CC BY
25
УДК 612.112.94:611-013.395
ВЛИЯНИЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ПРОДУКЦИЮ IL-4 И IGE АКТИВИРОВАННЫМИ АЛЛЕРГЕНОМ ЛИМФОЦИТАМИ
А.А. Айзенштадт 12, О.В. Супильникова 12, А.Б. Смолянинов 12 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 ООО «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, Россия
MESENCHYMAL STEM CELLS INFLUENCE ON IL4 AND IGE PRODUCTION BY ALLERGEN ACTIVATED LYMPHOCYTES
А.А. Ayzenshtadt12, O.V. Supilnikova 12, A.B. Smolyaninov 1 2 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia 2 «Stem cell Bank Pokrovsky» Ltd, Saint-Petersburg, Russia
© А.А. Айзенштадт, О.В. Супильникова, А.Б. Смолянинов, 2014
Известно, что мезенхимные стволовые клетки способны подавлять функциональную активность T-лимфоцитов и B-лимфоцитов, дендритных клеток и естественных киллеров. Эти свойства позволяют рассматривать мезенхимные стволовые клетки в качестве возможного средства клеточной терапии иммунопатологических состояний, в том числе аллергических реакций. Характер действия мезенхимных стволовых клеток на лимфоидные клетки, участвующие в аллергических реакциях, остается мало изученным. Мезенхимные стволовые клетки могут быть получены из костного мозга, жировой ткани, пупочного канатика и других тканей. Иммуномодулирующие свойства клеток, полученных из разных источников, могут отличаться. Задача работы состояла в определении влияния аллогенных мезенхимных стволовых клеток, полученных из различных источников, на секрецию IL-4 и эффекторной молекулы аллергических реакций - IgE лимфоцитами, стимулированными аллергенами. В работе были использованы культуры мезенхимных стволовых клеток, полученных из пупочного канатика, костного мозга и жировой ткани доноров. Лимфоциты получали из крови пациентов (16 человек) с аллергией на пищевые, бытовые, лекарственные и растительные аллергены. Лимфоциты инкубировали с аллергенами в присутствии мезенхимных стволовых клеток. Содержание IgE и IL-4 в культуральной среде определяли методом иммуноферментного анализа.
Мезенхимные стволовые клетки оказывали блокирующее действие на выработку IL-4 и IgE лимфоцитами пациентов, стимулированными аллергенами. Отсутствие различий между культурами интактных лимфоцитов и лимфоцитов, стимулированных аллергенами в присутствии мезенхимных стволовых клеток, по уровню секреции IL-4 и IgE, может свидетельствовать о супрессиии эффекторного звена аллергических реакций мезенхимными стволовыми клетками.
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, интерлейкин 4, IgE, аллергии.
The ability of mesenchymal stem cells to suppress functionality of T and B lymphocytes, dendritic cells and natural killers is well known. These properties allow considering the mesenchymal stem cells as possible source for cell therapy of immunological diseases, including allergy.
It still remains not enough studied, how mesenchymal stem cells influence lymphoid cells involved in allergic reactions. Mesenchymal stem cells could be obtained from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and other tissues. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells from different sources may vary. The goal of study was considering of different sources mesenchymal stem cells influence to IL4 and IgE production.
We investigate mesenchymal stem cells cultures obtained from donors umbilical cord, bone marrow and adipose tissue. Lymphocytes were obtained from donors (16 people) allergic to food, household, medicinal and floral allergens.
Lymphocytes were incubated with allergens and mesenchymal stem cells during 24 hours. IgE and IL-4 content in culture media was measured by ELISA.
Mesenchymal stem cells blocked IL4 and IgE production by allergen activated lymphocytes. Absence of difference between levels of IL-4 and IgE secretion in the cultures of intact lymphocytes and allergen stimulated lymphocytes in co-culture with mesenchymal stem cells may indicate suppression of effector part of allergic reactions by mesenchymal stem cells.
Key words: mesenchymal stem cells, interleukin 4, IgE, allergy.
Введение
Мезенхимные стволовые клетки (МСК) -мультипотентные стволовые клетки, способные к самоподдержанию в культуре и дифферен-цировке в клетки мезенхимного ряда. Впервые МСК были получены из костного мозга А.Я. Фриденштейном с коллегами в 1968 г. [1]. Начиная с 2002-2003 гг., когда были опубликованы первые сообщения о способности МСК ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов [2-4], иммунномодулирующие свойства МСК стали привлекать все большее внимание исследователей. Иммуномодулирующее действие МСК затрагивает почти все компоненты иммунной системы и обеспечивается сложной системой обратных связей. МСК значительно влияют на функциональную активность T- и B-лимфоцитов, NK и дендритных клеток [5]. Такие свойства делают МСК многообещающими кандидатами для клеточной терапии иммунопатологических состояний [6-8], в том числе аллергических реакций. Согласно данным международного исследования (ISAAC), частота встречаемости аллергических заболеваний у детей в России достигает 20%, во взрослой популяции, по различным оценкам - 10-15%. Характер действия МСК на лимфоидные клетки, участвующие в аллергических реакциях, остается мало изученным. Далек от понимания вопрос о том, как могут воздействовать МСК на клетки, обеспечивающие эффектор-ное звено развития реакций немедленной гиперчувствительности первого типа. Не ясно, какой эффект оказывают МСК на секрецию T-клетками-хелперами второго типа цитоки-нов аллергических реакций (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13), а также на продукцию B-лимфоидными клетками IgE-молекулы, запускающей процесс дегрануляции тучных клеток. Большинство имеющихся данных относится к МСК, полученным из костного мозга. С другой стороны, для клинического применения больший интерес могут представлять МСК, выделенные из жировой ткани взрослых людей [9] и из соединительной ткани пупочного канатика [10, 11], поскольку, обладая сходным диффе-ренцировочным потенциалом и иммуннофе-нотипом (CD105, CD90, CD44, CD73, Stro-1, CD166), они отличаются от МСК костного мозга более высокой пролиферативной активностью [12]. Иммуномодулирующие свойства МСК, полученных из разных источников, могут отличаться.
Задачей работы было определение влияния МСК, полученных из различных источников, на продукцию IL-4 и IgE лимфоцитами, стимулированными аллергенами.
Материалы и методы
Получение и культивирование МСК
В качестве источников МСК использовали образцы костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, полученные при наличии информированного согласия доноров материала.
Костный мозг (КМ) получали из подвздошной кости здорового донора. Аспират КМ разделяли центрифугированием (400 g, 30 мин) на градиенте фиколла (Биолот, Россия). Фракцию лейкоцитов собирали на границе фаз, промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСР), после чего вносили в полную питательную среду (Advanced Mesenchymal Stem Cells Media, HyClone, Новая Зеландия) c добавлением 20% заменителя сыворотки (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали во флаконы (площадь 75 см2, плотность 100 тыс. кл/см2). Через 3 дня проводили смену среды для удаления непри-крепившихся клеток.
Образцы подкожной жировой ткани были получены от двух здоровых доноров. Ткань механически измельчали, затем инкубировали при 370С в 0,2 % растворе коллагеназы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР. Диссоциированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили через 24 ч.
Пупочные канатики получали при неос-ложненных родах. Пупочную вену последовательно промывали 0,02% раствором версена и ФСР. Затем вену заполняли 0,1% раствором коллагеназы (смесь коллагеназы I и IV типа, Sigma-Aldrich, США) в том же буфере, канатик клеммировали с двух сторон и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Далее вену промывали раствором ФСР и повторно заполняли раствором коллагеназы и инкубировали в течение 40 мин при 37°С. Полученную взвесь клеток отмывали от фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс кл/см2 в полной питательной среде (Advanced Mesenchymal Stem Cells Media, HyClone, Новая Зеландия) c добавлением 20% заменителя сыворотки (Hyclone, Новая Зеландия). Смену среды проводили через 2-5 суток.
По достижении 70-80% конфлюентности монослоя МСК пересевали при плотности
5000 кл/см2 и культивировали в полной питательной среде с 10 % заменителя сыворотки.
В экспериментах использовали культуры МСК 3-4 пассажей, находившиеся в фазе логарифмического роста (50-70% конфлюент-ности).
Получение и активация клеток мононуклеарной фракции. Лимфоциты получали из крови пациентов, имеющих ^Е-опосредованную гиперчувствительность немедленного типа на известные аллергены. Всего в исследовании участвовало 16 доноров, у 4 из которых имеется пищевая моноаллергия, у 3 - аллергическая реакция развивается на лекарственные аллергены, у 5 - на аллергены растительного происхождения (пыльца растений) и у 4 - на бытовые аллергены (шерсть и эпителий домашних животных, пыль).
Фракцию мононуклеарных клеток выделяли на градиенте фиколла (Биолот, Россия) согласно принятым методикам. Клетки суспендировали в концентрации 5 млн/мл в ростовой среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки. К суспензии клеток добавляли раствор соответствующего аллергена в концентрации указанной производителем, после чего в течение 30 минут вносили в лунки 6-луночного планшета, содержащего культуру МСК в состоянии 50-70% конфлюентности.
Сокультивирование МСК и стимулированных аллергенами лимфоцитов Для опытов по сокультивированию МСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс кл/см2. Через сутки в те же ячейки вносили лимфоциты, выделенные из крови пациентов с аллергическими реакциями, в равном численном соотношении с МСК.
Сокультивирование проводили в течение 3 суток в среде RPMI с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Нус1опе, Новая Зеландия). Контролем служили нестимулированные лимфоциты тех же пациентов, а также лимфоциты, стимулированные аллергеном в отсутствии МСК. Все эксперименты были поставлены в 3-5 повторностях.
Иммуноферментный анализ Определение концентрации ^Е и цитоки-на ^-4 в культуральной жидкости проводили методом твердофазного иммуноферментного
анализа (ИФА). Для этого по окончании со-культивирования МСК и лимфоцитов отбирали супернатант, отмечали его объем и количество клеток. Собственно для анализа использовали 100 мкл. Постановку реакции проводили с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Измерение оптической плотности производили на планшетном спектрофотометре Anthos 2020 или Мультискан FC. Интерпретацию результатов проводили по инструкции производителя наборов. Для качественного определения рассчитывали значение критической оптической плотности (границы между положительным и отрицательным результатами) по формуле, указанной в инструкции. Для количественного определения концентрации строили калибровочную кривую согласно инструкции. При определении конечных результатов вносили поправку на количество клеток и объем пробы.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программы Microsoft Ехсе1. Для каждой выборки определяли ошибку среднего по формуле М = с / V n. Сравнение различных групп с контролем проводили с использование критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали значение р меньше 0,05.
Результаты и их обсуждение
Содержание IL-4 в культуральной
жидкости смешанной культуры
активированных аллергенами
лимфоцитов и МСК
Присутствие МСК при инкубации лейкоцитов с аллергеном влияло на содержание IL-4 в культуральной жидкости в экспериментах с лимфоцитами 14 доноров из 16. Для двух доноров не было показано статистически значимых отличий между лимфоцитами интактными и стимулированными аллергеном, а также в варианте сокультивирования с МСК. Ниже приведены усредненные данные по экспериментам с лимфоцитами 14 доноров. При культивировании лимфоцитов в присутствии аллергена (положительный контроль) наблюдали статистически значимое увеличение содержания IL-4 в супернатанте по сравнению с интактными лимфоцитами (контроль). В смешанной культуре МСК с лимфоцитами при добавлении аллергена данного эффекта не наблюдали, уровень IL-4 достоверно не отличался от показателей в контроле. Таким образом, МСК предотвращали увеличение концентрации IL-4 при стимулировании лимфоцитов аллергеном. МСК, полу-
ченные из различных источников, оказывали сходное по уровню супрессивное действие на продукцию ^-4.
Содержание IgE в культуральной жидкости смешанной культуры активированных аллергенами лимфоцитов и МСК
Культивирование лимфоцитов донора в течение 3-х дней в присутствии аллергена, соответствующего анамнезу данного донора, приводило к значительному повышению концентрации ^Е по сравнению с культурой интактных лимфоцитов того же донора. Описанная реакция наблюдалась при культивировании клеток всех 16 доноров. В случае смешанной культуры лимфоцитов с МСК не происходило повышения содержания ^Е в присутствии аллергена. Таким образом, можно заключить, что сокультивиро-вание с МСК вызывало блокирование выработки ^Е в ответ на стимуляцию лимфоцитов аллергеном. Описанное выше влияние МСК было сходным для всех культур МСК независимо от их источника.
Таким образом, в данной работе было показано блокирующее действие МСК на выработку ^-4 и ^Е стимулированными аллергенами
лимфоцитами пациентов, страдающих аллергическими реакциями.
IL-4 является одним из ключевых цитокинов в реализации аллергических реакций. Он стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т и В-лимфоцитов, определяет дифференцировку Т-хелперов в Т-хелперы 2-го типа и повышает продукцию IgE. IL-4 стимулирует созревание тучных клеток и влияет на процесс эозинофиль-ного воспаления. Таким образом, IL-4 действует на проксимальном и критическом участке реализации аллергических реакций. Снижение содержания IL-4 в сыворотке крови пациентов может указывать на ослабление проявлений аллергических заболеваний [13]. Учитывая важную роль IL-4 в регуляции аллергических реакций, можно ожидать снижение интенсивности протекании аллергических реакций под действием МСК.
IgE - класс иммуноглобулинов человека -обуславливает реализацию аллергических реакций немедленного типа (или IgE-зависимые реакции). IgE является основной эффекторной молекулой и основным маркером аллергических реакций. Снижение уровня IgE является прямым свидетельством торможения аллергической реакции под влиянием МСК в модели in vitro.
Рис. 1. Изменение содержания 1Ь-4 в культуральной жидкости при сокультивировании лимфоцитов с МСК в присутствии аллергена: контроль - интактные лимфоциты, аллерген - лимфоциты, стимулированные аллергеном; МСК ПК - смешанная культура лимфоцитов и МСК пупочного канатика; МСК КМ - смешанная культура лимфоцитов и МСК костного мозга; МСК ЖТ - смешанная культура лимфоцитов и МСК жировой ткани.
На графике отложена ошибка среднего
Рис. 2. Изменение содержания ^Е в культуральной жидкости при сокультивировании с МСК в присутствии аллергена: контроль - интактные лимфоциты, аллерген - лимфоциты, стимулированные аллергеном; МСК ПК - смешанная культура лимфоцитов и МСК пупочного канатика; МСК КМ - смешанная культура лимфоцитов и МСК костного мозга; МСК ЖТ - смешанная культура лимфоцитов и МСК жировой ткани.
На графике отложена ошибка среднего
Отсутствие значимых различий в уровне IL-4 и IgE между культурами интактных лимфоцитов и лимфоцитов, стимулированных аллергенами в присутствии МСК, может свидетельствовать о блокировании эффекторно-го звена аллергических реакций по действием МСК. Данное утверждение справедливо для всех проанализированных культур МСК, полученных из различных источников: пупочный канатик, костный мозг и жировая ткань.
Литература
1. Friedenstein, A.J. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues / A.J. Friedenstein [et al.] // Transplantation. - 1968. - Vol. 6. - P. 230-247.
2. Bartholomew, A. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo / A. Bartholomew [et al.] // Exp. Hematol. - 2002. - Vol. 30. -P. 42-48.
3. Di Nicola, M. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli / M. Di Nicola [et al.] // Blood. - 2002. - Vol. 99(10). -P. 3838-3843.
4. Le Blanc, K. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex / K. Le Blanc [et al.] // Scand J. Immunol. - 2003. - Vol. 57. - P. 11-20.
5. English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation / K. English // Immunol Cell Biol. - 2013. - Vol. 91(1). - P. 1926.
6. Кругляков, П.В. Мезенхимные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма / П.В. Кругляков [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2006. - № 1. - C. 36-41.
7. Stagg, J. Mechanisms of immune modulation by mesenchymal stromal cells and clinical translation / J. Stagg, J. Galipeau // Curr. Mol. Med. - 2013. - Vol. 13(5). - P. 856-867.
8. Uccelli, A. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells / A. Uccelli, L. Moretta, V. Pistoia // Eur. J. Immunol. - 2006. - Vol. 36. -P. 2566-2573.
9. Zimmerlin, L. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue / Zimmerlin L. [et al.] // Cytometry Part A. - 2010. - Vol. 77. -P. 22-30.
10. Romanov, Y.A. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord / Y.A. Romanov, V.A. Svintsitskaya, V.N. Smirnov // Stem Cells. - 2003. - Vol. 21. -P. 105-110.
11. Sarugaser, R. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors / R. Sarugaser [et al.] // Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. - P. 220-229.
12. Kern, S. Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue / S. Kern [et al.] // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 12941301.
13. Steinke, J.W. Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists / J.W. Steinke, L. Borish // Respir Res. - 2001. - Vol. 2. - P. 66-70.
АА. Au3eHrnmadm Ten.: +7-921-774-15-47 e-mail: aizendt@gmail.com
