CC BY
23
УДК: 547.29 612.017.34
В.Л. Лимонов, А.В. Шурлыгина, М.В. Робинсон, Е.В. Мельникова, О.П. Колесникова, К.В. Гайдуль, А.Н. Мирскова, В.А. Труфакин
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ИНДОЛИЛТИОАЛКАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ (СОЕДИНЕНИЯ ВЛ-11-02) НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У ИНТАКТНЫХ МЫШЕЙ
ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирс ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН
Было предпринято исследование влияния соединения ВЛ-11-02 (производного индолил-тиоалканкарбоновой кислоты) на пролиферативную активность клеток центральных и периферических органов иммунитета — тимуса, селезенки и паховых лимфатических узлов. Выявлено, что данное вещество обладает дозозависимой антипролиферативной активностью, оказывает угнетающее влияние на пролиферацию Т- и В-клеточного звеньев иммунитета в центральных и периферических органах иммунной системы, что позволяет рассматривать его как потенциальный лекарственный препарат иммунодепрессивного действия. При этом, по-видимому, данное соединение обладает менее выраженной токсичностью по сравнению с другими иммунодепрессантами (в частности циклофосфаном), так как его введение отменяет стимуляцию апоптоза в тимусе в ранние сроки постциклофосфановой регенерации.
Ключевые слова: производные органилоксиалканкарбоновых кислот, иммунокомпетент-ные клетки, клеточный цикл, органы иммунитета
В настоящее время актуальной проблемой является создание новых лекарственных средств для лечения расстройств иммунитета. Современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушениями иммунных функций, выдвигают требования к поиску иммуноактивных препаратов селективного действия среди новых химических групп. Экспериментальное и клиническое изучение механизмов иммуноактивного действия одного из алканаммониевых производных органилоксиалканкарбоновых кислот — тре-крезана показало, что он обладает выраженными гемо- и иммунопоэзмодулирующими, а также противовоспалительными и интерфероногенны-ми свойствами [1, 2].
На основании скрининга иммуноактивных свойств нескольких соединений этого класса одно из производных индолилтиоалканкарбоновой кислоты (соединение ВЛ-11-02) было охарактеризовано как одно из наиболее активных, обладающее миело- и иммунодепрессивными свойствами. Однако механизм и возможная селективность действия до сих пор во многом остаются неясными. Исследование клеточной пролиферации и анализ клеточного цикла дают информацию о
функциональном состоянии иммунокомпетен-тных клеток. Данные параметры определенным образом меняются при антигенном, регуляторном и химическом воздействии на клеточные культуры и на целостный организм [3, 4, 5]. В связи с этим нами было предпринято исследование влияния соединения ВЛ-11-02 на пролиферативную активность клеток центральных и периферических органов иммунитета — тимуса, селезенки и паховых лимфатических узлов.
Методика
Экспериментальные животные
В работе использовали здоровых половозрелых животных — мышей линии СВА и мышей гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные были одного возраста и получены одновременно из одного питомника («Рассвет», г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей), на стандартном рационе. Все исследования
проводили в одно и то же время суток (утром). Исследуемое соединение вводили внутрибрю-шинно один раз в сутки в течение 5-7 дней в дозе 1/10 LD50. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель. Испытания проводили в несколько серий опытов, соответственно каждая серия опытов имела свой контроль. Все эксперименты выполнены в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ Минздрава СССР от 12.08.77 г.).
Оценка влияния соединения на спонтанную, Con A и PWM-стимулированную пролиферацию клеток селезенки in vitro Клетки селезенки мышей CBF1 культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций («Linbro») при +37°С в атмосфере 5% СО2 и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200000. Клетки стимулировали митогенами — конканавалиномА (Соп А, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митоге-нов подбирали предварительным титрованием и использовали в оптимальной дозе, что составило для Соп А 2 мкг/мл, а для PWM — 1 мкг/мл. Соединение ВЛ-11-02 в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н3-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волок-нистые фильтры («Flow Lab») с помощью аппарата Harvester («Titertek»). Радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2*105 клеток, представлены средние данные по триплету. Оценка соотношения клеток в различных фазах клеточного цикла в лимфоидных органах in vivo Исследование влияния соединения ВЛ-11-02 на прохождение иммунокомпетентных клеток
по фазам клеточного цикла in vivo проводили в модели постциклофосфановой регенерации. Мышам-самкам линии СВА вводили циклофосфан однократно внутрибрюшинно на изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 200 мг/кг, соединение ВЛ-11-02 в дозе 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно на следующий день после введения циклофосфана и далее в течение 10 дней. Контролем служила группа интактных мышей. Животных забивали под эфирным наркозом на 4-е и 10-е сутки после введения циклофосфана, извлекали тимус и паховые лимфатические узлы, готовили из них клеточную суспензию мягким раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе Клетки дважды отмывали холодным ФСБ (рН=7,4) и фиксировали в 70% этаноле. Через час образцы центрифугировали и удаляли спирт. Фиксированные клетки инкубировали в 1 ml раствора пропидиума иодида (10^g/ml в ФСБ) и РНКазы (0,2mg/ml) в течение 15 минут при комнатной температуре. По окончании времени инкубации образцы анализировали методом проточной цитофлуорометрии.
Результаты обрабатывали по программе Statistica 5. Достоверность различий оценивали по критерию U (Манна-Уитни) и с применением многомерного дисперсионного анализа MANOVA.
Результаты
Данные таблицы 1 демонстрируют, что соединение ВЛ-11-02, представляющее ряд трис-(2-гидроксиэтил)аммониевых солей производных индолил-3-тиоуксусной кислоты и ее производных, обладает дозозависимой антипролифера-тивной активностью. Доза 30 мкг/мл достоверно подавляет ConA-стимулированную пролиферацию клеток селезенки. Доза 30 мкг/мл подавляет и ConA, и PWM-стимулированную пролиферацию. Доза 300 мкг/мл угнетает и спонтанное, и индуцированное обоими митогенами клеточное деление. При этом подавление индуцированной пролиферации носит значительно более глубокий характер, чем при низких дозах. Таким образом, по-видимому, Т-клеточное звено является
Таблица 1
Влияние соединения ВЛ-11-02 на спонтанную, PWM- и ConA-индуцированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей CBF1 in vitro
Экспериментальная группа Доза (мкг/мл) Спонтанная пролиферация PWM-стимулированная пролиферация ConA-стимулированная пролиферация
Контроль 3236 7306 16010
3 2702 6440 13266
Соединение ВЛ-11-02 30 2396 5658 12968
300 570 141 125
Примечание: значения, выделенные жирным шрифтом, достоверно отличаются от контроля (р<0,05).
Таблица 2
Количество клеток в различных фазах клеточного цикла на 4-е сутки постциклофосфановой регенерации (М±ст. отклонение)
Показатель Интактный контроль Циклофосфан Циклофосфан + соединение ВЛ-11-02
Количество клеток в тимусе (х107) 6,52±1,95 0,66±0,17* 0,35±0,15*#
Количество клеток в лимфоузле (х106) 0,62±0,12 0,25±0,11* 0,12±0,07*
Гиподиплоидные клетки в тимусе (%) 0,54±0,25 1,84±0,71* 1,35±1,22
Тимоциты в фазе G0+G1 (%) 88,1±1,52 92,74±2,23 95,15±0,78*
Тимоциты в фазе S (%) 8,02±1,75 4,26±1,22* 2,47±0,51 *#
Тимоциты в фазе G2+M (%) 3,33±0,67 1,16±0,63* 1,03±0,40*
Гиподиплоидные клетки в лимфоузле (%) 0,52±0,81 0,29±0,17 0,68±0,59
Клетки лимфоузла в фазе G0+G1 (%) 96,99±0,89 94,51±3,28 97,52±1,45
Клетки лимфоузла в фазе S (%) 1,02±0,50 4,31±2,86 1,68±1,61
Клетки лимфоузла в фазе G2+M (%) 1,46±0,5 0,88±0,67 0,12±0,16*#
Примечание: * — достоверные отличия от интактного контроля; # - достоверные отличия от циклофосфана (р<0,05).
Таблица 3
Количество клеток в различных фазах клеточного цикла на 10-е сутки постциклофосфановой регенерации (М ± ст. отклонение)
Показатель Интактный контроль Циклофосфан Циклофосфан + соединение ВЛ-11-02
Количество клеток в тимусе (х107) 5,28±0,80 2,16±0,80 0,96±0,19*#
Количество клеток в лимфоузле (х106) 11,00±5,37 4,96±2,72 3,00±1,76
Гиподиплоидные клетки в тимусе (%) 1,65±1,18 1,86±1,46 0,67±0,44
Тимоциты в фазе G0+G1 (%) 85,94±3,53 85,09±1,58 88,54±1,75#
Тимоциты в фазе S (%) 8,54±2,52 9,19±0,96 7,72±1,16
Тимоциты в фазе G2+M (%) 3,87±0,09 3,85±0,57 3,07±0,49*#
Гиподиплоидные клетки в лимфоузле (%) 0,32±0,19 1,38±0,90 1,51±1,20
Клетки лимфоузла в фазе G0+G1 (%) 98,15±1,08 96,87±1,75 96,40±1,89
Клетки лимфоузла в фазе S (%) 1.44±1,09 1,59±0,99 1,97±1,09
Клетки лимфоузла в фазе G2+M (%) 0,07±0,09 0,16±0,12 0,12±0,20
Примечание: * — достоверные отличия от интактного контроля; # — достоверные отличия от циклофосфана (р<0,05).
более чувствительным к антипролиферативному действию соединения ВЛ-11-02, так как ConA-стимулированная пролиферация подавляется уже минимальной дозой. Кроме того, низкие дозы препарата, не влияя на процессы спонтанного клеточного деления, угнетают функциональную активность иммунокомпетентных клеток, снижая их способность адекватно отвечать на стимуляцию митогеном.
Метод с включением Н3-тимидина характеризует в большей степени интенсивность протекания синтетической фазы клеточного цикла. Кро-
ме того, данные исследований в культуре ex vivo не всегда могут быть использованы для объяснения эффектов иммуноактивных воздействий на уровне целостного организма. Поэтому следующим этапом работы было изучение соотношения клеток, находящихся на различных фазах клеточного цикла в тимусе и паховых лимфатических узлах in vivo в модели постциклофосфановой регенерации.
Из таблицы 2 видно, что на 4-е сутки после введения циклофосфана по сравнению с интакт-ным контролем происходит снижение общего ко-
личества клеток в тимусе и лимфатическом узле, а также относительного количества тимоцитов в фазах S и G2+M клеточного цикла. Повышается относительное количество гиподиплоидных клеток в тимусе. Таким образом, к 4-м суткам пос-тциклофосфановой регенерации наблюдается супрессия синтеза ДНК и пролиферации клеток тимуса. Возрастание доли гиподиплоидных ти-моцитов может свидетельствовать об усилении апоптотических процессов в органе.
Введение исследуемого вещества после инъекции циклофосфана приводит к еще большему снижению общего количества тимоцитов. В лимфоузле количество клеток снижено по сравнению с контролем, но не отличается от циклофосфана. Относительное количество гиподиплоидных ти-моцитов достоверно не отличается от такового у интактных животных. По сравнению с циклофос-фаном и интактным контролем оказалось сниженным количество тимоцитов в синтетической фазе и клеток лимфоузлов в премитотической и митотической фазах клеточного цикла. Таким образом, на 4-е сутки после введения циклофосфана соединение ВЛ-11-02 оказывает супрессирующий эффект на пролиферативную активность клеток как центральных, так и периферических органов иммунитета.
На 10-е сутки постциклофосфановой регенерации (таблица 3) в группе с введением одного циклофосфана не обнаружено достоверных изменений параметров клеточного цикла по сравнению с интактным контролем. В группе животных, получавших соединение ВЛ-11-02, оказалось сниженным количество клеток в тимусе, относительное количество тимоцитов в премитотической и митотической фазе и повышенным — количество тимоцитов в фазе покоя (G0+G1). Таким образом, можно видеть, что исследуемое соединение замедляет постциклофосфановую регенерацию на поздних сроках преимущественно на уровне центрального органа иммунитета — тимуса — за счет снижения пролиферативной активности клеток, но не за счет усиления процессов апоптоза. Эти результаты согласуются с данными исследования пролиферации лимфоидных клеток in vitro, показавшими большую чувствительность Т-клеточ-ного звена иммунной системы к антипролифера-тивному действию соединения ВЛ-11-02. Кроме того, они уточняют сведения, полученные при использовании в качестве экспериментальной модели клеточной культуры. Вполне вероятно, что отсутствие эффекта низкой дозы вещества на спонтанную пролиферацию, регистрируемую по включению Н3-тимидина, касается только S-фазы клеточного цикла и митотическая активность все же супрессируется.
Заключение
Производное органилоксиалканкарбоновых кислот (соединение ВЛ-11-02) оказывает угнетающее влияние на пролиферацию Т- и В-кле-точного звеньев иммунитета в центральных и периферических органах иммунной системы, что позволяет рассматривать его как потенциальный лекарственный препарат иммунодепрессивного действия. При этом, по-видимому, данное соединение обладает менее выраженной токсичностью по сравнению с другими иммунодепрессантами (в частности циклофосфаном), так как его введение отменяет стимуляцию апоптоза в тимусе в ранние сроки постциклофосфановой регенерации.
The influence of derivative of alkankarboxylic acids (compound VL-11-02) on the proliferative activity of immunocompetent cells at intact mice
V.L. Limonov, A.V. Shurlygina, M.V. Robinson, E.V. Melnikova, O.P. Kolesnikova, K.V. Gaidul, A.N. Mirskova, V.A. Trufakin
The influence of the compound VL-11-02 (the derivative of alkankarboxylic acids) on the proliferative activity of immunocompetent cells of the primary and secondary lymphoid organs — thymus, spleen and lymph node has been investigated at intact mice. It has been shown that this compound possessed dose-dependent antiproliferative activity, depressed proliferation of T- and B- cells in the primary and secondary lymphoid organs, that permitted to regard it as a potential immunodepressant drug. This compound is less toxic (in comparing with other immunode-pressants) because its injection abolished apoptosis stimulation the thymus in early period of the postcyclophosphan regeneration.
Литература
1. Гемо- и иммунопоэзактивные свойства тре-крезана / О.П. Колесникова, О.Т. Кудаева, Т.Г. Сухенко и др. // ДАН, 2003. — Т. 391. — № 3.
— С. 1-3.
2. К вопросу о механизмах иммуномодулиру-ющего эффекта производных алканкарбоновых кислот / О.П. Колесникова, О.Т. Кудаева, М.Н. Тузова, И.В. Сафронова // Иммунология, 1994.
— № 5. — С. 30-33.
3. Effect of sanquinavir on proliferation and telomerase activity of human peripheral blood mononuclear cells / O. Franzese, A. Lombardi, A. Coman-dini at al. // Life Sci., 2001. — Vol. 69. — № 13. — P. 1509-1520.
4. Immunomodulation by diethylstilbestrol is dose and gender related: effect of thymocyte apoptosis and mitogen-induced proliferation / J.B. Cale-mine, R.M.J. Gogal, A. Lengi at al. // Toxicology, 2002. — Vol. 178. — № 2. — P. 101-118.
5. Khaled A.R. The role of cytokines in lymphocyte homeostasis / A.R. Khaled, S.K. Durum // Biotechniques, 2002. — № 10. — P. 40-45.
