через 24-48 ч (экспоненциальная фаза роста) методом фазово-контрастной микроскопии у микроколоний обычно регистрировалась одна длинная проростковая труба и еще 1-2 трубочки на много короче первой (рис. 1).
Рис. 1. Микроколонии 24-х часовой культуры А. ам>атоп, выращенной в капле жидкой среды Вогеля
Через 72 ч культивирования грибков наступала стационарная фаза роста и через 96 ч - фаза споруляции.
При исследовании влияния на рост микромицетов физико-химических стимулов (механическое воздействие, гипоосмотический шок и повышение концентрации кальция в питательной среде) подсчитывали число ветвей гифов, образующихся от главной (самой длинной) проростковой трубочки в микроколониях 24-х часовых культур. В случае каждого вида воздействия анализировали 75 микроколоний (по 24 на одном покровном стекле). Подсчет осуществляли в течение 7 ч (через 1, 3, 5, 7 ч) после того, как 24-х часовые культуры были подвергнуты воздействию. Данные табл. 1 указывают, что при всех вариантах воздействия на гифы мицелия число разветвлений от главной проростковой трубочки со временем увеличивалось в сравнении с контролем (р < 0.05).
Табл. 1
Влияние различных физико-химических стимулов на ветвление гифов мицелия А. ам>а-твп экспоненциальной фазы роста (х ± - среднее ± стандартная ошибка)
Время после стимуляции Контроль Механическое воздействие Гипоосмотиче-ский шок Добавление 5 мМ СаС12
1 ч 1.13±0.05 1.16±0.05 1.16±0.05 1.16±0.05
3 ч 1.46±0.08 1.54±0.07 1.47±0.08 1.57±0.16
5 ч 1.59±0.10 1.59±0.08 1.59±0.14 1.60±0.08
7 ч 1.96±0.12 1.98±0.14 1.96±0.9 2.01±0.08
Из литературы известно [3], что кальциевые вспышки в ответ на примененные виды физико-химических воздействий были очень короткими, и содержание кальция в гифах микромицета восстанавливалось в течение нескольких минут, в результате чего существенных изменений в скорости роста мицелия зарегистрировать не удалось.
Табл. 2
Влияние кальцимицина (А23187) на процесс ветвления гифов А. ам>атвп
Время инкубации Контроль Добавление 10 мкМ А23187 Добавление 50 мкМ А23187
1 ч 1.27±0.05 1.08±0.05 1.06±0.05
3 ч 1.45±0.09 1.09±0.03 1.09±0.03
5 ч 1.50±0.07 1.09±0.03 1.09±0.03
7 ч 1.90±0.12 1.09±0.03 1.09±0.03
Для полноты информации о зависимости скорости роста аспергилл от содержания внутриклеточного кальция было изучено действие на микромицеты фармакологических препаратов, повышающих активность функционирования кальций-транспортных систем (агонистов). Как известно, А23187 (кальмицин) является мобильным переносчиком ионов, образующим устойчивые комплексы с двухвалентными катионами. В животных клетках (при концентрациях приблизительно 10 мкМ) А23187 стимулирует поступление кальция в цитозоль из внешней среды [10]. В своих экспериментах при тестировании кальций-чувствительного ионофора А23187 выращивали микромицет в капле (50 мкл) жидкой среды Вогеля в течение 24 ч, после чего добавляли разные концентрации препарата. Как показано в табл. 2, препарат в конечных концентрациях 10 мкМ и 50 мкМ/100 мкл среды вызывал значительное подавление ветвления гифов в сравнении с контролем.
Негативное действие кальций-агониста А23187 на ветвление мицелия аспергилл могло быть вызвано неравномерным распределением препарата в жидкой среде. Было обнаружено образование сгустков препарата вокруг гифов при длительном выдерживании в водном растворе. Аналогичная ситуация характерна и для кофеина, который после добавления его в культуральную среду со временем концентрировался вокруг гифов в виде кристаллических структур.
Табл. 3
Влияние агонистов на рост гифов А. ам>ашвг1
[Са2+]-агонист 0.5 ч 1.5 ч 2.5 ч 3.5 ч 4.5 ч
10 мкМ А23187 (кальцимицин) да да нет нет нет
20 мкМ (ЦПК) (цикло-пиазоновая кислота) да да да да да
5 мМ кофеина нет нет да да да
Да - очевидный рост, нет - отсутствие роста.
С целью исключения возможных артефактов за счет агрегации фармакологических препаратов в жидкой среде, аналогичные исследования были проведены на агаризованной среде Вогеля. Во избежание неспецифических побочных эффектов высоких концентраций кальций-агонистов на рост микромицетов анализ микроскопических изображений гифов мицелия осуществлялся только при воздействии на них минимальных концентраций исследуемых препаратов (табл. 3).
Как оказалось, А23187 полностью ингибировал рост отдельных гифов через 2.5 ч после переноса культуры в среду с препаратом. Однако в среде, содержащей кофеин, рост окончаний мицелиальных гиф возобновлялся через 2.5 ч, а циклопиазоновая кислота (ЦПК) вообще не подавляла рост мицелия в течение 4.5 ч.
Изучение морфологии гифов мицелия методом фазово-контрастной микроскопии показало, что через 1 ч после инкубации культуры с А23187 в конечной концентрации 10 мкМ на окончаниях гифов появлялось много коротких веточек, особенно в верхней части гиф (рис. 2), которые после 2 ч разрывались.
Полученные результаты, очевидно, объясняются увеличением концентрации кальция в клетках А. ам>ашоп. Причем кальциевый ответ на воздействия агонистов был бифазным: первичный - очень быстрый - вызывался механической стимуляцией клеток микромицетов в процессе внесения препарата, в результате чего происходило поступление кальция из внешней среды, а, возможно, и из клеточных органелл. Вторичный ответ - более продолжительный - мог быть результатом выхода ионов кальция из внутриклеточных резервуаров [3]. Таким образом, на основании результатов исследований можно прийти к заключению, что А23187 убивает клетки гифов микромицета, в то время как кофеин (5мМ) и ЦПК (20 мкМ) не оказывают значительного влияния на морфологию и физиологию мицелиальных гиф. Полученные данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями о том, что последующее за кальциевой вспышкой снижение концентрации кальция в цитозоле является обязательным условием функционирования кальциевой сигнальной системы. Более того, длительное сигнал-индуцированное повышение концентрации ионов кальция может привести к гибели клетки [11].
Далее был проведен анализ влияния кальций-модуляторов на скорость роста колоний и спорообразование микромицета. Исследование действия такого физико-химического стимула, как увеличение концентрации хлористого каль-
Рис. 2. Влияние А23187 на морфологию и ветвление гифов мицелия А. ам>атоп, выращиваемой в агаризованной среде Вогеля в течение 24 ч
ция в среде роста (0.5 мМ и 5 мМ) аспергилла, показало, что он не оказывал влияния на спорообразование, но вызывал после 72-х часовой инкубации увеличение скорости разрастаний колоний в плотной среде.
Анализ изменения скорости разрастания колоний, спорообразования и ветвления гифов мицелия под воздействием на микромицеты фармакологических препаратов (антагонистов) показал, что добавление в среду роста ланта-нума хлорида в количестве 20 мМ приводило к замедлению роста и процесса спорообразования через 72 ч после воздействия. При этом споры имели светло-коричневый цвет в сравнении с темно-коричневым в контроле, а скорость разрастания колонии сократилась примерно на 30%. Сопоставляя выявленный эффект с известным фактом [3], что лантанум-блокатор кальциевых каналов при концентрации 20 мМ, использованной в наших экспериментах, вызывает вторичную кальциевую вспышку, соответствующую выходу Са2+ из внутриклеточных органелл, можно предположить, что замедление скорости роста аспер-гилла в присутствии лантанума обусловлено подавлением активности Са2-АТФазы, которая отвечает за транспорт кальция из цитозоля.
При исследовании ВАРТА в двух концентрациях (1 мМ и 5 мМ) было установлено, что этот препарат в дозе 1 мМ не оказывал существенного влияния на разрастание колоний и образование спор, но в концентрации 5 мМ он сразу замедлял рост культуры, причем через 24 ч скорость разрастания колоний мик-ромицета составляла 25-30% , через 192 ч - 18-20% по сравнению с контролем, принятым за 100%. Таким образом было показано, что применение таких Са -антагонистов, как хлорид лантанума (эффективно ингибирует Са -каналы Ь-типа, локализованные в плазматической мембране) и ВАРТА (снижает концентрацию внеклеточного кальция путем его хелирования), в высоких концентрациях (20 мМ и 5 мМ соответственно) замедляло скорость роста колоний и процесс образования спор, что обусловлено, по данным [3], ингибированием кальциевых ответов микромицетов, индуцированных физико-химическими стимулами.
Изменение физиологии аспергилла и процесса спорообразования наблюдалось также при действии на микромицеты кальций-агонистов (А23187, кофеин,
ЦПК). На примере А23187 можно видеть, что через 48 ч после воздействия радиус колонии микромицета возрастал на 54%, а к концу эксперимента (через 192 ч) - только на 38% по сравнению с контролем, принятым за 100%. Кофеин (5мМ) сильно замедлял разрастание колонии так, что в конце эксперимента его скорость составляла лишь 10% в сравнении с контролем.
Применение ЦПК в концентрации 20 мкМ приводило к незначительному замедлению роста клеток через 96 ч после воздействия и никак не влияло на процесс спорообразования.
Результаты подсчета числа живых и мертвых клеток в культурах, подвергнутых воздействию кальций-агонистов, показали, что ионофор А23187 (10 мкМ) способствовал гибели 50% клеток, в то время как при воздействии кофеином (5 мМ) после 3-х часовой инкубации погибало лишь около 5% клеток, возможно, вследствие естественного отмирания гифов мицелия или механического воздействия на клетки в процессе переноса препарированных культур на предметное стекло для микроскопии. Количество же живых гифов (окрашенных в зеленый цвет) в контрольных и опытных образцах культур было примерно одинаковым (95%). Аналогичные результаты были получены при воздействии на микромицет циклопиазоновой кислоты (ЦПК в концентрации 20 мкМ).
Итак, показано, что, используемое клеткой в качестве сигнального интер-медиата, повышение концентрации кальция в цитозоле, способствует регуляции роста развития микромицета. При этом длительное сигнал-индуцирован-ное повышение концентрации ионов кальция может привести к гибели клеток. Необходимо иметь в виду и то, что значительное повышение уровня кальция вблизи кальциевых каналов может привести к их закрыванию и ограничению поступления кальция из окружающей среды или клеточных органелл в цито-золь. В результате, как недостаток кальция в цитозоле, так и его избыток может препятствовать росту и развитию микромицетов.
Summary
O.V. Kozlova, A.V. Cheremnyh, S.U. Egorov, F.G. Kypriyanova-Ashina. The effect of various calcium modulating influences on the growth of Aspergillus avamori.
The relationship between growth of Aspergillus awamori in Vogel medium and cytosolic calcium, depending of the various Ca-modulators, was studied. It was established, that physiological stimuli (hypoosmic shock, increasing of CaCl level in medium) inducing short-time increasing Ca-level in micromycetes cells did not influence the gifs colonies growth, spore forming and gifs morphology. The Ca-antagonists (lanthanum, КР4 and preparatum VARTA), the effective Ca-channels activity inhibitors, leaded in high concentrations to decreasing of spore forming and micromycetes colony growth. The Ca-agonists (caffeine, А23187 and CPA), inducing biphasic Са2 cell response did not influence the branching of gifs, caffeine had a negative effect on the spore forming. The pharmacological preparatum А23187 induced long calcium flashes leaded to the death of gifs proved by count of alive and dead cells. So, the А23187 ionofore leaded to the death of 50% of the cells, whereas in the caffeine containing medium only 5% cells were dead.
Литература
1. Ткачук В.А. Фосфоинозитидный обмен и осцилляция ионов Ca2+ // Биохимия. -1998. - Т. 63, № 1. - С. 47-56.
2. Крутецкая З.Н., Лебедев О.Е. Механизмы Са2+-сигнализации в клетках // Цитология. - 2001. - Т. 43, № 31. - С. 5-32.
3. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Ашина Ф.Г., Рид Н., Эль-Регистан Г.И. Анализ Са2-ответа мицелиальных грибов на внешние воздействия с использованием рекомбинантного экворина // Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 6. - С. 734-740.
4. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Ашина Ф.Г., Рид Н., Эль-Регистан Г.И. Влияние химического аналога микробных аутоиндуторов анабиоза на Са2-ответа мицелиальных грибов // Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 6. - С. 741-750.
5. Schmid J., Harold F. Dual role for calcium ions in apical growth of Neurospora crassa // J. Gen. Microbiol. - 1988. - V. 134. - P. 2623-2631.
6. Jackson S.L., Heath I.B. Effects of exogenous calcium ions on tip growth, intracellular Ca2+ concentration, and actin arrays in hyphae of the fungus Saprolegnia ferax // Experimental mycology. - 1989. - V. 13. - P. 1-12.
7. Nelson G. Development of the recombinant aquaria method and its evaluation for calcium measurement in filamentous fungi. - Edinburgh University, 1999. - P. 59-69.
8. Vogel H.I. A convenient growth medium for Neurospora (Medium N) // Microbial Genetics Bulletin. - 1956. - V. 51. - P. 107-124.
9. Oparka K.J., Read N.D. The use of fluorescent probes for studies in living plant cells // N. Harris, K.J. Oparka (eds.) Plant Cell Biology. A Practical Approach. - Oxford: Oxford University Press, 1994. - P. 27-50.
10. Robson T., Wiebe M.G., Trinci A.P. Low calcium concentration induce increased branching in Fusarium graminearum // Mycological Res. - 1991. -V. 95. - P. 561-565.
11. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. - Казань: Изд-во ФЭН, 2001. -С. 308-316.
Поступила в редакцию 26.10.05
Козлова Ольга Владимировна - кандидат биологических наук, кафедра микробиологии Казанского государственного университета.
Черемных Антон Владимирович - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
Егоров Сергей Юрьевич - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: Sergey.Egorov@ksu.ru
Куприянова-Ашина Флера Гарифовна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры биологии Казанского государственного университета.
