CC BY
66
Влияние микроорганизмов с разным уровнем экспрессии факторов патогенности на активность антиоксидантных ферментов эритроцитов
ЕА Щуплова, к.биол.н., Б.Я. Усвяцов, д.мед.н., профессор, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; С.И. Красиков, д.мед.н., профессор, С.В. Икрянникова, к.биол.н., Оренбургская ГМА
Супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза являются внутриклеточными антиоксидантами и играют важную роль в защите гемоглобина и мембраны эритроцита от повреждающего действия активных форм кислорода (АФК) [1].
Ранее показано, что одним из механизмов антигемоглобинового действия микроорганиз-
мов является усиление под их влиянием процессов окислительной деградации гемоглобина [2]. Вместе с тем состояние систем, ответственных за устойчивость гемоглобина к такой деградации, в частности ферментов антиокислительной защиты (СОД и каталаза), изучено недостаточно полно.
В связи с этим целью работы явилось изучение действия факторов патогенности З.фхйззпжйз и Е.аоИ на антиоксидантную систему эритроцитов (СОД и каталазу) при экспериментальной инфекции.
Материалы и методы. Для изучения изменений ферментных свойств эритроцитов (СОД, каталаза) воспроизвели экспериментальную инфекцию на животных с использованием штаммов микроорганизмов, обладающих факторами патогенности, мишенью действия которых являются эритроциты: гемолитической и антигемог-лобиновой активностями. Гемолитическую (ГА) и антигемоглобиновую (АнтиНЬА) активности у микроорганизмов определяли фотометрическими методами [2, 3].
Для моделирования генерализованной стафилококковой и кишечной инфекции использовали внутривенный метод заражения животных. Инфицирование проводили 0,1 мл взвеси суточной агаровой культуры бактерий в концентрации 50—85 млн. микробных клеток. Содержание животных, экспериментальные вмешательства осуществляли согласно приказу МЗ СССР №775 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».
Для заражения использовали клоны от двух штаммов, выделенных из клинического материала, — S. еpidermidis 45/1 и Е.соН 214. Для получения изогенных клонов применяли метод популяционного анализа, данные клоны отличались между собой по уровню экспрессии двух признаков: гемолитической (ГА) и антигемоглоби-новой (АнтиНЬА) активности. На протяжении 10 серий опытов изучаемые свойства у полученных клонов оставались стабильными.
Среди 17 клонов Е.соН 214 оказалось, что клон № 1 характеризовался низким уровнем ГА (26,1% гемолиза) и высоким уровнем АнтиНЬА (4,2 г/л) — данным клоном заразили I группу мышей; клон № 18 — высоким уровнем ГА (53,6% гемолиза) и низким уровнем АнтиНЬА (0,7 г/л) — заражена II группа животных; клон № 23 — низким уровнем как ГА (36,5% гемолиза), так и АнтиНЬА (2,5 г/л) — заражена III группа опытных мышей.
Среди 23 клонов S. еpidermidis было выбрано также 3 клона с разным уровнем экспрессии изучаемых свойств. Клон №7 характеризовался низким уровнем ГА (27,1% гемолиза) и высоким уровнем АнтиНЬА (5,8 г/л) — заразили I группу животных; клон №13 — с высоким уровнем ГА (54,4% гемолиза) и низким уровнем АнтиНЬА (0,4 г/л) — заражена II группа мышей, и клон №1 характеризовался низким уровнем как ГА (35,1% гемолиза), так и АнтиНЬА (1,9 г/л) — заражена III группа мышей.
В каждой группе животных было по 18 мышей, исследования проводили в трех параллелях. В качестве контроля использовались эритроциты 18 здоровых мышей.
Активность супероксиддисмутазы и катала-зы определяли по известным методикам [4, 5].
Измерения проводили с помощью спектрофотометра Genesys 5 (США), который позволяет регистрировать оптические спектры в диапазоне 200—1100 нм. Материалы, полученные в результате экспериментальных исследований указанными выше методами, были подвергнуты статистической обработке с использованием компьютерных программ Microsoft Excel, SPSS 8.0 for Windows для вычисления средней арифметической ряда (M); средней ошибки средней величины (m); критерия значимости (t) Стьюдента [6].
Результаты исследований и их обсуждение. Как показали результаты исследования, действие клонов E.coli на активность СОД эритроцитов мышей носило однотипный характер, а именно, происходило снижение активности фермента во всех группах опытных животных (рис. 1).
■
.
| [1 Ш ЁЗ шп ^
Примечание: 1, 2, 3 — достоверность отличий при р<0,05.
Рис. 1 - Изменение антиоксидантных свойств эритроцитов под действием клонов ЕсоИ при экспериментальной инфекции
Необходимо отметить, что клон с высоким уровнем АнтиНЬА и низким уровнем ГА (I группа) оказывал более сильное ингибирующее действие на активность СОД, чем в контрольной группе, что составляло 97,6±9,4 усл.ед/г НЬ против 490,1±10,5 усл.ед/г НЬ (р<0,05). Под действием клонов АооН II и III групп опытных животных супероксиддисмутаза определялась в пределах 105,5±4,0—110,8±5,8 усл.ед/г НЬ.
Данные показатели свидетельствуют о некомпенсированной реакции антиоксидантной системы эритроцитов, ответственной за деструкцию супероксидного радикал-аниона. Изучаемые факторы патогенности Е.оЫ1 не оказали подавляющего действия на СОД при экспериментальном инфицировании, что подтверждается данными литературы [7, 8].
Активность каталазы эритроцитов крови мышей под действием взятых клонов Е.ооН была меньше, чем в контрольной группе. Причем тен-
денция показателей наблюдается аналогично как при исследовании активности супероксиддис-мутазы (рис. 1). Активность каталазы в I группе мышей, зараженных клонами с высоким уровнем АнтиНЬА и низким уровнем ГА, составляла 146,7±5,1 усл.ед/гНЬ, что на 37,4 усл.ед/гНЬ ниже показателей III группы животных, зараженных клонами с низким уровнем АнтиНЬА и ГА (184,1±9,4 усл.ед/гНЬ) (при р<0,05). Показатели активности каталазы во второй группе на 32,4 усл.ед/гНЬ ниже результатов в III группе экспериментальных животных, что составляло 151,7±11,5 усл.ед/гНЬ против 184,1±9,4 усл. ед/гНЬ соответственно (при р<0,05). При сравнении с контрольными значениями оказалось, что активность каталазы в I и II группах опытных мышей снижена на 60 и на 55 усл.ед/гНЬ соответственно (при р<0,05).
Таким образом, полученные результаты выявили значимую реакцию каталазы эритроцитов мышей на действие клонов с различными уровнями экспрессии изучаемых факторов патогенности. Причем наиболее сильное подавление активности фермента, а следовательно, большую чувствительность, каталаза эритроцитов проявила в отношении клонов с высоким уровнем ан-тигемоглобиновой и низким уровнем гемолитической активностей (I группа животных). Клон с низким уровнем как АнтиНЬА, так и ГА (III группа мышей), хотя и вызывал угнетение активности каталазы эритроцитов, но в меньшей степени.
Действие клонов S.epidemidis на активность СОД существенно зависело от факторов патогенности бактерий (рис. 2). Под действием клонов с высоким уровнем АнтиНЬА и низким уровнем ГА (I группа опытных животных), в отличие от всех других групп, наблюдали самые высокие показатели СОД, что составляло '
'
'
■
'
■
■
Примечание: 1, 2, 3, 4 — достоверность отличий при р<0,05.
Рис. 2 - Изменение антиоксидантных свойств эритроцитов под действием клонов S.epidermidis при экспериментальной инфекции
519,1±10,4 усл.ед/гНЬ против 287,9±96,4 усл. ед/гНЬ (II группа мышей); 213,1±15,2 усл. ед/гНЬ — III группа животных и 251,6±10,8 усл. ед/г НЬ контрольных значений соответственно (при р<0,05). Повышение активности фермента происходило в ответ на оксидативный стресс, вызванный инфицированием, что подтверждается данными литературы [9].
Таким образом, инфицирование S.epidermidis приводило к заметным изменениям активности СОД, особенно в I группе животных. При действии клонов как с высокой гемолитической, так и с высокой антигемоглобиновой активностями значения активности фермента во время эксперимента существенно увеличивались. Данные показатели могут говорить о защитной реакции организма зараженных мышей.
Активность каталазы под действием S.epidermidis наиболее значимо снижалась в I и II группах эксперимента (рис. 2). Причем во II группе, где заражали клоном с высоким уровнем ГА и низким уровнем АнтиНЬА, наблюдали самые низкие значения фермента по сравнению с показателями контрольной группы, что составляло 129,9±11,5 усл.ед/г НЬ против 168,9±9,3 усл.ед/г НЬ (при р<0,05).
Таким образом, снижение активности катала-зы в первых двух опытных группах связано с повреждающим действием S.epidermidis на данное звено антиоксидантной системы эритроцитов.
Одним из механизмов антибактериальной активности эритроцитов является функционирование ферментов антиоксидантной системы (АОС) [10]. В связи с этим представляло интерес оценить чувствительность к бактерицидному действию эритроцитов клонов S.epidermidis и E. coli, подавляющих в разной степени АОС эритроцитов. Установлено, что по отношению к клонам S.epidermidis с низким уровнем АнтиНЬА (независимо от уровня ГА) имело место подавление роста и размножения микроорганизмов: в 15—17 случаях из 20 (при р<0,05), а к клону с высоким уровнем АнтиНЬА частота подавления роста была недостоверна: в 13 из 20 случаев (при р<0,05). По отношению ко всем клонам E.coli наблюдали достоверное подавление роста в 16 из 20 случаев (при р<0,05), что подтверждается данными литературы [10].
Как показали результаты исследований, не только микроорганизмы оказывали действие на антиоксидантные ферменты эритроцитов, но и сами эритроциты обладали антибактериальной активностью к клонам S.epidermidis и E.coli. Однако требует изучения вопрос взаимосвязи между экспрессией антигемоглобиновой активности у различных штаммов микроорганизмов и индивидуальным состоянием системы антиоксидантной защиты, что является предметом наших дальнейших исследований.
Литература
1. Бобырев, В.Н. Специфичность систем антиоксидантной защиты органов и тканей — основа дифференцированной фармакотерапии антиоксидантами / В.Н. Бобырев, В.Ф. По-черняева, С-.Г. Стародубцев и др. // Эксперим. и клин.фар-макология. 1994. №57(1). С. 47-54.
2. Ханина, Е.А. Антигемоглобиновая активность микроорганизмов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Оренбург, 2006. 22 с.
3. Азнабаев, Г.К. Некоторые биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2003. 26 с.
4. Сирота, Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. № 3. С. 35-39.
5. Метелица, Д.И. Влияние моноклональных антител против пероксидазы хрена на пероксидазное окисление о-фе-
нилендиамина / Д.И. Метелица, Н.В. Гирина, Е.И. Карасева и др. // Биохимия. 1995. Т. 60. № 10. С. 322-325.
6. Лакин, Г.Ф. Биометрия: учебное пособие для биологических специальностей университетов / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. 288 с.
7. Ахмедов, Д.Р. Клинико-патогенетическое значение анти-оксидантной системы при инфекционных заболеваниях // Иммунология. 1994. № 2. С. 25-29.
8. Mandell G.L. Catalase, superoxide dismutase, and virulence of Staphylococcus aureus, bi vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal-leukocyte interaction // J. Clin invest. 1975 Mar: 55(3): 561-61117067.
9. Волкова, Л.И. Перекисное окисление липидов и механизм антиоксидантного действия / М.И. Бондаренко // Лабораторное дело. 1991. № 12. С. 35-38.
10. Сторожук, П.Г. Ферменты прямой и косвенной антиради-кальной защиты эритроцитов и их роль в инициации процессов оксигенации гемоглобина, антибактериальной защите и делении клеток // Вестник интенсивной терапии. 2005. № 3. С. 8-13.
