CC BY
51
Том 152, кн. 2
Естественные науки
2010
УДК 582.282.22
КАЛЬЦИЕВЫЕ СИГНАЛЫ У МИКРОМИЦЕТОВ И ДЕТЕКЦИЯ ИХ С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭКВОРИНА
О.В. Козлова, С.Ю. Егоров, Ф.Г. Куприянова-Ашина
Аннотация
В обзоре впервые проведен анализ данных литературы и результатов собственных исследований авторов о Са2+-сигнальных системах растений, животных и низших эука-риот, о механизмах кальциевых потоков в клетках и роли кальцийсвязывающих белков в этих процессах. Детально рассмотрены вопросы передачи внешних сигналов на Са2+-ответ и методы измерения кальциевых вспышек в цитозоле. В статье описаны данные литературы по использованию рекомбинантного экворина для определения внутриклеточного кальция у животных, растений и микромицетов, а также приведены собственные результаты измерения пула Са2+ в клетках микромицетов с использованием мутантного штамма Aspergillus awamori c рекомбинантным Са2+-зависимым фоточувствительным белком экворином. Авторами установлена динамика Са2-ответа микромицета на стрессовые воздействия. С использованием различных блокаторов Са2-каналов, а также аго-нистов, специфически повышающих их активность, было установлено, что повышение уровня Са2+ в цитозоле микромицета Aspergillus awamori обеспечивается за счет его поступления как из среды, так и из внутриклеточных резервуаров. Основную роль в поступлении Са2+ в клетки микромицетов играют потенциалзависимые транспортные системы.
Ключевые слова: Са2+ -сигнальные системы, мицелиальные грибы, микромицеты Aspergillus awamori, рекомбинантный экворин, динамика Са2+.
Введение
В концепции о вторичных посредниках регуляции клеточного метаболизма особое место отводится универсальной роли кальция. В клетках эукариот формирование пула Са , вовлеченного в регуляторные процессы, осуществляется разными путями. В мембранах клетки функционируют структуры, обеспечивающие вход Са + в цитоплазму по градиенту его концентрации (Са -каналы), а также системы активного транспорта Са2+ против градиента концентрации, использующие для этого либо энергию АТФ (Са2-насос), либо градиенты других ионов (например, №-/Са-переносчик).
В литературе широко представлена информация о Са -каналах в клетках животных и растений [1-3]. Данные о роли кальция в клеточной регуляции умикромицетов не многочисленны, что обусловлено в том числе различиями в архитектонике клеток низших и высших эукариот. Между тем в этой проблеме остается много неясного, что делает ее одной из наиболее актуальных в современной физиологии мицелиальных грибов. Фактором, сдерживающим детальные исследования функций кальция у микромицетов, было отсутствие практичных
и надежных методов мониторинга внутриклеточных свободных ионов Са2+ в живых клетках. Выявление микроконцентраций Са2+ с помощью флуоресцентных красителей оказалось технически трудно выполнимым, а результаты -не слишком надежными. Только благодаря использованию клеток мицелиаль-ного гриба Aspergillus awamori, трансформированных с помощью гена эквори-на, стало возможным детектировать изменения содержания Са2+ в ответ на разнообразные внешние стимулы, что позволяет установить регуляторную роль изменений пула Са2+ у микромицетов в процессах преобразования внеклеточных стимулов в клеточный ответ.
1. Кальциевые сигнальные системы у эукариот
Кальций является убиквитарной внутриклеточной сигнальной молекулой, контролирующей целый ряд процессов, происходящих внутри клетки [4-6]. В течение своей жизнедеятельности клетка должна отвечать на самые разнообразные, часто прямо противоположные внешние стимулы, многие из которых используют Ca2+ в качестве вторичного мессенджера. В этой связи возникает вопрос: как такая простая сигнальная молекула может регулировать разнообразные клеточные процессы? Вероятно, что ряд факторов, таких, как история эволюции клетки, присутствие других сигнальных молекул и место расположения в клетке элементов, обрабатывающих кальциевый сигнал, вносят свой вклад в процессы контроля кальциевых сигнальных систем эукариот [7, 8].
Существует несколько гипотез, позволяющих ответить на вопрос, почему в процессе эволюции именно кальций стал универсальной молекулой внутриклеточной сигнализации. Согласно одной из гипотез клетки сначала выработали механизмы поддержания очень низкого уровня свободного внутриклеточного Са , намного ниже миллимолярной концентрации в морской воде [9]. Это могло быть связано с тем, что Са2+ способен связываться с фосфатными группами АТФ, АДФ и АМФ, которые жизненно важны для энергетического метаболизма клеток [10], то есть поддержание очень низкого уровня концентрации Са было необходимым условием фосфатного метаболизма [11]. Таким образом, уже на ранней стадии эволюции клетка имела систему транспортировки Са2+ из цито-золя для поддержания постоянной концентрации Са на микромолярном уровне.
Другой причиной, побудившей рассматривать Са2+ в качестве вторичного посредника, является его способность координировать взаимодействие большого числа атомов кислорода (6-8), что позволяет осуществлять структурные изменения белков, приводящие к поступательным изменениям в сигнальных последовательностях [9]. Соответственно, даже незначительные изменения пула Са2+ могут активировать самые разнообразные сигнальные процессы.
Предпосылкой к возникновению третьей гипотезы, рассматривающей Са2+ в качестве сигнальной молекулы, явился факт низкой скорости проникновения Са2+ в цитозоль, а также негомогенное распределение внутриклеточных запасов Са2+, формирующее органеллы с различным его содержанием. Эти факторы обеспечивают пространственное изменение концентрации Са2+ в различных частях цитозоля, что позволяет разным кальциевым сигналам быть пространственно разделенными внутри одной клетки [12, 13].
Специфика кальциевых сигнальных систем в клетках растений и животных прежде всего зависела от того, насколько клетка могла ответить на определенный стимул. В тех случаях, когда клетка была способна это сделать, следующим шагом дифференцирования Са2-активирующих стимулов являлось сравнение амплитуды, пространственных и временных характеристик кальциевого сигнала, отраженных в так называемых Са -профилях. Кинетика стимулиндуцирован-ных изменений концентрации Са2+ может существенно различаться как в растительных, так и в животных клетках [8, 14].
Стимулиндуцированные увеличения концентрации Са могут возникать в виде спайков (единичных непродолжительных ответов на определенные стимулы), вибраций (повторяющихся клеточных ответов Са ) и волн, то есть пространственного коррелята одного спайка Са , при котором концентрация Са сначала повышается в каком-то одном месте, а затем распространяется по всей клетке как регенеративное увеличение концентрации [6, 9]. Было также установлено, что механизмы возникновения и сохранения этих видов увеличения концентрации Са2+ обладают потенциалом кодирования сигнальной информации. Показано, что сигнальная информация может кодироваться в различных характеристиках «профиля» кальциевой вспышки: амплитуде, ее частоте и продолжительности [8, 14]. Различают четыре разных параметра Са2-вспышки: время подъема, пиковая концентрация, время спада и уровень концентрации в состоянии покоя после вспышки. В период повышения концентрации Са2+ в цитозоле поступление его превышает выход из цитозоля. В момент пика кальциевой вспышки количество Са , поступающего в цитозоль, равно количеству Са2+, вытекающего из него. В период спада пика, несмотря на то что увеличение концентрации Са2+ все еще продолжается, его выход из цитозоля преобладает над поступлением в цитозоль. Концентрация Са после вспышки может оставаться на более высоком уровне, чем до нее, и может сохраняться на этом уровне в течение значительного промежутка времени.
В клетке, пребывающей в состоянии покоя, уровень Са находится в пределах 50-200 нМ [12]. Концентрация Са2+ во внеклеточной среде в 104 раза выше, чем 200 нМ [15]. Трансдукция кальциевого сигнала обычно сопровождается временным увеличением концентрации Са , которое часто происходит в определенной части клетки [13, 16]. Общая схема трансдукции кальциевого сигнала в клетках эукариот приведена на рис. 1.
[Внеклеточный стимул ^ Рецептор ^ Са2+-канал ^ ^ Са2+ ± Кальмодулин ^ Белки ^ Ответ]
Рис. 1. Схема сигнальной Са2+-цепи [10]
Степень увеличения концентрации Са2+ часто зависит от силы сигнала [17]. Стимулы, поступающие из окружающей среды, передаются через один из рецепторов плазматической мембраны [18]. Эти рецепторы связаны главным образом с О-белком. В ответ на стимуляцию концентрация Са2+ увеличивается либо вследствие его проникновения в клетки через кальциевые каналы плазматической мембраны, либо за счет высвобождения из внутриклеточных органелл [16].
Внеклеточный сигнал
Рис. 2. Схема кальциевого обмена в клетке [21]
Согласно рис. 2, когда внеклеточный лиганд связывается с рецептором мембраны, соединенным с G-белком, он изменяет свою структуру и обычно активирует фосфолипазу С, что приводит к гидролизу 4,5-бифосфата фосфотидилино-зитола (ФИФ2) в диацилглицерол (ДАГ) и 1,4,5-трифосфат инозитол (ИТФ). ИТФ выступает в качестве вторичного сигнала и диффундирует с места своего образования в соответствующую органеллу, которая аккумулирует Са +. Здесь он присоединяется к рецептору на мембране органеллы, что приводит к изменению его структуры и в результате взаимодействия с интегральным каналом способствует проникновению Са через него в цитоплазму [19, 20]. ИТФ был найден в клетках животных, растений и грибов. В клетках животных ИТФ вызывал высвобождение Са2+ из эндоплазматического ретикулума (ЭПР), являющегося важным кальциевым депо. В клетках микромицетов ИТФ индуцировал отток Са2+ из вакуолей, которые в гифах грибов выполняют роль Са2-депо.
Свободные ионы Са2+ взаимодействуют с различными кальцийсвязываю-щими белками, что имеет важное значение для регуляции концентрации Са в цитозоле. Во многих случаях Са2+ присоединяется к кальмодулину (КМ), который в свою очередь взаимодействует с различными белками, участвующими в окончательном клеточном ответе, и регулирует их деятельность. Помимо этого, Са2+ может напрямую регулировать активность определенных белков, например таких, как протеинкиназы или белки ионных каналов [21, 22].
С учетом того что концентрация свободного Са в цитозоле приблизительно на 4 порядка ниже, чем во внешней среде или в органеллах, аккумулирующих Са2+ [20, 21], выброс Са2+ из цитозоля должен обеспечиваться энергией, образующейся в результате гидролиза АТФ [23].
2. Механизмы кальциевых потоков в клетках
Несмотря на то что механизмы потоков кальция в клетках разнообразны, основной механизм действия Са2+ довольно прост. Когда уровень внутриклеточного Са2+ находится в норме, клетка пребывает в состоянии покоя, но при
повышении концентрации внутриклеточного Са2+ клетка становится активной и выполняет определенные функции. Изменение степени активности клетки определяется действием двух различных механизмов. Один из них (приток Са ) обеспечивает поступление Са2+ в цитоплазму из внутренних хранилищ и внешней среды. Эти два источника могут использоваться вместе или по отдельности. Другой механизм (отток Са ) способствует уменьшению содержания Са в цитозоле вследствие перекачивания его либо во внутренние хранилища, либо за пределы клетки [24].
Высокий электрохимический градиент Са2+, существующий внутри клетки, требует жесткого регулирования притока Са2+, который проникает в цитоплазму в основном через кальциевые каналы. При поступлении кальциевого сигнала тотчас включаются механизмы оттока Са и начинается процесс восстановления его нормального уровня за счет перекачивания во внутренние депо либо в окружающую среду. Эти процессы должны происходить очень активно, так как для проникновения Са сквозь мембраны необходимо преодолеть сопротивление электрохимического градиента.
В литературе достаточно полно описаны условия притока и оттока Са у дрожжевых организмов на генетическом и биохимическом уровнях [25], тогда как у нитчатых грибов Magnaporthe oryzae [26], Pénicillium notatum [27], Tricho-derma viride [28] и Aspergillus nidulans [29] установлены лишь некоторые части системы транспорта Са2+. В сложном механизме поступления Са2+ в клетку одним из важнейших условий является осмотический градиент Са2+. Другой воздействующей силой служит антипортер Са +/nH [12, 30], хотя унипорт Са + также может играть некоторую роль. Антипорт И+/Са2+ обнаружен у дрожжевых клеток [31] и в вакуолярных мембранах растений [31, 32]. Описан также отток кальция из гифы Trichoderma viride [33], происходящий одновременно с его притоком, но с участием в этих процессах разных транспортных систем. Отток большей части Са2+ у Ustilago maydis наблюдался в результате деятельности Са2-АТФаз [34].
Кальциевые каналы у животных и растений классифицируются по их местонахождению в клетке. Те, которые локализованы на плазматической мембране, относятся к каналам, контролирующим приток Са , а находящиеся на внутриклеточной мембране - к контролирующим отток Са2+ [12, 14]. Са2-каналы, расположенные на плазматической мембране, классифицируют также в зависимости от того, как контролируется их деятельность. По этому признаку различают 3 типа каналов: потенциалоперируемые, работающие за счет разности потенциалов, лигандоперируемые и активируемые механическим растяжением мембраны. Большинство каналов на плазматической мембране животных клеток относятся к первому типу, то есть открываются в результате деполяризации мембраны. Многие из этих каналов также регулируются фосфорилированием или белками, связывающими ГТФ. Каналы лигандоперируемые активируются присоединением внеклеточных агонистов, таких, например, как глутамат и АТФ. Каналы третьего типа активируются за счет растяжения плазматической мембраны [23]. Причем плазматические мембраны клеток животных содержат Са2-каналы, которые активируются также самим Са2+. Механизм действия последних пока еще не ясен, но существует гипотеза, что пустые хранилища Са2+
высвобождают мессенджер, который проникает в мембрану и способствует активации этих каналов [24, 35].
Высвобождение Са из внутренних депо может происходить через каналы, открываемые либо лигандом, либо за счет разности потенциалов. В животных клетках различают два семейства рецепторов, отвечающих за высвобождение Са2+: рецепторы 1,4,5-трифосфата инозитола (ИТФ) и рецепторы рианодина (RyRs). Информация, контролирующая открывание этих каналов, передается либо с поверхности клетки через прямое взаимодействие между белками, либо через способного к диффузии внутриклеточного мессенджера, который мобилизует Са2+, например ИТФ или циклическую рибозу дифосфата аденозина (цАДФ-рибоза) [24]. Считается, что в животных клетках каналы, открываемые ИТФ, находятся главным образом в ЭПР. У растений эти каналы отвечают за высвобождение Са2+ из везикул и интактных вакуолей [23]. Для растений показано два различных типа кальциевых каналов плазматической мембраны, из которых один реагирует на дигидропиридин (ДТП), другой - на фенилалкиламин. Каналы Са2+ на эндомембранах подобны тем, которые известны у животных [35].
Относительно микромицетов имеются сведения, что у них Са проникает в цитозоль через каналы всех трех типов [10], причем каналы третьего типа (активируемые растяжением мембраны) реагируют на различные механические воздействия и гипоосмотический шок [36]. У дрожжевых организмов были обнаружены два гена, продукты которых выполняют роль переносчиков Са2+: CCH1 и MIDI. MIDI является трансмембранным белком, обладающим некоторой гомологией с катионными каналами, активируемыми циклическими нук-леотидами. CCH1 обладает высокой степенью гомологии с белками гена а1 субъединицы Са2-каналов животных клеток. Вероятно, оба эти белка участвуют в одном и том же процессе поглощения Са [37, 38]. Присутствие MIDI было также показано у мицелиалного гриба Neurospora crassa [39].
В транспорте кальция у животных и растений участвуют два крупных класса АТФаз: Са -АТФазы, локализованные в ЭПР, переносяшие два иона кальция на каждую гидролизованную молекулу АТФ, не стимулируемые КМ, и Са -АТФаза, находящаяся в плазматической мембране (ПМ), переносящая один ион кальция на одну гидролизованную молекулу АТФ, стимулируемая КМ. Значение Са2-АТФаз для клеток дрожжей было продемонстрировано на примере мутации pms1 гена, который кодирует ПМ Са2-АТФазу, находящуюся в дрожжевой тонопластной мембране. Ca -АТФаза, обнаруженная в клетках дрожжей Schizosaccharomyces pombe [40, 41], кодируется геном cta3 и во многом напоминает ЭПР Ca -АТФазные гены млекопитающих. В результате экспериментов, проведенных в условиях задерживания вакуолярного поглощения Ca , а также при использовании протонофора для разобщения протонового градиента и стимуляции проницаемости плазматической мембраны (с использованием нистатина), удалось установить, что белок гена cta3 является невакуолярным внутренним кальциевым каналом, зависящим от АТФ. Остаточное АТФ-зависимое поглощение Ca2+ наблюдалось у нулевого мутанта cta3, что предполагает существование другой невакуолярной Ca -АТФазы [42]. У микромицетов Ca -переносящая АТФаза была обнаружена в плазматической мембране [34].
Другой важный тип переносчиков Са2+ за пределы клетки - это Са2+-/пН+-антипортеры, которые являются вторичными транспортировщиками, не требующими АТФ. Они активизируются за счет протонового градиента, который вырабатывается Н+-АТФазами [12, 23]. Антипортные транспортеры Са2/Н+, находящиеся в плазматической мембране, индуцируют выход Са из цитозоля в обмен на Н+.
Показано, что у микромицетов, у которых главным хранилищем Са2+ являются вакуоли [43], высвобождение избыточного Са происходит через вакуо-лярные мембраны за счет Са +-/пН+-антипортной системы, приводимой в действие протонным градиентом, создающимся в результате действия Н+-АТФазы вакуолярной мембраны [44, 45]. Как показано на мутантах дрожжей & сerevisiae, у которых отсутствует функциональный ген для вакуолярной Н+-АТФазы, они не способны контролировать концентрацию Са2+ [46], что свидетельствует о важности поддержания протонового градиента и о значимости вакуоли как Са -депо. Особое внимание уделяется значению вакуоли для гомеостаза Са , так как функционирование вакуоли позволяет микромицетам расти в среде при концентрации СаСЬ до 100 мМ [46].
У дрожжевых организмов также обнаружен Са2-насос, ассоциированный с комплексом Гольджи, который кодируется ртг1 геном, способствующим транспортировке Са в аппарат Гольджи для выполнения специфических секреторных функций [47]. Постоянная концентрация Са2+ в ЭПР у Saccharomyces cerevisiae была установлена в размере 10 мкМ. У мутантов, не имеющих гена ртг1, который, как известно, кодирует насос Гольджи, обнаружен значительно сниженный уровень Са2+ в ЭПР, что свидетельствует по крайней мере о частичном контролировании насосом концентрации Са2+ в ЭПР дрожжей [48]. Было также показано, что выход кальция из ЭПР клеток дрожжей осуществляется путем активизации сигнального пути с участием 1ге1р и Нас1р. Когда концентрация кальция в ЭПР уменьшается, происходит увеличение притока Са2+ через плазматическую мембрану через СсЫр-М1^р Са2-каналы [49]. Показано, что у РепШПтт notatum в ЭПР, аппарате Гольджи, вакуолях и компонентах плазматической мембраны концентрация Са2+ низкая, а основным депо свободных ионов Са у этих плесневых грибков являются митохондрии [50].
3. Кальцийсвязывающие белки эукариотных клеток
Клетки обладают огромным количеством разнообразных белков, связывающих Са2+, которые либо способствуют процессу кальциевой сигнализации посредством буферирования свободных ионов кальция, таким образом формируя ответ клетки, либо исполняют роль сенсоров, которые передают сигнальную функцию Са2+ [24]. Большинство белков связывают Са2+ с помощью шести или семи атомов кислорода, имеющихся в аминоостатках глутамата или аспартата. Другой чертой, характерной для связывающих кальций белков, является наличие вторичной структуры, так называемой ББ-структуры, которая включает две а-спирали, расположенные таким образом, что имеют вид указательного и большого пальцев правой руки. Между а-спиралями находится Са -связывающая петля, которая содержит активные остатки Са2-связывающего глутамата и аспартата [21].
Са2-связывающие белки условно делятся на две группы: растворимые (немембранные) белки и интегральные мембранные белки [11]. Последние связывают ионы Са на одной стороне плазматической мембраны или мембраны клеточной органеллы, переносят их через нее, возвращаются обратно, и цикл возобновляется. В ряду растворимых белков выделяют две категории, первая из которых может выступать только в роли буфера, связывая Са для поддержания его низкой концентрации в цитозоле. Вторая категория белков не только служит буфером, но также может, изменяя свою структуру, взаимодействовать с ферментами и тем самым способствовать передаче сигналов. Поэтому эти белки также называют Са2-модулирующими. Одним из наиболее важных белков этой группы является первичный внутриклеточный Са -связывающий белок КМ.
КМ - это небольшой кислый белок, который у многих клеток может связывать 4 молекулы кальция, хотя в клетках дрожжей в период их почкования он может связывать только 3 молекулы [51]. Его сродство с Са составляет приблизительно 10 моль/л. Молекула белка по форме напоминает колокол и имеет две глобулярные области, соединенные длинной гибкой и очень подвижной а-спиралью. Как показали авторы [51], в каждой из этих шаровидных областей выделяются два EF-отдела, состоящие из двух спиралей с петлей между ними, каждая из которых может связываться с одной молекулой Са2+. Несмотря на то что эти две EF-структуры связаны внутри каждой шаровидной области коротким непараллельным Р-слоем и во многом сходны, их сродство с Са2+ различно. По данным [52], С-конец домена имеет такое высокое сродство с кальцием, которое приводит к важным изменениям в структуре молекулы. В результате этих структурных изменений проявляются гидрофобные бляшки, по одной в каждой молекуле. Эти бляшки затем взаимодействуют с КМ-стимулирован-ными белками, такими, как киназы, фосфатазы, аденилатциклазы, фосфодиэ-стеразы и Са2-АТФазы. Сродство комплекса Са2-КМ с данными белками на 4 порядка выше, чем самого Са2+.
КМ участвует в качестве посредника в большом количестве сигнальных систем. Иногда он составляет неотъемлемую часть ферментного комплекса. Совместно с цАМФ кальмодулин может активировать и аденилатциклазу, которая отвечает за синтез цАМФ, и Ca -/КМ-фосфодиэстеразу, что приводит к расщеплению цАМФ. В клетках дрожжей этот белок участвует в выполнении важных функций, таких, как разрастание клеток, контролирование клеточного цикла и деление ядра [44]. КМ обнаружен также у многих видов микромицетов, в том числе в клетках S. cerevisiae, S. pombe, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Candida albicans и Coprinus cinereus [10, 15, 53-56]. По Са2+ -связывающим свойствам КМ Neurospora crassa невозможно отличить от КМ клеток позвоночных, хотя у микромицета этот белок менее кислый, чем в клетках животных, и его аминокислотный состав напоминает состав этого фермента у растений [53].
Итак, белки, связывающие и транспортирующие Са2+, выполняют важнейшие для жизнедеятельности клетки функции, изолируя и удаляя из цитозоля ионы Са , токсичные для клетки в высоких концентрациях.
Табл. 1
Участие Са2+ в регуляции различных физиологических процессов у микромицетов
Виды Процессы с участием Са2+ Ссылки
Aspergillus nidulans Клеточный цикл [57]
A. fumigatus Гиперветвление [58]
Botrytis cinerea Разветвление и рост гиф микромицетов (фитопаразитизм) [59]
Paracoccidioides brasiliensis Диморфизм [60]
Fusarium graminearum Растяжение [61]
Magnaporthe oryzae Формация аппрессория [62]
Microsporum gypseum Фосфоролипидный синтез [63]
Neurospora crassa Доминирование верхушки Цикадный ритм Конидиальное развитие Разветвление гиф [64-66]
Penicillium notatum, Penicillium sp. Индукция конидиации [27, 67]
Sporothrix schenckii Прорастание спор [68]
4. Регуляторная роль Са2+ в передаче сигналов
Как уже было сказано, кальций играет важную роль в передаче ответа на сигнал внутри клетки и участвует в процессе распространения сигнала и его усиления. Имеются сведения, что кальций регулирует многие важные процессы у микромицетов (табл. 1), хотя мало что известно о конкретных этапах процесса передачи сигналов и их последовательности.
В настоящее время существует несколько методов измерения кальция в живых клетках: с помощью микроэлектродов, реагирующих на кальций, с помощью флуоресцентных красителей или люминесцентных. Каждый из этих методов имеет свои преимущества [69, 70].
При измерении Са микроэлектродами в цитоплазму отдельной клетки вводят два микроэлектрода: один - чувствительный к кальцию, другой - эталонный, которые могут быть объединены в один двуствольный микроэлектрод [70]. Этот метод использовался для анализа гомеостаза Са2+ в гифах Neurospora crassa [43], но не получил широкого применения для микромицетов из-за технических трудностей. Использование флуоресцентных красителей для измерения концентрации Са в гифах микромицетов связано со следующими трудностями: введением в клетку красителей и изоляцией красящих веществ в органеллах [71-73]. Другими проблемами, возникающими в этой связи, являются избирательность цве-тообесцвечивания между другими двухвалентными катионами, такими, как Мп2+, Бе2+, 2п2+, Со2+, №2+ и Mg2+, и введение красителей, которое иногда происходит очень медленно [74].
5. Использование экворина для измерения кальция в цитозоле эукариотных клеток
Наиболее эффективный подход к измерению содержания Са2+ в цитозоле связан с использованием Са -чувствительных фотобелков, например таких, как экворин, обелин [74]. Ранее экворин широко использовался в животных и растительных клетках [75] и лишь недавно нашел применение при исследовании Са в клетках микромицетов [76]. Экворин имеет несколько преимуществ по сравнению с другими белковыми молекулами, используемыми для измерения концентрации Ca +.
1. Не токсичен для клеток и не мешает выполнению Са2-зависимых функций.
2. pH в физиологической области (6.6-7.4) не оказывает значительного влияния на чувствительность экворина к кальцию [74].
3. Белок позволяет проводить измерение свободных ионов кальция в пределах от 0.1 до 100 мкМ и от 0.3 до 300 мкМ в клетках пресноводных и морских эукариот соответственно. Такой широкий динамический диапазон экворина очень важен, так как колебания в концентрации Ca2+ и Са2-градиент между цитоплазмой и внешней средой in vivo очень велик.
4. Экворин имеет сверхнизкий фоновый сигнал, поскольку аутолюминес-ценция из клеток и тканей практически отсутствует, и единственные фоновые сигналы поступают исключительно от инструментов [77]. Известно, что экворин представляет собой Са2-чувствительный фотобелок медузы Aequorea victoria с молекулярной массой 21400 [78], состоящий из одной полипептидной цепи, апоэкворина, гидрофобного люминофора, селентразина и связанного кислорода [79]. Как только ионы кальция присоединяются к двум из трех кальцийсвязы-вающих сайтов в молекуле экворина, белок превращается в оксигеназу. Последняя катализирует окисление субстратного селентразина с помощью связанного кислорода, что приводит к излучению голубого света (Amax = 470 нм), интенсивность которого зависит от концентрации свободных ионов кальция (рис. 3). Таким образом, экворин, введенный в клетку, позволяет проводить наиболее точные измерения концентрации Са в цитозоле. Экворин состоит из 189 аминокислот и имеет три EF-структуры, характерные для Са2-связывающих сайтов. Кроме того, он имеет гидрофобные участки, которые могут взаимодействовать с селентразином [80]. Нативный экворин состоит из девяти различных молекулярных форм (изоэкворинов), которые обозначаются как экворин A-H. Константы относительного веса, светоизлучения и скорости реакции первого порядка у этих изоформ несколько различны. Наиболее чувствительным из них считается экворин-D [81].
Свойства экворина также могут быть изменены при помощи различных синтетических аналогов селентразина. Такой экворин называется полусинтетическим. Например, применение cp-, f- или й-селентразина приводит к образованию экворин-репортера в 10-20 раз более чувствительного к Са2+, чем апоэкворин, реконструированный с помощью нативного селентразина. Нср-селентразин имеет такие ценные свойства, как быстрая реакция на связывание Са2+ и наиболее высокий квантовый выход по сравнению со всеми имеющимися аналогами.
Селектразин
Рис. 3. Схематичная иллюстрация светоизлучения и регенерации экворина [82]
Слабая чувствительность к Са2+ у «-селентразина позволяет использовать его для измерения высоких концентраций кальция. Реконструкция экворина с е-се-лентразином дает полусинтетический экворин с бимодальным спектром световой эмиссии (рис. 3). Это обеспечивает более простой способ измерения количества Ca2+ in vivo с использованием отношений светоизлучения 2 длин волн. При таком подходе нет необходимости в получении информации об уровнях экспрессии рекомбинантного экворина, о реконструкции или потреблении экворина, которая обычно требуется для калибровки экворином [83].
Ген экворина был получен в результате клонирования и генной инженерии, что позволило ему экспрессироваться в различных организмах [80, 84]. В зависимости от используемого промотора экворин может экспрессироваться во всех или только в определенных клетках организма. Рекомбинантный экворин может быть экспрессирован в различных органеллах и уже использовался для измерения Ca2+ в ядре, ЭПР, митохондриях, вакуоле и хлоропластах [85]. По мнению авторов, основным недостатком использования экворина по сравнению с флуоресцентными красителями является то, что из-за низкого квантового выхода его света микроскопическое изображение люминесценции и измерение концентрации Са2+ на субклеточном уровне обычно не возможно.
Микроинъекции экворина широко использовались для измерения Ca в животных и растительных клетках [86, 87]. Для проведения такой процедуры требуется экворин высокой степени очистки, и, что важно отметить, в ходе эксперимента могут травмироваться клетки. Клонирование и выявление характеристик двух генов апоэкворина - AQ440 [66] и AEQ1 [84] - привело к созданию новой технологии использования рекомбинантного экворина для измерения концентрации Ca . Этот подход применяется в настоящее время для измерения количества ионов кальция в растениях [83] и различных клеточных культурах млекопитающих [88, 85]. Инкубация трансгенных организмов с селентразином позволяет создать функциональный экворин в цитозоле клеток, что приводит к появлению светящихся трансгенных организмов, свет, излучаемый которыми, свидетельствует о наличии Ca2+ [73].
Табл. 2
Исследование кальциевых сигнальных систем у дрожжевых культур с использованием рекомбинантного экворина
Предмет исследования Организмы Ссылки
Экспрессия экворина в дрожжевых культурах X cerevisiae [78]
Внутриклеточный Са2+ и Са2-потоки 8. cerevisiae [89, 90]
Гипоосмотический шок 8. cerevisiae [36]
Щелочной шок 8. cerevisiae [91]
Митохондриальный Са2+ 8. cerevisiae [92, 93]
6. Использование рекомбинантного экворина в исследованиях кальциевого ответа микромицетов на физико-химические воздействия
С начала 90-х годов XX в. был проведен ряд исследований кальциевых сигнальных систем у растений и животных, в ходе которых использовался ре-комбинантный экворин. По сравнению с многочисленными исследованиями растительных и животных клеток лишь незначительное число работ посвящено исследованию Са -сигнальной системы у микромицетов. Работы на микроми-цетах проводились в основном с использованием дрожжевых культур. Некоторые данные из этих исследований приведены в табл. 2.
Было установлено, что экворин в дрожжевой культуре ^ cerevisiae может экспрессироваться под контролем ОЛЫ-промотора [78], причем клетки накапливают достаточно большое количество экворина, позволяющее выявить Са2-сигнал. Применение этой системы показало, что обработка а-клеток ^ сerevisiae ферамоном (а-фактором) вызывала внеклеточную Са -зависимую люминесценцию только в клетках противоположного типа. Было подсчитано, что максимальное увеличение концентрации Са составляет 590 ± 200 нМ и происходит через 45-50 мин после добавления а-фактора. Другим использованным в работе стимулом было добавление глюкозы в клетки, испытывающие в ней дефицит. Это стимулировало Са -ответ с максимальной амплитудой 340 ± 4 нМ, который проявлялся через 2 мин после внесения глюкозы [89].
С помощью рекомбинантного экворина также было показано, что гипоос-мотический шок в размножающейся дрожжевой культуре почти сразу вызывает вспышку концентрации Са2+ от исходного значения, равного 200 нМ, до пиковой концентрации в 1100 нМ. Установлено, что при такой вспышке Са2+ поступает в клетку как из внутренних резервуаров, так и из внешних среды. Сначала происходит выброс Са2+ из внутренних резервуаров, который затем подкрепляется активацией каналов плазматической мембраны, реагирующих на растяжение. Изотонический шок не вызывает увеличения концентрации Са [36].
Первая попытка трансформировать микромицеты с помощью гена нативного апоэкворина была осуществлена на клетках Neurospora сганиа. Уровень экспрессии был очень низким, приблизительно в 365 раз ниже, чем в трансгенных культурах МсоНапа plumbaginifolia. На основании этого было высказано предположение, что блокирование экспрессии апоэкворина происходит на стадии трансляции или после нее. Затем было обнаружено, что нативный ген апоэкворина
содержит 44 кодона, редко встречающиеся в N. crassa, и только один редкий кодон, выявленный у N. plumbaginifolia. Исходя из полученных результатов было сделано предположение, что кодоновая склонность является наиболее вероятной причиной низкого уровня экспрессии экворина [76]. Кодоновая склонность может встречаться у любой аминокислоты, потому что они могут кодироваться несколькими кодонами. Выбор кодонов коррелирует с большим количеством соответствующего тРНК. У высоко экспрессируемых генов преобладание кодонов более выражено, чем у генов с низкой экспрессией. Для решения этой проблемы был разработан и получен синтетический ген апоэкворина (aeqS) с оптимизированным кодоном, используемым для экспрессии в Aspergillus и Neurospora. Этот синтетический ген вызывал увеличение уровня экспрессии апоэкворина в N. crassa в 5-105 раз в сравнении с нативным геном. Позднее вектор экспрессии (pAEQ1-15), удерживающий этот ген под контролем промотора конститутивной глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, использовался для трансформации A. niger и A. awamori. Высокий уровень экспрессии апоэкворина был достигнут и с помощью преинкубации трансгенного микромицета с люми-нофорным селентразином, в результате чего был получен активный экворин. Применение этого метода позволило обнаружить появление внутриклеточных Ca -вспышек в ответ на высокую концентрацию внеклеточных ионов кальция на изменения внеклеточного pH, на гипоосмотические стимулы и механическое воздействие [76]. При помощи экворина с оптимизированным кодоном было трансформировано несколько других организмов. Наиболее успешной была трансформация A. nidulans и фитопатогена Phyllosticta ampelicida [86].
Для исследования сигнальных систем животных клеток использовалось большое разнообразие фармакологических ингибиторов, некоторые из которых обладали высокой селективностью действия и способностью блокировать конкретные пути передачи сигналов, в то время как другие этого сделать не могли. Более того, селективная способность практически всех таких соединений по отношению к клеткам растений и микромицетов обычно снижена. Это указывает на необходимость соблюдения осторожности при интерпретации результатов, полученных с помощью фармакологических агентов, если они применялись в исследованиях на микромицетах. Основные работы такого рода, при проведении которых использовались Ca -модулирующие фармакологические агенты, представлены в табл. 3 и 4.
Зачастую концентрация соединений, используемых для достижения эффекта блокирования Ca -вспышек на микромицетах, была намного выше, чем в растительных клетках. В связи с этим возникает вопрос о фактической специфичности наблюдаемого процесса торможения. Например, показано, что La3+ (ингибитор кальциевых каналов) вызывает деполяризацию мембраны также за счет несвязанных с кальцием процессов [99]. Вместе с тем обработка клеток микромицетов Ca^-модулирующими агентами при прямом подсчете [Ca2]c с помощью рекомбинантного экворина позволяет получать результаты с большей точностью, поскольку параметры Ca^-профилей, характерные для различных сигнальных путей (например, скорость повышения и снижения концентрации Ca2+ и ее амплитуда), легче анализируются.
Табл. 3
Агонисты кальциевых сигнальных систем, используемые в исследованиях на микро-мицетах
Препарат Селективность агониста Организмы Процессы, подвергающиеся воздействию Ссылки
A23187 Са2+-избирательный ионофор Pénicillium notatum Выброс Са2+ из митохондрий [27]
Neurospora crassa Повышение скорости прорастания спор и разветвления гиф [39, 94]
Fusarium oxysporium Стимуляция выработки липазы [95]
Кофеин Вызывает выброс Са2+ из внутренних кальциевых резервуаров Микромицеты, вызывающие гниение древесины Ингибирование роста [96]
ЦПК1 Ингибирует Са2+-АТФазы в обратном направлении, что приводит к заполнению внутренних резервуаров Са2+ Saccharomyces cerevisiae Neurospora crassa Ингибирование разрастания колоний микромицета Расширение гиф и их гиперветвление [97] [98]
Табл. 4
Некоторые антагонисты, используемые в исследованиях кальциевых сигнальных систем у микромицетов
Препарат Избирательное действие ингибитора Организмы Ингибируемый процесс Ссылки
BAPTA Хелирует Са2+ S. cerevisiae Гипоосмотический шок [36]
Цинари-зин Ингибирует активность кальциевых каналов Fusarium graminearum Разветвление гиф [61]
Gd3+ Ингибирует активность кальциевых каналов S. cerevisiae Гипоосмотический шок [36]
La3+ Ингибирует активность кальциевых каналов Neurospora crassa Приток Са2+ [99, 100]
Нифе-дипин Ингибирует активность Са2+-каналов Ь-типа Fusarium graminearum, Botrytis cinerea Разветвление гиф [59, 61]
Верапа-мил Ингибирует активность Са2+-каналов Ь-типа Neurospora crassa, Botrytis cinerea Разветвление и рост гиф [59, 101]
W-52 Антагонист КМ, ингибирует КМ-за-висимую фосфодиэ-стеразу Zoophthora radicans Формирование апре-ссория [102]
1 Циклопиазоновая кислота.
2
N-(6-Аминогексил)-1 -нафталенсульфонамид.
Единственным пока известным ингибитором Са2-каналов, специфичным для микромицетов, является KP4. Это токсиноубийца, продуцируемый Ustilago maydis, который в природе эффективен прежде всего против представителей семейства Ustilaginaceae [103]. На примере U. maydis показано, что KP4 действует аналогично кальциевым хелаторам (ЭГТА) и ингибитору Са -канала Cd [104]. Поскольку KP4 препятствовал поступлению в Ustilago изотопа Са , было высказано предположение, что KP4 блокирует кальциевые каналы микромице-тов. Интересно отметить, что KP4 был эффективен при концентрации 0.33 мкМ, а для достижения такого же уровня блокировки с помощью ЭГТА требуется его миллимолярная концентрация. Такая разница в эффективности, вероятно, связана с тем, что KP4 выбирает мишенью именно Са -каналы, тогда как ЭГТА приходится хелировать все ионы кальция, присутствующие в питательной среде. Установлено также, что KP4 эффективно блокирует потенциалзависимые кальциевые каналы в нейронах млекопитающих [105].
Резюмируя изложенные данные литературы, можно заключить, что до недавнего времени не существовало удобного метода для измерения микроконцентраций Са в цитозоле живых клеток микромицетов, хотя имеющаяся информация доказывает, что Са играет важную роль в регуляции жизнедеятельности этих эукариотных микроорганизмов. Использование метода рекомбинантного экво-рина в качестве эффективного инструмента для фундаментального изучения пула свободных ионов кальция у микромицетов и изменения их концентрации в ответ на внешние воздействия позволит получить новую информацию о функционировании Са -сигнальных систем. В связи с этим в настоящей работе представлены некоторые наши экспериментальные данные, полученные в ходе исследований кальциевых ответов мицелиальных грибов на внешние воздействия, которые были определены методом рекомбинантного экворина.
7. Использование рекомбинантного экворина для измерения кальциевого ответа микромицета Aspergillus ан>атоп на внешние воздействия
В наших исследованиях [106] был проведен анализ результатов воздействия различных стимулов на содержание кальция в клетках Aspergillus awamori, трансформированных с помощью синтетического экворина с оптимизированным кодоном. Высокая степень экспрессии экворина в клетках A. awamori позволила эффективно измерять незначительные изменения концентрации Са . Микро-мицет A. awamori подвергали механическому воздействию (перемешивание), существенному увеличению концентрации внеклеточного СаС12 и гипоосмоти-ческому шоку. Кальциевый ответ микромицета на каждый стимул имел свою характерную особенность, которая выражалась в уникальном сочетании четырех факторов: лаг-периода, времени подъема, амплитуды и продолжительности ответа в момент, когда амплитуда равнялась половине максимальной. Реакция клеток на каждый вид воздействия была мгновенной. Время подъема содержания кальция менялось в зависимости от воздействующего стимула. Наибольшие вариации времени подъема наблюдались в случае стимуляции клеток экзогенным СаС12 в концентрации 0.05 мМ. Амплитуды и продолжительность Са2 -ответов были различными при всех видах воздействия. Кальциевые вспышки
в ответ на все примененные виды стимуляции были очень короткими, и содержание Са2+ в гифах восстанавливалось в течение нескольких минут.
Анализ кальциевых резервуаров, пополняющих уровень Са в клетках мик-ромицета во время каждой Са2-вспышки, был произведен с помощью ряда коммерчески доступных фармакологических ингибиторов, обладающих известным механизмом избирательного действия, а также при использовании КР4-ингибитора.
Важно подчеркнуть, что механизмы действия почти всех фармакологических ингибиторов были изучены на клетках животных. Многие из них использовались также в работах с растительными клетками [23], но у растений эффективные концентрации ингибиторов кальциевых каналов были, как правило, значительно выше, чем у животных клеток, а в экспериментах на клетках микроми-цета они были выше, чем на клетках растений. В связи с этим возникает вопрос о фактической селективности данных ингибиторов по отношению к микроми-цетам и растениям. Следует также помнить о том, что в клетках микромицетов и растений мишени для данных ингибиторов могут либо полностью отсутствовать, либо иметь отличную структуру, которая не позволяет Са2-антагонисту связываться с ними.
Результаты экспериментов, приведенные в табл. 5, показывают, что из шести исследованных коммерчески доступных антагонистов (кроме КР4) только два (Ьа и ВАРТА) ингибировали Са -ответы на воздействие физико-химическими стимулами. Особый интерес представляли данные, характеризующие влияние КР4 на функционирование Са2-каналов, так как именно он является единственно известным блокатором Са -каналов, который продуцируется мик-ромицетом [105]. Интересно отметить в этой связи, что показатели 1С50 для КР4 выражаются в мкМ, а 1С50 для ЬаС13 - в мМ. Представляется вполне вероятным, что КР4 имеет большую специфичность для Са -каналов микромицетов, чем ЬаС13. На основании полученных данных можно заключить, что важнейшим источником повышения концентрации внутриклеточного Са2+ в ответ на механическое воздействие, гипоосмотический шок и стимулирование внеклеточным СаС12 является транспорт Са2+ из внешней среды через цитоплазматическую мембрану микромицета, ввиду того что ЬаС13 эффективно ингибировал Са2-каналы Ь-типа, локализованные в плазматической мембране клеток, а препарат ВАРТА изменял концентрацию внеклеточного Са2+ путем его хелирования. Что касается КР4, точная степень специфичности его воздействия пока не известна. Вместе с тем установлено, что это вещество действует аналогично кальциевым хелаторам (ЭГТА) и - ингибитору Са2-каналов [107], то есть препятствует проникновению в цитозоль внеклеточного Са2+.
В доступной литературе нет сведений относительно того, что внутриклеточные резервуары Са2+ играют важную роль в развитии кальциевого ответа у А. ам>атоп на физико-химические воздействия. Частично это подтверждается данными литературы: рианодин, вызывающий выход Са из внутриклеточных органелл, и ТМВ-8, ингибирующий выброс Са2+ из внутренних резервуаров, не оказывали влияния на формирование Са2-ответа [108]. Тем не менее к этим результатам следует подходить с осторожностью, поскольку рианодин, ТМВ-8, нифедипин и верапамил могут не являться эффективными модуляторами Са2+
Табл. 5
Влияние ингибиторов Са2 -транспорта на концентрацию кальция в цитозоле А. ам>ашвг1 при стрессорных воздействиях
Препарат Избирательное действие ингибитора 1С50, мМ*
ВАРТА [1,2-бис-(^-мино-5-броифе-нокси) этан-М,М,М,М-тетрааце-тиловая кислота] Хелирует, связывает ионы Са2+, которые становятся недоступными клетке Внеклеточный кальций Механический стимул Гипоосмо-тический шок
Нифедипин (из группы дигид- ропиринов) Ингибирует выброс Са2+ из внутренних резервуаров Са2+ НКП*** 0.5-5.0 0.5-5.0
Верапамил (гидрохлорид) Вызывает выход Са2+ из внутриклеточных органелл - - -
Хлорид ланатана (ЬаС13 ■ 7Н20) Блокатор Са2+-каналов Ь-типа
КР4 10-14 _** 10-14
Примечание. Результаты - среднее из 5 измерений.
* 1С50 - концентрация, вызывающая снижение уровня внутриклеточного Са2+ на 50% от максимального уровня в контроле (без ингибитора).
** Не ингибирует.
*** Некорректное применение.
у А. ам>ашоп. Следует также учитывать, что Са2-каналы, на которые они нацелены, могут и не участвовать в формировании Са -ответа на механическое воздействие, гипоосмотический шок и стимуляцию экзогенным СаС12.
Избирательность действия Ьа3+, который ингибировал Са2+-ответ на гипоосмотический шок и внесение экзогенного СаС12, нуждается в проверке. Согласно данным [99], Ьа3+ вызывает деполяризацию плазматической мембраны в клетках Neurospora сгаъъа, что может оказывать влияние на поток Са2+ в цитоплазму. При стимуляции клеточного ответа экзогенным СаС12 в низких концентрациях (0.1 и 0.5 мМ) ЬаС13 (5 мМ) индуцировал увеличение амплитуды кальциевой вспышки. При более высокой концентрации СаС12 (5 мМ) ЬаС13 в тех же дозах (5 мМ) вызывал уменьшение амплитуды кальциевой вспышки. Вероятно, это объясняется тем, что при низких концентрациях СаС12, побочные эффекты Ьа3+, вызываемые деполяризацией мембраны, более выражены, чем при увеличенных в 10-50 раз концентрациях СаС12. Данные по кинетике изменений кальциевых вспышек у микромицета свидетельствуют о сложном характере действия Ьа3+ на клетки. Это выражается в том, что Ьа3+ не только уменьшает амплитуду клеточного ответа, но при концентрации 20 мМ также вызывает вторичную Са2+-вспышку, соответствующую выходу Са2+ из клеточных органелл, и при любой концентрации, превышающей 5 мМ, приводит к увеличению конечного уровня содержания Са в отличие от нормы. Отмеченное выше воздействие Ьа согласуется с эффектом подавления активности Са2+-АТФазы, которая отвечает за транспорт Са2+ из цитозоля. В животных клетках Ьа3+, как известно, препятствует
Табл. 6
Влияние препаратов-агонистов на динамику внутриклеточного Са2+ у А. ам>атоп при механическом воздействии на клетки
Са2+-агонист Механизм действия Увеличение концентрации Са2+ Минимальная эффективная концентрация
А23187 (кальцимицин) Са2+-избирательный ионофор + 1 мкМ
Кофеин Вызывает выброс Са2+ из внутренних резервуаров (плазматического ретику-лума) + 5 мМ
ЦПК (циклопиа-зоновая кислота, выделенная из клеток РвтсИНит сус1оршт) Ингибирует Са2+-АТФазы в обратном направлении, что приводит к наполнению внутренних резервуаров Са2+ + 20 мкМ
формированию фосфорилированного посредника Са2+-АТФазы ЭПР-типа [12]. Интересно отметить, что побочные эффекты добавления ЬаС13, то есть увеличение уровня Са в отличие от нормы и вторичная Са -вспышка, наблюдались при механическом воздействии. Это свидетельствует о том, что данные эффекты не связаны с активностью Ьа3+ как ингибитора кальциевых каналов.
Еще одним интересным моментом является тот факт, что Ьа и КР4 инги-бировали развитие кальциевого ответа как на гипоосмотический шок, так и на стимуляцию экзогенным СаС12, но не оказывали влияния в случае механического воздействия. Это указывает на то, что в развитии Са -ответа на гипоос-мотический шок и внесение экзогенного СаС12 участвуют совсем другие системы транспорта Са2+. Высказанное предположение подтверждается результатами наших исследований, полученных при воздействии на А. ам>атоп Са2 -агонистов [106] (табл. 6). Установлено, что кофеин, который стимулирует выход Са из внутриклеточных резервуаров, индуцировал снижение амплитуды кальциевой вспышки при механическом воздействии, но не в случае гипоосмо-тического шока или стимуляции экзогенным СаС12. На основании этого можно предположить, что в формировании кальциевого ответа на механические стимулы может частично участвовать выход ионов кальция из клеточных орга-нелл, чувствительных к действию кофеина.
Добавление в среду культивирования А. ам>атоп таких препаратов, как А23187, кофеин и ЦПК, вызывало увеличение концентрации Са в клетках микромицета. Особо следует отметить, что кальциевый ответ на воздействие этих агонистов был бифазным: первичный ответ, очень быстрый, являлся результатом механической стимуляции клеток микромицетов вследствие внесения препарата. В результате этого происходило поступление Са2+ в цитозоль из внешней среды и, возможно, также из клеточных органелл. Вторичный ответ был более продолжительным. В случае добавления кофеина вторая и третья Са2+-вспышки могли быть результатом выхода Са2+ из внутриклеточных резервуаров. Известно, что ЦПК ингибирует активность Са-АТФаз и, таким обра-
зом, препятствует поступлению Са2+ в клеточные органеллы, которые опустошаются при повышении концентрации Са2+ в цитозоле. Кофеин оказывает такое же действие, стимулируя выход Са из клеточных органелл А. аwamori. Эти данные свидетельствуют о наличии специального механизма для регуляции транспорта Са2+ из клеточных органелл А. аwamori в цитозоль.
А23187 является мобильным переносчиком ионов, который образует устойчивые комплексы с двухвалентными катионами [107]. Известно, что в клетках животных при концентрации в 10 мкМ А23187 стимулирует поступление Са в цитозоль из внешней среды [61, 107]. При стимулировании этим препаратом клеток микромицета в них наблюдались продолжительные периоды повышения концентрации Са +. Затем следовало восстановление до исходного уровня Са +, возможно, в результате прекращения действия А23187 или в результате активизации деятельности Са -АТФаз и Са2-/Н+-антипорта. Продолжительность Са -вспышек у микромицета в ответ на стимуляцию А23187 говорит о том, что клетки с трудом восстанавливают нормальный уровень концентрации Са . Поскольку А23187 имеет способность со временем образовывать нерастворимый осадок в жидкой среде [107], препарат мог локализоваться в клетках в большой концентрации и оказывать на них токсическое действие. Продолжительный Са -ответ мог быть результатом выхода экворина из мертвых клеток и его последующего взаимодействия с Са , присутствующим в питательной среде. Возвращение уровня Са2+ к норме может указывать на то, что клетки микромицета адаптировались к присутствию А23187 в среде роста. Важно отметить, что в конце Са -вспышки, вызванной действием А23187, в клетках оставалось еще много активного экворина, поэтому восстановление исходного уровня концентрации Са2+ в цитозоле нельзя объяснить недостаточным содержанияем активного экворина в клетках микромицета.
Кофеин, как известно, также выпадает в осадок в жидкой среде (как правило, через 1-3 ч). В связи с этим третья Са2-вспышка, наблюдавшаяся после добавления в среду роста кофеина, могла быть вызвана гибелью клеток, как и в случае действия А23187. Другим объяснением данного результата может быть тот факт, что в растительных клетках кофеин вызывает временную гиперполяризацию плазматической мембраны [108]. То же самое может происходить и в клетках микромицетов.
В случае применения ЦПК проблемы с восстановлением нормального уровня Са в гифах микромицета возникают в связи с подавлением активности Са2-АТФазы. Приблизительно через 5 ч после начала стимуляции восстановление исходного уровня Са2+ все-таки происходит, вероятно, благодаря восстановлению активности Са -/Н+-антипорта или Са -АТФазы. Поскольку ЦПК не выпадает в осадок в растворе, вторичный клеточный ответ на стимуляцию ЦПК, вероятно, развивается иначе, чем при воздействии А23187. Вторичная Са -вспышка при воздействии ЦПК достигала своего пика через 1 ч, после чего концентрация Са2+ начинала сразу же снижаться. В случае с А23187 интенсивность люминесценции достигала максимального пика приблизительно через 50 мин и оставалась на том же уровне свыше 1 ч. Это вновь дает основание предположить, что продолжительность вспышки, скорее всего, обусловлена гибелью клеток в результате выпадения А23187 в осадок с течением времени.
Влияние Са2+-агонистов так же, как и антагонистов, изучали в их сочетании с физико-химическими стимулами. Через 5 мин инкубации с кофеином наблюдалось повышение исходного уровня Ca в цитоплазме клеток. Однако после механического воздействия амплитуда клеточного ответа значительно снижалась. В противоположность этому ни гипоосмотический шок, ни высокая концентрация внеклеточного CaCl2 не изменяли амплитуды Ca -ответа. Этот факт указывает на то, что внутриклеточные хранилища Са2+, чувствительные к кофеину, могут играть определенную роль в Са -ответе клеток на механическое воздействие. Кальциевые резервуары, участвующие в Са -ответе на механическую стимуляцию, отличаются от резервуаров, участвующих в Са2 -ответе на два других физико-химических стимула. Восстановление уровня Ca происходило с задержкой после всех трех видов воздействия. Вторичный ответ клеток микромицета на внешнее воздействие наблюдался в случае стимулирования кофеином и полностью отсутствовал при сочетании воздействия кофеина и физико-химических стимулов.
В случае применения ЦПК совместно с физико-химическими стимулами исходный уровень Ca в клетках значительно повышался. Несмотря на это, Ca -ответы были приблизительно такими же (время подъема, амплитуда и продолжительность), как при воздействии отдельно физико-химическими стимулами. Хотя присутствие ЦПК истощило запасы кальция в зависящих от него клеточных органеллах, Ca^-ответ клеток на физико-химические воздействия был нормальным. Данные результаты подтверждают предположение, что основным источником повышения внутриклеточного пула Са в ответ на исследовавшиеся физико-химические виды воздействия (за исключением механического стимулирования) является поступление в клетки экзогенного Са2+.
Заключение
Резюмируя описанные результаты осцилляции ионов Са2+ в цитозоле мик-ромицета с использованием рекомбинантного фоточувстчительного белка экво-рина, можно сделать следующие заключения.
Три физико-химических стимула (механическое воздействие, гипоосмоти-ческий шок и внесение в среду высокой концентрации СаС12) индуцировали временное увеличение содержания Са2+ в клетках микромицета, и каждый из этих кальциевых ответов имел характерные особенности, которые выражались в уникальном сочетании времени подъема, лаг-периода, амплитуды и продолжительности ответа.
Источником Са для клеточных ответов на гипоосмотический шок, стимуляцию внеклеточным СаС12 и, возможно, на механическое воздействие является в основном внешняя среда. Внутриклеточные резервуары Са2+ также могут играть определенную роль в ответе клеток на механическую стимуляцию.
Из ряда исследованных Са + -ингибиторов только два (La + и препарат ВАРТА) эффективно ингибировали кальциевый ответ. Значения их показателей 1С50 находились в миллимолярном диапазоне, в то время как для ингибитора КР4, выделенного из клеток микромицета вида Ustilago, значения 1С50 находились в микромолярном диапазоне.
Стимуляция Са2-ответа с помощью таких Са2-агонистов, как А23187, кофеин и ЦПК, вызывала бифазный ответ клеток: первичная Са2-вспышка была результатом механического воздействия, вторичная - результатом действия агонистов.
Метод рекомбинантного экворина может рассматриваться как эффективный инструмент фундаментальных исследований функционирования Са2-сигналь-ных систем у микромицетов.
Summary
O.V. Kozlova, p.Yu. EgoroV, F.G. Kupriyanova-Ashina. Analysis of Calcium Signalling in Filamentous Fungi Using Recombinant Aequorin.
This article provides a review of data from literature sources and authors' research on Ca2+ signalling including the role of calcium in microbial, plant and animal cells, calcium fluxes and calcium modulating proteins, with the particular focus on the role of Ca2+ in filamentous fungi. The authors describe in detail the function of transient increases in intercellular calcium concentration in mediating the cellular response to external stimuli.
The research described in this article was carried out using a strain of Aspergillus awamori transformed with the recombinant aequorin gene to allow real-life measurements of cytosolic free calcium. It was demonstrated that physico-chemical stimuli caused transient increases in the intracellular Ca2+ concentration. Using a number of Ca2+ blockers and Ca2+ agonists, it was determined that these increases were caused by the influx of calcium ions rom the external environment as well as from calcium storage organelles. The main role in the elevation of Ca2+ concentration was attributed to the voltage gated calcium channels.
Key words: Ca2+ signalling, filamentous fungi, Aspergillus awamori, recombinant aequorin, Ca2+ dynamics.
Литература
1. Ткачук В.А. Фосфоинозитидный обмен и осцилляция ионов Са2+ // Биохимия. -1998. - Т. 63, Вып. 1 - С. 47-56.
2. Крутецкая З.Н., Лебедев О.Е. Механизмы внутриклеточной сигнализации. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. - 208 с.
3. Reddy A.S. Calcium: silver bullet in signaling // Plant Sci. - 2001. - V. 160, No 3. -P. 381-404.
4. Hepler P.K. Calcium: a central regulator of plant growth and development // Plant Cell. -2005. - V. 17. - P. 2142-2155.
5. Hetherington A.M., Brownlee C. The generation of Ca2+ signals in plants // Ann. Rev. Plant Biol. - 2004. - V. 55. - P. 401-427.
6. Berridge M.J., Bootman M.D., Roderick H.L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2003. - V. 4. - P. 517-529.
7. Berridge M.J. The AM and FM of calcium signalling // Nature. - 1997. - V. 386. -P. 759-760.
8. McAinsh M.R., Hetherington A.M. Encoding specificity in Са2+-signalling systems // Trends Plant Sci. - 1998. - V. 3. - P. 32-36.
9. Sanders D., Pelloux J., Brownle C. Calcium at the Crossroads of signaling // Plant Cell. -2002. - V. 14. - P. 401-417.
10. Gadd G.M. Signal transduction in fungi // The growing Fungus / Eds. N.A.R. Gow, G.M. Gadd. - London: Chapman and Hall. - 1995. - P. 183-210.
11. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis // Annu. Rev. Biochem. - 1987. - V. 56. -P. 395-433.
12. Bush D.S. Calcium regulation in plant cells and its role in signalling // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1995. - V. 46. - P. 95-122.
13. Gilroy S., Trewavas A. Signal processing and trasduction on plant cells: the end of the beginning? // Nat. Rev. - 2001. - V. 2. - P. 307-314.
14. Mazars C., Bourque S., Mithofer A., Pugin A., Ranjeva R. Calcium homeostasis in plant cell nuclei // New Phytol. - 2009. - V. 181, No 2. - P. 261-274.
15. Saporito S.M., Sypherd P.S. The isolation and characterization of a calmodulin-encoding gene (cmd-1) from the dimorphic fungus Candida albicans // Gene. - 1991. - V. 106. -P. 43-49.
16. Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signalling // J. Physiol. - 1997. -V. 499. - P. 291-306.
17. Bootman M.D., Cheek T.R., Moreton R.B., Bennett D.L., Berridge M.J. Smootly graded Ca2+ release from inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ stores // J. Biol. Chem. -1994. - V. 269, No 40. - P. 24783-24791.
18. Bootman M.D., Young K.W., Young J.M., Moreton R.B., Berridge M.J. Extracellular calcium concentration controls the frequency of intracellular calcium spiking independently of inositol 1,4,5-triphosphate production in HeLa cells // Biochem. J. - 1996. - V. 314. -P. 347-354.
19. Bootman M.D., Collins T.J., Peppiatt C.M., Prothero L.S., MacKenzie L., DeSmet P., TraversM., Tovey S.C., Seo J.T., Berridge M.J., Ciccolini F., Lipp P. Calcium signalling -an overview // Semin. Cell Dev. Biol. - 2001. - V. 12, No 1. - P. 3-10.
20. Bootman M.D., Holmes A.M., Roderick H.L. Calcium Signalling and Regulation of Cell Function // Encyclopedia of Life Sciences. - John Wiley & Sons, Inc., 2006. - URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0003957/abstract.
21. Hancock J.T. Intracellular calcium: its control and role as an intracellular signal // Hancock J.T. Cell signaling. - Harlow, England: Addison-Wesley Longman, 1977. - P. 144166.
22. Ishida A., Sueyoshi N., Shigeri Y., Kameshita I. Negative regulation of multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases: physiological and pharmacological significance of protein phosphatases // Br. J. Pharmacol. - 2008. - V. 154, No 4. - P. 729-740.
23. Johannes E., Brosnan J.M., Sanders D. Calcium channels and signal transduction in plant cells // Bioessays. - 1991. - V. 13. - P. 331-336.
24. Berridge M.J., Lipp P., Martin D. The versatility and universality of calcium signalling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2000. - V. 1, No 1. - P. 11-21.
25. Cunningham K.W., Fink G.R. Calcineurin inhibits VCXI-dependent H+/Ca2+exchange and induces Ca2+ ATPases in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell Biol. - 1996. -V. 16. - P. 2226-2237.
26. Nguyen Q.B., Kadotani N., Kasahara S., Tosa Y., Nakayashiki H. Systematic functional analysis of calcium-signalling proteins in the genome of the rice-blast fungus, Mag-naporthe oryzae, using a high-throughput RNA-silencing system // Mol. Microbiol. -2008. - V. 68, No 6. - P. 1348-1365.
27. Pitt D., Barnes J.C. Calcium homeostasis, signalling and protein-phosphorylation during calcium-induced conidiation in Penicillium notatum // J. Gen. Mycrobiol. - 1993. -V. 139, No 2. - P. 3053-3063.
28. Krystofova S., Varecka L., Betina V. Effects of agents affecting Ca2+ homeostasis on Trichoderma viride growth and conidiation // Folia Microbiologica. - 1996. - V. 41, No 1. - P. 249-253.
29. Hagiwara D., Kondo A., Fujioka T., Abe K. Functional analysis of C2H2 zinc finger transcription factor CrzA involved in calcium signaling in Aspergillus nidulans // Curr. Genet. - 2008. - V. 54, No 6. - P. 325-338.
30. Segarra V.A.., Thomas L. Topology mapping of the vacuolar Vcxlp Ca2+/H+ exchanger from Saccharomyces cerevisiae // Biochem. J. - 2008. - V. 414, No 1. - P. 133-141.
31. Dunn T., Gable K., Beeler T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles // J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269, No 10. - P. 7273-7278.
32. Hirschi K.D., Zhen R.G., Cunningham K.W., Rea P.A., Fink G.R. CAXI, an H+/Ca2+ antiporter from Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - P. 8782-8786.
33. Simkovic M., Krystofova S., Varecka L. Ca2+ fluxes in developing Trichoderma viride mycelium // Canad. J. Microbiol. - 2000. - V. 46. - P. 312-324.
34. Hernandez A., Cooke D.T., Clarkson D.T. Ca2+ ATPase - driven calcium accumulation in Ustilago maydis plasma membrane vesicles // Microbiol. - 1994. - V. 140. - P. 30473051.
35. Gelli A., Blumwald E. Calcium retrieval from vacuolar pools // Plant Physiol. - 1993. -V. 102. - P. 1139-1146.
36. Batiza A.F., Schulz T., Masson P.H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 23357-23362.
37. Fischer M., Schnell N., Chattaway J., Davies P., Dixon G., Sanders D. The Saccharomyces cerevisiae CCH1 gene is involved in calcium influx and mating // FEBS Lett. - 1997. -V. 419, No 2-3. - P. 259-262.
38. Teng J., Goto R., Iida K., Kojima I., Iida H. Ion-channel blocker sensitivity of voltage-gated calcium-channel homologue Cch1 in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. -2008. - V. 154, No 12. - P. 3775-3781.
39. Lew R.R., Abbas Z., Anderca M.I., Free S.J. Phenotype of a mechanosensitive channel mutant, mid-1, in a filamentous fungus, Neurospora crassa // Eukaryot Cell. - 2008. -V. 7, No 4. - P. 647-655.
40. Cunningham K.W., Fink G.R. Calcineurin-dependent growth control in Saccharomyces cerevisiae mutants lacking pmc1, a homolog of plasma memebrane Ca2+ ATPases // J. Cell Biol. - 1994 b. - V. 124, No 3. - P. 351-363.
41. Ghislain M., Goffeau A., Halachmi D., Eilam Y. Calcium homeostasis and transport are affected by distruption of cta 3, a novel gene encoding Ca2+-ATPase in Saccharomyces pombe // J. Biol. Chem. - 1990. - V. 265. - P. 18400-18407.
42. Halachmi D., Eilam Y. Elevated cytosolic free Ca2+ concentrations and massive Ca2+ accumulation within vacuoles, in yeast mutant lacking PMR1, a homolog of Ca2+-ATPase // FEBS Lett. - 1996. - V. 392. - P. 194-200.
43. Miller A.J., Vogg G., Sanders D. Cytosolic calcium homeostasis in fungi: roles of plasma membrane transport and intracellular sequestration of calcium // Proc. Natl. Acad. Sci. -1990. - V. 87. - P. 9348-9352.
44. Anraku Y., Ohya Y., Iida H. Cell cycle control by calcium and calmodulin in Saccharomyces cerevisiae // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - V. 1093. - P. 169-177.
45. Klionsky D.G., Herman P.K., Emr S.D. The fungal vacuole - composition, function and biogenesis // Microbiol. Rev. - 1990. - V. 54. - P. 266-292.
46. Ohya Y., Umemoto I., Ohta A., Iida H., Anraku Y. Calcium-sensitive cls mutants of Sac-charomyces cerevisiae showing a Pet phenotipe are ascribable to defects of vacuolar membrane H+-ATPase activity // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266. - P. 13971-13977.
47. Cunningham K.W., Fink G.R. Ca2+ transport in Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol. - 1994. - V. 196. - P. 157-166.
48. Strayle J., Pozzan T., Rudolph H. Steady-state free Ca2+ in the yeast endoplasmic reticulum reaches only 10 mM and is mainly controlled by the secretory pathway pump Pmrl // EMBO J. - 1999. - V. 18. - P. 4733-4743.
49. Bonilla M., Nastase K.K., Cunningham K.W. Essential role of calcineurin in response to endoplasmic reticulum stress // EMBO J. - 2002. - V. 21, No 10. - P. 2343-2353.
50. Pitt D., Barners J.C. Calcium-induced conidiation in Penicillium notatum // J. Gen. Microbiol. - 1999. - V. 139. - P. 3053-3063.
51. Luan Y., Matsuura I., Yazawa M. Yest calmodulin: structural and functional differences compared with vertabrate calmodulin // J. Biochem. - 1987. - V. 102. - P. 1531-1537.
52. Pietrobon D., Virgilio F.D., Pozzan T. Structural and functional aspects of calcium homeostasis in eukaryotic cells // Eur. J. Biochem. - 1990. - V. 194. - P. 599-662.
53. Cox J.A., Ferraz C., Demaille J.G., Perez R.O., Vantuinen D., Marme D. Calmodulin from Neurospora crassa - general properties and conformation changes // J. Biol. Chem. -1982. - V. 257. - P. 694-700.
54. Davis T.N., Urdea M.S., Masiarz F.R., Thorner J. Isolation of the yeast calmodulin gene -calmodulin is an essential protein // Cell. - 1986. - V. 47. - P. 423-431.
55. Takeda T., Yamamoto M. Analysis and in vivo disruption of the gene coding for calmodulin in Saccharomycespombe // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1987. - V. 84. - P. 3580-3584.
56. Kaneko K., Yamada Y., Sueyoshi N., Watanabe A., Asada Y., Kameshita I. Novel Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase expressed in actively growing mycelia of the basidiomycetous mushroom Coprinus cinereus // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. -V. 1790, No 1. - P. 71-79.
57. Kahl C.R., Means A.R. Regulation of cell cycle progression by calcium/calmodulin-dependent pathways // Endocr. Rev. - 2003. - V. 24, No 6. - P. 719-736.
58. Gow N.A.R., Miller P.F.P., Gooday G. W. Life at the apex: growth of the hiphal tip // J. Chem. Technol. Biotechnol. - 1992. - V. 56. - P. 217-219.
59. Hudecova D., Varecka L., Vollek V. Growth and morphogenesis of Botrytis cinerea. Effects of exogenous calcium ions, calcium channel blockers and cyclosporin A // Folia Microbiologica. - 1994. - V. 39. - P. 269-275.
60. Campos C.B., Di Benedette J.P., Morais F.V., Ovalle R., Nobrega M.P. Evidence for the role of calcineurin in morphogenesis and calcium homeostasis during mycelium-to-yeast dimorphism of Paracoccidioides brasiliensis // Eukaryot Cell. - 2008. - V. 7, No 10. -P. 1856-1864.
61. Robson G.D., Wiebe M.G., Trinci A.P. Involvement of Ca2+ in the regulation of hiphal extension and branching in Fusarium graminearum a-3/5 // Exp. Mycol. - 1991. - V. 15. -P. 263-272.
62. Choi J.H., Kim Y., Lee Y.H. Functional Analysis of MCNA, a Gene Encoding a Catalytic Subunit of Calcineurin, in the Rice Blast Fungus Magnaporthe oryzae // J. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - V. 19, No 1. - P. 11-16.
63. Giri S., Mago N., Bindra A., Khuller G.K. Possible role of calcium in phospholipid synthesis of Microsporum gypseum // Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - V. 1215. - P. 337-340.
64. Sadakane Y., Nakashima H. Light-induced phase shifting of the circadian conidiation rhytm is inhibited by calmodulin antagonists in Neurospora crassa // J. Biol. Rhytms. -1998. - V. 13. - P. 452-460.
65. Silverman-Gavrila L.B., Lew R.R. An IP3-activated Ca2+ channel regulates fungal tip growth // J. Cell Sci. - 2002. - V. 115, No 24. - P. 5013-5025.
66. Rao J.P., Reena G., Subramanyam C. Calmodulin-dependent protein phosphorilation during conidial germination and growth of Neurospora crassa // Mycol. Res. - 1997. -V. 101, No 12. - P. 1484-1488.
67. Roncal T., Ugalde U.O., Irastorza A. Calcium-induced conidiation in Penicillium cyclo-sporium: calcium triggers cytosolic alkalinization an the hyphal tip // J. Bacteriol. -1993. -V. 175. - P. 879-889.
68. Rivera-Rodrigues N., Rodriguez-Del Valle N. Effects of calcium ions on the germination of Sporothrix schenkii conidia // J. Med. Vet. Mycol. - 1992. - V. 30. - P. 185-195.
69. Parton R.M., ReadN.D. Calcium and imaging in living cells // Light Microscopy in Biolol-ogy / Ed. A.J. Lacey. - Oxford: Oxford Univ. Press, 1999. - P. 211-264.
70. Read N.D., Shacklock P.S., Knight M.R., Trewavas A.J. Imaging calcium dynamycs in living plant cells and tissues // Cell Biol. Int. - 1993. - V. 17. - P. 111-125.
71. Knight H., Trewavas A.J., Read N.D. Confocal microscopy of living fungal hyphae mi-croinjected with Ca2+-sensitive fluorescent dyes // Microbiol. Res. - 1993. - V. 97. -P. 1505-1515.
72. Read N.D., Allan W.T.G., Knight H, Knight M.R., Malho R., Russell A., Shacklock P.S., Trewavas A.J. Imaging and measurement of cytosolic free calcium in plant and fungal cells // J. Microbiol. - 1992. - V. 166. - P. 57-86.
73. Knight M.R., Read N.D., Campbell A.K., Trewavas A.J. Imaging calcium dynamics in living plants using semi-synthetic recombinant aequorins // J. Cell Biol. - 1993. - V. 121. -P. 83-90.
74. Cobbold P.H., Rink T.J. Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium // Biochem. J. - 1987. - V. 248. - P. 313-328.
75. Knight M.R., Smith S.M., Trewavas A.J. Wind-induced plant motion immediateli increases cytosolic calcium // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1992. - V. 89. - P. 4967-4971.
76. Nelson G, Kozlova-Zwinderman O., Collis A.J., KnightM.R., Fincham J.R., Stanger C.P., Renwick A., Hessing J.G., Punt P.J., van den Hondel C.A., Read N.D. Calcium measurement in living filamentous fungi expressing codon-optimized aequorin // Mol. Microbiol. -2004. - V. 52, No 5. - P. 1437-1450.
77. Miller A.J., Karplus E., Jaffe L.F. Imaging [Ca 2+]i with aequorin using protein imaging detector // Methods Cell. Biol. - 1994. - V. 40 - P. 305-338.
78. Nakajima-Shimada J., Lida H., Tsuji F.I., Anraku Y. Galactose-dependent expression of the recombinant Ca2+-binding photoprotein aequorin in yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1991. - V. 174. - P. 115-122.
79. Knight M.R., Campbell A.K., Smith S.M., Trewavas A.J. Recombinant aequorin as a probe for cytosolic free Ca2+ in Escherichia coli // FEBS Lett. - 1991. - V. 282. - P. 408-412.
80. Inouye S., Noguchi M., Sakaki Y., Takagi Y., Miyata T., Iwanaga S., Miyata T., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1985. - V. 82, No 10. - P. 3154-3158.
81. Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms of aequorin // Bio-chem. J. - 1986. - V. 234, No 2. - P. 271-277.
82. Shimomura O., Musicki B., Kishi Y. Semi-synthetic aequorin. An improved tool for the measurement of calcium ion concentration // Biochem. J. - 1988. - V. 251, No 2. -P. 405-410.
83. Shimomura O, Musicki B., Kishi Y., Inouye S. Light-emitting properties of recombinant semi-synthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium // Cell Calcium. - 1993. - V. 14, No 5. - P. 373-378.
84. Prasher D., McCann R.O., Cormier M.J. Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1985. - V. 126, No 3. - P. 1259-1268.
85. Rizzuto R., Drini M., Pizzo P., Murgia M., Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells // Current Biol. - 1995. -V. 5. - P. 635-642.
86. Campbell A.K., Trewavas A.J., Knight M.R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants // Cell Calcium. -1996. - V. 19, No 3. - P. 211-218.
87. Callaham D.A., Hepler P.K. Measurements of free calcium in plant cells // Cellular Calcium: A Practical Approach / Eds. J.G. McCormack, P.H. Cobbold. - Oxford: Oxford Univ. Press, 1991. - P. 383-412.
88. Kendall J.M., Badminton M.N., Salanewby G.B., Campbell A.K., Rembold C.M. Recombinant apoaequorin acting as a pseudoluciferase reports micromolar changes in the endo-plasmic-reticulum free Ca2+ of intact cells // Biochem. J. - 1996. - V. 318. - P. 383-387.
89. Nakajima-Shimada J., Tsuji F.I., Anraku Y. Monitoring of intacellular calcium in Sac-charomyces cerevisiae with an apoaequorin cdna expression system // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1991. - V. 88. - P. 6878-6882.
90. Cui J., Kaandorp J.A., Ositelu O.O., Beaudry V., Knight A., Nanfack Y.F., Cunningham K. W. Simulating calcium influx and free calcium concentrations in yeast // Cell Calcium. - 2009. - V. 45, No 2. - P. 123-132.
91. Viladevall L., Serrano R., Ruiz A., Domenech G., Giraldo J., Barcelö A., Arino J. Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279, No 42. - P. 43614-43624.
92. Jung D.W., Bradshaw P.C., Litsky M., Pfeiffer D.R. Ca2+ transport in mitochondria from yeast expressing recombinant aequorin // Anal. Biochem. - 2004. - V. 324, No 2. -P. 258-268.
93. Shaw B., ReadN.D., Turgeon B.G., Hoch H.C. Expression of recombinant aequorin as an intracellular calcium reporter in the phytopatogenic fungus Phyllosticta ampecilida // Fungal. Genet. Biol. - 2001. - V. 34, No 3. - P. 207-215.
94. Frazer L.N., Moore D. Antagonists and inhibitors of calcium accumulation do not impair perception though they adversely affect the gravity responses of Coprinus cinereus stipes // Mycolog. Res. - 1993. - V. 97. - P. 1113-1118.
95. Hoshino T., Mizutani A., Shimizu S., Hidaka P. Calcium-ion regulates the release of Fusarium oxysporium // J. Biochem. - 1991. - V. 110. - P. 457-461.
96. Arora D.S., Ohlan D. In vitro studies on antifungal activity of tea (Cammelia sinensis) and cofee (Coffea arabica) against wood-rotting fungi // J. Basic Microbiol. - 1997. -V. 37. - P. 159-165.
97. Okorokov L.A., Dos Santos Silva R., Kuranov A.Ju., Kuranova E.V. Ca2+-transporing ATPase(s) of the reticulum type in intracellular membranes of Saccharomyces cerevisiae: Biochemical identification // FEMS Microbiol. Lett. - 1997. - V. 146, No 1. -P. 39-46.
98. Silverman-Gavrila L.B., Lew R.R. Regulation of the tip-high Ca2+-gradient in growing hyphae of the fungus Neurospora crassa // Eur. J. Cell Biol. - 2001. - V. 80, No 6. -P. 379-390.
99. Corzo A., Sanders D. Inhibition of Ca2+ uptake in Neurospora crassa by La3+: a mechanistic study // J. Gen. Microbiol. - 1992. - V. 138, No 9. - P. 1791-1795.
100. Gibbon B.C., Kropf D.L. Cytosolic pH gradients associated with tip growth // Science. -1994. - V. 263. - P. 1419-1421.
101. Dicker J.W., Turian G. Calcium deficiencies and apical hyperbranching in wild-type and the "frost" and "spray" morphological mutants of Neurospora crassa // J. Gen. Microbiol. - 1990. - V. 136. - P. 1413-1420.
102. Magalhaes D.P., Wayne R., Humber R.A., Shields E.J., Roberts D.W. Calcium-regulated appressorium formation of the entomopathogenic fungus Zoophthora radicans // Protoplasma. - 1991. - V. 160. - P. 77-88.
103. Koltin K., Day R.P. Specificity of Ustilago maydis killer proteins // Appl. Microbiol. -1975. - V. 30. - P. 694-696.
104. Gage M.J., Bruenn J., Fischer M., Sander D., Smith T.J. KP4 fungal toxin inhibits growth in Ustilago maydis by bloking calcium uptake // Mol. Microbiol. - 2001. - V. 41. -P. 775-785.
105. Gu F., Khimani A., Rane S.G., Flurkey W.H., Bozarth R.F., Smith T.J. Structure and function of a virally encoded fungal toxin from Ustilago maydis: a fungal and mammalian Ca2+ channel inhibitor // Structure. - 1995. - V. 3, No 8. - P. 805-814.
106. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Ашина Ф.Г., Ник Рид, Эль-Регистан Г.И. Анализ Ca^-ответа мицелиальных грибов на внешние воздействия с использованием рекомбинантного экворина // Микробиол. - 1994. - Т. 73, № 6. - С. 734-740.
107. Pfeiffer R.D., Reed P.W., Lardy H.A. Ultraviolet and fluorescent spectral properties of the divalent cation ionophore A23187 and its metal ion complexes // Biochem. - 1974. -V. 13, No 19. - P. 4007-4014.
108. Bauer C.S., Simonis W., Schoenknecht G. Different xanthines cause membrane potential oscillations in a unicellular green alga pointing to a ryanodine/cADPR receptor Ca2+-channel // Plant Cell Physiol. - 1999. - V. 40, No 4. - P. 453-456.
Поступила в редакцию 31.01.09
Козлова Ольга Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. E-mail: o.kozlova@gmail.Com
Егоров Сергей Юрьевич - доктор биологических наук, профессор кафедры мик-
робиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
Куприянова-Ашина Флера Гарифовна - доктор биологических наук, профессор НИЛ ББФ при кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: Flera.Ashina@ksu.ru
