CC BY
241
мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки пупочного КАНАТИКА: БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОйСТВА И КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
И.В. Арутюнян12, А.В. Макаров 123, А.В. Ельчанинов 123, Т.Х. Фатхудинов 123
1 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия
3 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
Umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells: biological properties and clinical applications
I.V. Arutyunyan 12, A.V. Makarov123, A.V. Elchaninov123, TKh. Fatkhudinov1 2 3
1 V.I. Kulakov Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology of Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow, Russia
2 Scientific Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia
3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow, Russia
Представлены современные литературные и собственные данные о происхождении и свойствах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из пупочного канатика человека: пролиферативном потенциале, пластичности, стабильности кариотипа и фенотипа, имму-номодулирующей активности . Приведен обзор клинических исследований с использованием данного типа клеток Перспективы использования мультипотентных мезенхималь-ных стромальных клеток пупочного канатика в клеточной трансплантологии обуславливают необходимость создания специализированных биобанков и стандартизации самого трансплантата
Ключевые слова: пупочный канатик человека, мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки, клинические исследования
The article presents the current literature evidence and own data on the origin and properties of human umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells including proliferative potential, plasticity, stability of caryotype and phenotype, and immunomodulatory activity A review of clinical trials using this cell type is performed . Prospects for the use of multipotent stromal cells, derived from umbilical cord, in cell transplantation associate with the need for specialized biobanking and transplant standardization criteria
Keywords: human umbilical cord, multipotent mesenchymal stromal cells, clinical trials
Происхождение и строение пупочного канатика
человека
Пупочный канатик человека является дериватом амниотической ножки, посредством которой зародыш с 15 сут . развития связан с хорионом . Помимо мезенхимы амниотической ножки в формировании канатика принимают участие аллантоис со своими сосудами и желточный стебелек . Снаружи амниоти-ческая ножка покрывается амниотической оболочкой, однослойный кубический эпителий которой в области пупочного отверстия срастается с эпителием кожи плода Строму пупочного канатика составляет соединительная ткань со специальными свойствами, не встречающаяся в организме человека после его рождения. Это слизистая соединительная ткань, называемая также вартонов студень (в англоязычной литературе «Wharton's Jelly») по имени английского анатома Томаса Вартона (Thomas Wharton, 1614—1673), описавшего ткань . Источником развития вартонова студня является внезародышевая мезодерма эмбриобласта . Основное вещество ткани содержит значительное количество гликозаминогли-канов, особенно гиалуроновой кислоты и хондроитин сульфата, фибриллярный компонент представлен коллагеновыми волокнами, эластические волокна отсутствуют . Клеточный компонент вартонова студня представлен производными мезенхимы (фибробла-стами, миофибробластами, гладкими миоцитами,
e-mail: fatkhudinov@gmail . com
мультипотентными мезенхимальными стромальны-ми клетками) [1, 2]. Вартонов студень предохраняет пупочные сосуды (две пупочные артерии, по которым течет венозная кровь от плода, и одну вену, по которой течет насыщенная кислородом кровь к плоду) от сжатия, обеспечивая упругость канатика . Поперечный срез пупочного канатика (38—39 нед . гестации) представлен на рис . 1 (собственные данные).
Рис. 1. Пупочный канатик человека:
1 — пупочные артерии (выпячивания мышечной стенки оболочек сомкнуты в момент рождения ребенка для предотвращения кровотечения);
2 — пупочная вена, наполненная кровью;
3 — вартонов студень, окружающий сосуды. Окр.: гематоксилин и эозин. Ув. х100
Пупочный канатик - источник мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток
В 1974 г . было показано, что пуповинная кровь является источником гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток [3], при этом остальные ткани пупочного канатика оставались просто биологическим отходом, не представлявшим научной ценности . Отношение к пупочному канатику было кардинальным образом пересмотрено, когда в 1991 г . K . McElreavey с соавт . описали культуру фибро-бластоподобных клеток, выделенных из вартонова студня [4]. Принадлежность данных клеток к муль-типотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК) была доказана в 2004 г . : наличие рецепторов к белкам внеклеточного матрикса CD44 и CD105, интегринов CD29 и CD51, продукция CD73, отсутствие экспрессии гемопоэтических маркеров CD34 и CD45, возможность индуцированной диф-ференцировки в остеоциты, хондроциты, адипоциты и кардиомиоциты [5]. В настоящее время к ММСК пупочного канатика относят клетки, выделенные из целого фрагмента канатика (в англоязычной литературе — «total umbilical cord-derived") или различных его участков (вартонова студня, периваскулярной области, субамниотического слоя, но не амниотической оболочки или стенок кровеносных сосудов) [1, 2].
На рис . 2 представлены результаты нашего исследования культивируемых клеток вартонова студня, которые в соответствии с требованиями iSCT (international Society for Cellular Therapy) [6] подтверждают принадлежность клеток к ММСК и являются необходимым базисом для дальнейшего изучения их свойств
Происхождение ММСК в вартоновом студне
пупочного канатика
В работе X . Wang с соавт . (2008) было показано, что гемопоэтические клетки и ММСК из желточного мешка и области «аорты-гонады-мезонефроса» мигрируют по пупочному канатику в область плаценты, а затем обратно в печень и костный мозг зародыша . Во время этих двух волн миграции часть клеток задерживается в вартоновом студне и сохраняется в нем на протяжении всего срока гестации . При этом новое микроокружение изменяет свойства мигрирующих клеток, что, возможно, и объясняет их отличие от ММСК костного мозга [7].
Выделение первичной культуры ММСК
из вартонова студня
Большинство протоколов выделения первичной культуры ММСК из пупочного канатика состоят из трех этапов:
1) удаление эпителия, кровеносных сосудов и пе-риваскулярной ткани;
2) механическое измельчение и ферментативная обработка с использованием трипсина, коллагеназ i, ii, iV типов, диспазы, протеазы, гиалуронидазы;
3) перенос в культуральную среду (чаще стандартные культуральные среды с добавлением человеческой или фетальной телячьей сыворотки крови, которые могут быть дополнены факторами роста (FGFb, EGF, PDGF, VEGF) [1, 8].
Также для выделения ММСК может быть применен метод эксплантов, который позволяет избежать
повреждающего действия ферментов на клетки и сокращает время обработки биоматериала (в англоязычной литературе эта процедура также называется «plate and wait») [9]. Метод эксплантов позволяет выделять фракцию клеток с более высоким проли-феративным потенциалом [10], но при этом фено-типически более неоднородную [11].
По литературным данным и данным нашей лаборатории эффективность выделения первичной культуры ММСК из пупочного канатика человека составляет 100% . Для сравнения: эффективность выделения культуры ММСК из пуповинной крови не превышает 60%, амниотической жидкости — 90%, плаценты — варьирует от 62,5% до 100% [12]. Следует особо отметить, что практически во всех культуральных лабораториях работают с пупочными канатиками, полученными после кесарева сечения, так как при родоразрешении через естественные родовые пути значительно возрастает риск контаминации первичного биоматериала Показано, что выделение ММСК возможно только из свежего биоматериала, но не из замороженных фрагментов пупочного канатика [13].
Экспрессия специфических маркеров
в ММСК вартонова студня
Профиль экспрессии поверхностных маркеров и маркеров мультипотентности ММСК пупочного канатика на сегодняшний день исследован достаточно полно (табл . 1 и 2) .
Таблица 1. Экспрессия поверхностных маркеров ММСК пупочного канатика (по данным [1, 14, 15])
Экспрессируются Данные об экспрессии противоречивы Не экспрессируются
CD10 CD51 CD54 CD11b CD49a
CD13 CD58 CD105 CD14 CD50
CD29 CD73 CD106 CD31 CD53
CD44 CD90 CD117 CD33 CD56
CD49b CD166 CD144 CD34 CD71
CD49c CD325 CD38 CD80
CD49d CD40 CD86
CD49e HLA-I CD45 HLA-II
Таблица 2. Экспрессия маркеров мультипотентности ММСК пупочного канатика (по данным [1, 14, 15])
Экспрессируются Данные об экспрессии противоречивы
REX2 STRO-1
GD2 OCT4
SOX2 SSEA4
NANOG
Особое внимание обращает на себя маркер СР105 (эндоглин, белок комплекса рецептора к TGF-p): в соответствии с требованиями iSCT СР105 является обязательным маркером для верификации ММСК [6], однако данные по нему различных исследователей противоречат друг другу . В большинстве работ указано, что СР105 присутствует на поверхности ММСК пупочного канатика [1]. Однако в отдельных исследованиях показано, что СР105 в этих клетках не экспрессируется (при сохранении дифференцировочного потенциала) [16] или
появляется только на 5 пассаже [17]. Уменьшение уровня экспрессии основных маркеров ММСК Сй73, Сй90, СР105 может происходить и при изменении условий культивирования, например, -гипоксии [18]. По данным нашей лаборатории СР105 экспрессируется на поверхности более 98% ММСК пупочного канатика (исследование проводили на 2—4 пассажах) (рис . 2А), но доля СР105 + клеток может снижаться при длительном культивировании клеток в высокой плотности (неопубликованные данные)
CD105-PerCP-Cy5.5
Negative cocktail-PE
г.
Д
WW№
Рис. 2. Характеристика ММСК пупочного канатика в соответствии с требованиями ISCT: А — иммунофенотип;
Б — культура ММСК пупочного канатика, 4 пассаж;
В — адипогенная дифференцировка ММСК;
Г — остеогенная дифференцировка ММСК;
Д — хондрогенная дифференцировка ММСК.
А — проточная цитофлуориметрия,
Б—Д — световая микроскопия.
Окр.: В — судан III; Г — ализариновый красный S;
Д — альциановый синий.
Ув.: Б х50; В х100; Г х200; Д х100
Также противоречивы данные об уровне экспрессии в ММСК пупочного канатика маркеров мульти-потентности, которые присутствуют при соблюдении определённых условий: только на ранних пассажах [19], в присутствии фидерных клеток [20], при культивировании в условиях гипоксии [21] или в виде суспензии после отбора CD105 + -клеток [22]. При этом значимость присутствия маркеров эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) может быть нивелирована: ММСК пупочного канатика экспрессируют SSEA4 на протяжении минимум 9 пассажей, однако между SSEA4+ и SSEA4- субпопуляциями не обнаружено различий в пролиферативном и дифференци-ровочном потенциалах [23].
Пролиферативный потенциал и стабильность
кариотипа ММСК пупочного канатика
ММСК пупочного канатика имеют более высокий пролиферативный потенциал, чем ММСК костного мозга («золотой стандарт» для сравнения любых ММСК), или ММСК из других постнатальных (жировой ткани) и неонатальных источников (плаценты и амниотической мембраны) [24—26]. Достаточное количество исходного материала (масса пупочного канатика около 40 г), высокая теломеразная активность позволяют получить из одного образца свыше 109 клеток при сохранении нормального кариотипа в течение 6 пассажей [27, 28]. Начиная с 7 пассажа теломеразная активность ММСК пупочного канатика значительно снижается, при этом нормальный ка-риотип сохраняется на протяжении как минимум 25 пассажей [29, 30]
Туморогенность ММСК пупочного канатика
Клетки из тканей пуповинно-плацентарного комплекса являются уникальными, поскольку по совокупности свойств представляют собой промежуточный вариант (в англоязычной литературе «bridge») между эмбриональными и постнатальными ММСК [31]. Экспрессия маркеров S0X2, NAN0G в ММСК пупочного канатика выше, чем в ММСК костного мозга [30], но ниже, чем в ЭСК [7]. Возможно, именно этим объясняется важнейшее отличие ММСК пупочного канатика от ЭСК: отсутствие неопластической трансформации при трансплантации иммунодефицитным животным . В одной из первых работ, посвященных данному вопросу, ЭСК человека и ММСК пупочного канатика трансплантировали иммунодефицитным мышам . ЭСК формировали тератомы через 6 нед после трансплантации (в 85% случаев при подкожном введении, 75% при внутримышечном введении и 100% при перитонеальном введении), при этом трансплантированные ММСК не вызывали новообразований и воспалительных реакций даже на отдаленных сроках (20 нед . ) [32] . Более того, ММСК пупочного канатика не формировали опухолей в nude мышах даже после внедрения гена TERT (обратной транскриптазы теломеразы), обеспечивающего повышение теломеразной активности [33].
При моделировании трансформации культуры in vitro (сокультивирование с клетками рака молочной железы или яичника) ММСК пупочного канатика не изменяли свои свойства (морфологию, период удвоения, транскриптом), в отличие от ММСК костного мозга, которые приобретали фенотип опухоль-ассо-циированных фибробластов [34].
Дифференцировочный потенциал ММСК
пупочного канатика
Пластичность ММСК пупочного канатика очень высока: in vitro при добавлении в культуральную среду специфических индукторов ММСК способны дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты, дермальные фибробласты, гладкомы-шечные клетки, скелетномышечные клетки, карди-омиоциты, гепатоцитоподобные клетки, инсулин-, глюкагон- и соматостатин-продуцирующие клетки, клетки потовых желез, эндотелиальные клетки, нейроглиальные клетки, (олигодендроциты), дофа-минергические нейроны [8, 14, 35—39]. В 2014 г . была продемонстрирована возможность индукции экспрессии ММСК маркеров примордиальных зародышевых клеток и мужских половых клеток, что ранее было показано только для ЭСК и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток [40, 41].
□ публикованы работы, в которых сравнивают диф-ференцировочный потенциал ММСК пупочного канатика и ММСК из других источников Выявлен более высокий уровень экспрессии эндотелий-специфичных маркеров и формирование более разветвленной сети капилляроподобных структур при моделировании ангиогенеза в матриксе базальной мембраны у ММСК пупочного канатика по сравнению с ММСК костного мозга [42]. Эффективность дифференци-ровки ММСК вартонова студня в инсулин-продуци-рующие клетки была на 72% выше, чем у ММСК костного мозга [43]. Также ММСК пупочного канатика продемонстрировали более высокий остеогенный потенциал, чем ММСК, выделенные из плаценты, жировой ткани или костного мозга [26]. При формировании нейросфер ММСК вартонова студня экс-прессировали больше нейротрофических факторов, чем ММСК костного мозга или жировой ткани [44]. При этом ММСК вартонова студня и костного мозга показали одинаковую эффективность дифференци-ровки в дофаминергические нейроны [38].
В ряде работ продемонстрирована возможность направленной дифференцировки ММСК пупочного канатика после генетической модификации (транс-дукции или трансфекции) ММСК с повышенной экспрессией фактора роста гепатоцитов HGF дифференцируются in vitro в дофаминергические нейроны [45], способствуют in vivo ремиелинизации нервных волокон и восстановлению моторных функций при внутримозговом кровоизлиянии [46]. После аденовирусного внедрения кДНК фактора стероидогенеза SF-1 ММСК вартонова студня дифференцируются в гормон-продуцирующие клетки, причем уровень секреции кортизола и тестостерона, а также выживаемость модифицированных клеток выше, чем при трансдукции ММСК костного мозга [47].
Интересно, что пластичность ММСК может зависеть от условий протекания беременности Так, ММСК, выделенные из пупочного канатика пациенток с преэклампсией, лучше отвечают на нейро-глиальную дифференцировку, чем ММСК здоровых доноров [48]. При этом недоношенность беременности не влияет на нейрональную дифференциров-ку ММСК пупочного канатика [49], но снижает эффективность остеогенной дифференцировки [50] Гестационный сахарный диабет не влияет на имму-нофенотип ММСК, но подавляет их пролифератив-ный и пластический потенциал, а также значительно снижает уровень экспрессии генов, регулирующих
функциональную активность митохондрий ND2, ND9, COX1, PGC-1 а и TFAM [51]. Таким образом, нарушение метаболизма материнского организма во время беременности оказывает значимое влияние на биологические свойства фетальных ММСК, что должно быть учтено при клиническом использовании этого типа клеток
Иммуномодулирующие свойства ММСК
пупочного канатика
В 2008 г . была опубликована статья M . Weiss с соавт , в которой впервые были подробно изучены иммунные свойства ММСК пупочного канатика [52] Авторы сделали пять основных выводов:
1) ММСК подавляют пролиферацию Кон-А-стимулированных клеток селезенки (ксеногенная модель) и активированных мононуклеарных клеток периферической крови (аллогенная модель);
2) ММСК не способны вызвать пролиферацию клеток селезенки и Т-клеток;
3) ММСК экспрессируют иммуносупрессивную изоформу HLA-G6, ингибирующую цитолитическую активность NK-клеток;
4) ММСК не экспрессируют костимулирующие молекулы CD40, CD80 и CD86, обеспечивающие активацию В-лимфоцитов;
5) ММСК продуцируют противовоспалительные цитокины, обеспечивающие их иммуномодулирую-щие свойства [52].
В настоящее время считается, что иммуномодули-рующая активность ММСК пупочного канатика обеспечена паракринным механизмом . Так, например, синтез данными клетками iL-6 препятствует созреванию дендритных клеток [53], синтез простагландина Е2 ингибирует цитолитическую активность NK-клеток [54], а синтез индоламин-2,3-диоксигеназы (iDO) ингибирует дифференцировку Т-хелперов [55]. После стимулирования iL-1 ß в ММСК пупочного канатика значительно повышается уровень транскрипции иммуномодулирующих цитокинов TGFßl, iDO, TSG6 и PGE2, причем сильнее, чем в ММСК костного мозга и плаценты [30]. TSG6 и PGE2 являются основными эффекторными молекулами, обеспечивающими способность ММСК регулировать ранние этапы воспаления за счет переключения М1/М2 путей активации макрофагов [56].
Интересно, что ММСК, культивированные в бессывороточной среде или среде с добавлением GMP-сертифицированной человеческой сыворотки, сильнее подавляют пролиферацию Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов по сравнению с ММСК, культивированными в среде с добавлением ксеногенной (эмбриональной телячьей) сыворотки Таким образом, отказ от ксеногенных компонентов культуральной среды является достаточно важным с точки зрения возможного клинического применения ММСК пупочного канатика [57].
Доклинические исследования
с использованием ММСК пупочного канатика
В электронной базе данных PubMed [58] представлены результаты десятков экспериментальных
работ ведущих научных лабораторий с использованием ММСК пупочного канатика . Показана эффективность применения этого типа клеток на животных с моделированием повреждения легких [59], аутоиммунного энцефаломиелита [60], полнослойной кожной раны [30], декстран-индуцированного колита [61], инфаркта миокарда [62], артрита [63] и многих других . Все исследователи подтверждают миграцию трансплантированных ММСК в поврежденные ткани или органы, при этом в качестве механизмов терапевтической активности рассматривают трофический эффект, паракринное воздействие на клетки иммунной системы, моделирование внеклеточного матрикса, ангиогенез и апоптоз, стимуляцию миграции и пролиферации резидентных прогениторных клеток [30, 59—63]. Также опубликованы единичные работы, в которых продемонстрировано усиление ре-паративного потенциала ММСК пупочного канатика при повышении экспрессии целевых генов: HGF на модели церебральной геморрагии [64] и повреждения пазух носа [65], SDF-1 на модели инфаркта миокарда [66] Все проведенные исследования демонстрируют перспективность клинического использования ММСК пупочного канатика
Клинические исследования с использованием
ММСК пупочного канатика
В настоящее время в FDA зарегистрированы десятки клинических исследований (1—3 фаза) безопасности и эффективности применения нативных аллогенных ММСК пупочного канатика для терапии социально значимых заболеваний В соответствии с данными интернет-портала http://www . clinicaltrials . gov [67] (поисковые запросы «wharton jelly msc» и «umbilical cord msc», исключены результаты, содержащие «blood-derived») по состоянию на март 2015 г . зарегистрированы клинические исследования безопасности и эффективности трансплантации ММСК пупочного канатика для лечения острого инфаркта миокарда, дилатационной и др кардиомиопатий, критической ишемии нижних конечностей, бронхоле-гочной дисплазии у новорожденных, ВИЧ-инфекции, сахарного диабета i и ii типов, острой и хронической печеночной недостаточности, аутоиммунного гепатита, цирроза печени различной этиологии, некротически-язвенного колита, острой апластической анемии, болезни Альцгеймера, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, миелодиспласти-ческого синдрома, наследственной атаксии, травмы спинного мозга, болезни Бехтерева, остеоартрита, рассеянного склероза, миодистрофии Дюшенна, острой и устойчивой к стероидной терапии реакции «трансплантат против хозяина» и др
В настоящее время опубликованы результаты лишь небольшой части клинических исследований Результаты исследований ii-iii фазы представлены в табл 3
Результаты клинических исследований с использованием ММСК пупочного канатика весьма обнадеживают, особенно в случаях терапии аутоиммунных и эндокринных заболеваний . Интересно, что подавляющее большинство подобных испытаний проходят в клинических центрах КНР .
Таблица 3. Результаты клинических исследований безопасности и эффективности трансплантации ММСК пупочного канатика
Заболевание. международный идентификатор исследования
Число реципиентов (возраст). Количество трансплантируемых
ммск ПК. Способ введения. Кратность введения
Результаты исследования
о О
Диабет I типа NCT01219465
Системная красная волчанка NCT01741857
Системная красная волчанка NCT00698191
Бронхолегочная
дисплазия
NCT01297205
ВИЧ-инфекция NCT01213186
15 (младше 25 лет); 2,6±1,2 млн; парентерально; повтор через 4 нед.
1 млн/1 кг массы тела;
внутривенно;
однократно.
16 (17-55 лет); 1 млн/1 кг массы тела; внутривенно; однократно.
9 (недоношенные новорожденные весом 630-1030 г); 10-20 млн/1 кг массы тела;
интратрахеально; однократно.
7 (26-49 лет);
0,5 млн/1 кг массы
тела;
внутривенно; повтор через 1 и 2 мес.
В течение 24 мес. после трансплантации: [68]
1) отсутствие значимых различий по уровню глюкозы в плазме крови натощак и синтезу антител
к глютаминокислой декарбоксилазе (gada);
2) снижение уровня глюкозы в плазме крови после приема пищи, начиная с 9 мес.;
3) снижение гликированного гемоглобина hbalc, начиная с 6 мес.;
4) увеличение уровня с-пептида натощак, начиная с 6 мес.;
5) уменьшение ежедневной дозы инсулина, начиная с 6 мес. у 8 реципиентов снижение на 50%, у 3 пациентов полный отказ от инсулинотерапии;
6) отсутствие побочных эффектов и кетоацидоза
в экспериментальной группе, 3 случая кетоацидоза в контрольной группе.
Через 1 мес. после трансплантации: [69]
1) увеличение уровня индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) в крови;
2) снижение доли CD3+CD4+ Т-клеток в периферической крови.
В течение 24 мес. после трансплантации: [70]
1) значительное устойчивое снижение SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index);
2) снижение уровня протеинурии в течение 3 мес. у всех реципиентов, в течение 6 мес.- у 8, в течение 12 мес.- у 2, в течение 18 мес.- у 1;
3) повышение уровня сывороточного альбумина у 13 пациентов с гипопротеинемией;
4) увеличение доли CD4+FoxP3+ Т-клеток в периферической крови;
5) повышение уровня TGFp, отсутствие изменений уровня IL-10.
1) отсутствие изменений продолжительности интубации; [71]
2) снижение тяжести БЛД, коэффициент регрессии 1,7;
3) снижение уровня IL-1 в, IL-6, IL-8, IL-10, MMP-9, TNFa, TGFP1 в аспирате трахеи на 7 сут. после трансплантации.
В течение 12 мес.: [72]
1) значительное увеличение количества CD4 и соотношения CD4/CD8 Т-клеток;
2) увеличение продукции CD4 Т-клетками IFN-y и IL-2;
3) значительное снижение экспрессии PD-1 (programmed cell death 1) и увеличение экспрессии BTLA
(B- and T-lymphocyte attenuator) на CD4 и CD8 Т-клетках;
4) значительное снижение в крови уровня провоспалительных цитокинов.
Окончание таблицы 3
Заболевание. международный идентификатор исследования Число реципиентов (возраст). Количество трансплантируемых ммск ПК. Способ введения. Кратность введения Результаты исследования Ссылки
Первичный 7 (33-58 лет); В течение 48 нед.: [73]
билиарный цирроз 0,5 млн/1 кг массы 1) снижение уровня щелочной фосфатазы и
NCT01662973 тела; у-глутамилтрансферазы в крови;
внутривенно; 2) отсутствие влияния на уровень альбумина, общего
повтор через билирубина, IgM, АЛТ, АСТ, протромбинового времени.
4 и 8 нед.
Печеночно-клеточная недостаточность NCT01218464 24 (24-59 лет); 0,5 млн/1 кг массы тела; внутривенно; повтор через 4 и 8 нед. В течение 72 нед.: 1) увеличение выживаемости; 2) увеличение уровня альбумина, холинэстеразы и протромбинового времени; 3)снижение уровня билирубина и АЛТ [74]
Стандартизация требований к трансплантату
на основе ММСК пупочного канатика
Основной проблемой сравнения результатов экспериментальных исследований и клинических испытаний остается отсутствие стандартизованного протокола выделения, экспансии и криоконсервации ММСК пупочного канатика [8], а также единых требований к конечному продукту . Наиболее полный опубликованный перечень таких требований содержит следующие пункты:
1) отсутствие HiV-1/2, HBV, HCV, HTLV-1/2, HPV, B-19, CMV, EBV, микоплазмы, бактериальной контаминации;
2) иммунофенотип CD73 + , CD90 + , CD105 + , CD34-, CD45-, HLA-DR-, CD14- или CD11b-, CD79a-или CD19-;
3) жизнеспособность более 80% после размораживания;
4) содержание эндотоксина менее 2 EU/мл, остаточного БСА — менее 50 нг/уп . ;
5) отсутствие повышения активности hTERT и онкогенов в процессе культивирования;
6) отсутствие понижения активности генов-супрессоров опухолей в процессе культивирования;
7) подтвержденная пластичность [75]
ММСК пупочного канатика -
зарегистрированный клеточный продукт
В ЕС зарегистрирован клеточный продукт на основе ММСК пупочного канатика человека — UCX®, производимый компанией ECBiO (Амадора, Португалия). В настоящее время идет работа по характеристике UCX® в соответствии с требованиями, установленными Директивой 2001/83/ЕС и Предписанием ЕС № 1394/2007, для дальнейшего применения его в качестве ATMP (Advanced-therapy medicinal products) —
медицинского продукта на основе генной и клеточной технологий или тканевой инженерии [76]. В России в настоящее время в перечне лицензируемой медицинской деятельности представлен лишь забор гемопоэтических стволовых клеток (Постановление Правительства Российской Федерации N 291 от 16 апреля 2012 г . ), а выделение и наращивание ММСК и их использование никак не регулируется законодательством, что ограничивает разработку новых клеточных продуктов на основе этого уникального материала
Создание специализированных банков
ММСК пупочного канатика
Благодаря свойствам, продемонстрированным in vitro и in vivo, ММСК пупочного канатика смогли привлечь внимание не только экспериментальных групп, но и клиницистов . Неудивительно, что биобанки, специализировавшиеся ранее только на хранении пуповинной крови, ввели новый вид услуг — хранение культивированных ММСК пупочного канатика Среди таких банков — старейший Cryo-Cell international, inc . (Тампа, США), Precious Cells BioBank HQ (Лондон, Великобритания), Reliance Life Sciences (Нави Мумбаи, Индия), Thai HealthBaby (Бангкок, Тайланд), Stemlife (Медоубрук, Австралия), Покровский банк стволовых клеток (Санкт-Петербург, Россия). Единственным ограничением является получение биоматериала путем кесарева сечения, тем не менее, общее количество хранимых образцов исчисляется десятками тысяч [75], при этом длительная криокон-сервация не изменяет их свойства [77]. Возможно, оптимальным решением с точки зрения дальнейшего клинического применения является одновременное банкирование пуповинной крови (в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток) [78] и культивированных ММСК пупочного канатика [79].
Заключение
Пупочный канатик человека является источником ММСК, обладающих уникальным сочетанием свойств пренатальных и постнатальных ММСК: отсутствие этических проблем при получении биоматериала, значительный пролиферативный и дифференцировочный потенциал, отсутствие тумо-рогенности, стабильность кариотипа, высокая им-муномодулирующая активность В настоящее время изолированные и культивированные ММСК пупоч-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bongso A ., Fong C-Y . Phenotype and Differentiation Potential of Stromal Populations Obtained from Various Zones of Human Umbilical Cord: An Overview . Stem Cell Reviews and Reports 2013; 9(2): 226-40 .
2 . Щеголев А. И ., Дубова Е .A ., Павлов К .А . Морфология плаценты . Москва: НЦАГиП им . В . И . Кулакова; 2010 .
3 . Knudtzon S . In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood . Blood 1974; 43(3): 357-61.
4 . McElreavey K . D ., Irvine A . I . , Ennis K . T . et al . Isolation, culture and characterisation of fibroblast-like cells derived from the Wharton's jelly portion of human umbilical cord . Biochem . Soc . Trans . 1991; 19(1): 29S .
5 Wang H S , Hung S C , Peng S T et al Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord Stem Cells 2004; 22(7): 1330-7 .
6 . Dominici M ., Le Blanc K ., Mueller I . et al . Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7 .
7 . Wang X .Y ., Lan Y ., He W .Y . et al . Identification of mesenchymal stem cells in aorta-gonad-mesonephros and yolk sac of human embryos . Blood 2008; 111(4): 2436-43 .
8 . Li D . R ., Cai J . H . Methods of isolation, expansion, differentiating induction and preservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells . Chin . Med . J . (Engl . ) 2012; 125(24): 4504-10 .
9 . Trivanovic D ., Kocic J ., Mojsilovic S . et al . Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly . Srp. Arh . Celok Lek . 2013; 141(3-4): 178-86 .
10 . Salehinejad P ., Alitheen N . B ., Ali A . M . et al . Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly In Vitro Cell Dev Biol Anim 2012; 48(2): 75-83 .
11 Margossian T , Reppel L , Makdissy N et al Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly: comparative phenotype analysis between tissue and in vitro expansion Biomed Mater Eng 2012; 22(4): 243-54 .
12 Bieback K , Brinkmann I Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy World J Stem Cells 2010; 2(4): 81-92 .
13 Chatzistamatiou T K , Papassavas A C , Michalopoulos E et al Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood Bank Transfusion 2014; 54(12): 3108-20 .
14 Can A , Karahuseyinoglu S Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells Stem Cells 2007; 25(11): 2886-95 .
15 Batsali A K , Kastrinaki M C , Papadaki H A et al Mesenchymal stem cells derived from Wharton's Jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications Curr Stem Cell Res Ther. 2013; 8(2): 144-55 .
16 Kadam S S , Tiwari S , Bhonde R R Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord . In Vitro Cell Dev . Biol . Anim . 2009; 45(1-2): 23-7 .
17 Bakhshi T , Zabriskie R C , Bodie S et al Mesenchymal stem cells from the Wharton's jelly of umbilical cord segments provide stromal support for the maintenance of cord blood hematopoietic stem cells during long-term ex vivo culture . Transfusion 2008; 48(12): 2638-44.
18 Majumdar D , Bhonde R , Datta I Influence of ischemic microenvironment on human Wharton's Jelly mesenchymal stromal cells . Placenta 2013; 34(8): 642-9 .
19 Tantrawatpan C , Manochantr S , Kheolamai P et al Pluripotent gene expression in mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly and their differentiation potential to neural-like cells . J . Med . Assoc . Thai . 2013; 96(9): 1208-17 .
20 Fong C Y , Richards M , Manasi N et al Comparative growth behaviour and characterization of stem cells from human Wharton's jelly . Reprod . Biomed . Online 2007; 15(6): 708-18 .
21 Drela K , Sarnowska A , Siedlecka P et al Low oxygen atmosphere facilitates proliferation and maintains undifferentiated
ного канатика являются перспективным объектом хранения ведущих биобанков мира, а число зарегистрированных клинических испытаний с их использованием постоянно увеличивается
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России, уникальный идентификатор научного проекта RFMEFI61314X0008.
state of umbilical cord mesenchymal stem cells in an hypoxia inducible factor-dependent manner. Cytotherapy 2014; 16(7): 881-92 .
22 . Amiri F., Halabian R ., Dehgan Harati M . et al . Positive selection of Wharton's jelly-derived CD105+ cells by MACS technique and their subsequent cultivation under suspension culture condition: a simple, versatile culturing method to enhance the multipotentiality of mesenchymal stem cells . Hematology 2014; 20(4): 208-16 .
23 . He H ., Nagamura-lnoue T ., Tsunoda H . et al . Stage-specific embryonic antigen 4 in Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells is not a marker for proliferation and multipotency . Tissue Eng . Part A 2014; 20(7-8): 1314-24 .
24 . Lu L . L ., Liu Y . J ., Yang S . G . et al . Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials . Haematologica 2006; 91(8): 1017-26 .
25 . Shaer A., Azarpira N . , Aghdaie M . H . et al . Isolation and characterization of Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Placental Decidua Basalis; Umbilical cord Wharton's Jelly and Amniotic Membrane . Pak . J . Med . Sci . 2014; 30(5): 1022-6 .
26 . Li X ., Bai J ., Ji X . et al . Comprehensive characterization of four different populations of human mesenchymal stem cells as regards their immune properties, proliferation and differentiation . Int . J . Mol . Med . 2014; 34(3): 695-704 .
27 . Karahuseyinoglu S ., Cinar 0 . , Kilic E . et al . Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys Stem Cells 2007; 25(2): 319-31.
28 . Ruan Z . B ., Zhu L ., Yin Y . G . et al . Karyotype stability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during in vitro culture Exp . Ther . Med . 2014; 8(5): 1508-12 .
29 . Chen G ., Yue A ., Ruan Z . et al . Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells do not undergo malignant transformation during long-term culturing in serum-free medium PLoS one 2014; 9(6): e98565
30 . Sabapathy V ., Sundaram B ., VM S . et al . Human Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells plasticity augments scar-free skin wound healing with hair growth . PLoS One 2014; 9(4): e93726 .
31. Taghizadeh R . R . , Cetrulo K . J ., Cetrulo C . L . Wharton's Jelly stem cells: future clinical applications . Placenta 2011; 32 Suppl 4: S311-5 .
32 Gauthaman K , Fong C Y , Suganya C A et al Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells . Reprod . Biomed . Online 2012; 24(2): 235-46
33 Liang X J , Chen X J , Yang D H et al Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells by hTERT gene transfection in vitro . Cell Biol . Int . 2012; 36(2): 215-21
34 Subramanian A , Shu-Uin G , Kae-Siang N et al Human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells do not transform to tumor-associated fibroblasts in the presence of breast and ovarian cancer cells unlike bone marrow mesenchymal stem cells J . Cell Biochem . 2012; 113(6): 1886-95 .
35 Han Y , Chai J , Sun T et al Differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into dermal fibroblasts in vitro Biochem Biophys . Res . Commun . 2011; 413(4): 561-5 .
36 Kadam S S , Bhonde R R Islet neogenesis from the constitutively nestin expressing human umbilical cord matrix derived mesenchymal stem cells . Islets 2010; 2(2): 112-20 .
37 Wang H , Zhao T , Xu F et al How important is differentiation in the therapeutic effect of mesenchymal stromal cells in liver disease? Cytotherapy 2014; 16(3): 309-18 .
38 . Datta I ., Mishra S ., Mohanty L . et al . Neuronal plasticity of human Wharton's jelly mesenchymal stromal cells to the dopaminergic cell type compared with human bone marrow mesenchymal stromal cells . Cytotherapy 2011; 13(8): 918-32 .
39 Yang S , Ma K , Feng C et al Capacity of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to differentiate into sweat gland-like cells: a preclinical study . Front . Med . 2013; 7(3):345-53 .
40 . Li N ., Pan S . , Zhu H . et al BMP4 promotes SSEA-1( + ) hUC-MSC differentiation into male germ-like cells in vitro Cell Prolif 2014; 47(4): 299-309 .
41. Latifpour M ., Shakiba Y ., Amidi F . et al . Differentiation of Human Umbilical Cord Matrix-Derived Mesenchymal Stem Cells into Germ-Like Cells . Avicenna J . Med . Biotechnol . 2014; 6(4): 218-27 .
42 . Chen M .Y ., Lie P . C ., Li Z . L . et al . Endothelial differentiation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells . Exp . Hematol . 2009; 37(5): 629-40 .
43 . Wu L . F ., Wang N . N ., Liu Y . S . et al . Differentiation of Wharton's jelly primitive stromal cells into insulin-producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells . Tissue Eng . Part A 2009; 15(10): 2865-73 .
44 . Balasubramanian S . , Thej C ., Venugopal P . et al . Higher propensity of Wharton's jelly derived mesenchymal stromal cells towards neuronal lineage in comparison to those derived from adipose and bone marrow . Cell Biol . Int . 2013; 37(5): 507-15 .
45 . Li J . F ., Yin H . L ., Shuboy A. et al . Differentiation of hUC-MSC into dopaminergic-like cells after transduction with hepatocyte growth factor. Mol . Cell Biochem . 2013; 381(1-2): 183-90 .
46 . Liu A. M ., Lu G ., Tsang K. S . et al . Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with forced expression of hepatocyte growth factor enhance remyelination and functional recovery in a rat intracerebral hemorrhage model . Neurosurgery 2010; 67(2): 357-65 .
47 . Wei X ., Peng G ., Zheng S . et al . Differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into steroidogenic cells in comparison to bone marrow mesenchymal stem cells . Cell Prolif . 2012; 45(2): 101-10 .
48 . Joerger-Messerli M . , Brühlmann E ., Bessire A. et al . Preeclampsia enhances neuroglial marker expression in umbilical cord Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells . J . Matern . Fetal Neonatal . Med . 2014; 5: 1-6 .
49 . Messerli M ., Wagner A ., Sager R . et al . Stem cells from umbilical cord Wharton's jelly from preterm birth have neuroglial differentiation potential . Reprod . Sci . 2013; 20(12): 1455-64.
50 . Penolazzi L., Vecchiatini R ., Bignardi S . et al . Influence of obstetric factors on osteogenic potential of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells . Reprod . Biol . Endocrinol . 2009; 7: 106 .
51 Kim J , Piao Y , Pak Y K et al Umbilical cord mesenchymal stromal cells affected by gestational diabetes mellitus display premature aging and mitochondrial dysfunction Stem Cells Dev 2015; 24(5): 575-86 .
52 Weiss M L , Anderson C , Medicetty S et al Immune properties of human umbilical cord Wharton's jelly-derived cells Stem Cells 2008; 26(11): 2865-74 .
53 Deng Y , Yi S , Wang G et al Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells instruct dendritic cells to acquire tolerogenic phenotypes through the IL-6-mediated upregulation of SOCS1. Stem Cells Dev . 2014; 23(17): 2080-92 .
54 . Chatterjee D ., Marquardt N . , Tufa D . et al . Role of gamma-secretase in human umbilical-cord derived mesenchymal stem cell mediated suppression of NK cell cytotoxicity Cell Commun Signal 2014; 12(1): 63 .
55 Liu R , Su D , Zhou M et al Umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of circulating T follicular helper cells in patients with primary Sjogren's syndrome through the secretion of indoleamine 2,3-dioxygenase . Rheumatology (Oxford) 2015; 54(2): 332-42
56 Prockop D J Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation . Stem Cells 2013; 31(10): 2042-6 .
57 Hartmann I , Hollweck T , Haffner S et al Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells grow best under GMP-compliant culture conditions and maintain their phenotypic and functional properties . J . Immunol . Methods 2010; 363(1): 80-9 .
58 . National Library of Medicine . URL: http://www . ncbi . nlm . nih . gov/pubmed/ (дата обращения 14 .04. 2015) .
59 . Liu L ., Mao Q ., Chu S . et al . Intranasal versus intraperitoneal delivery of human umbilical cord tissue-derived cultured mesenchymal stromal cells in a murine model of neonatal lung injury Am J Pathol 2014; 184(12): 3344-58 .
60 . Donders R ., Vanheusden M ., Bogie J . F . et al . Human Wharton's jelly-derived stem cells display immunomodulatory properties and transiently improve rat experimental autoimmune encephalomyelitis . Cell Transplant . 2015; 24(10):2077-98 .
61. Lin Y ., Lin L ., Wang Q . et al . Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells attenuates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice . Clin . Exp . Pharmacol . Physiol . 2015; 42(1): 76-86 .
62 . Santos Nascimento D ., Mosqueira D ., Sousa L . M . et al . Human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells attenuate remodeling after myocardial infarction by proangiogenic, antiapoptotic, and endogenous cell-activation mechanisms . Stem Cell Res . Ther . 2014; 5(1): 5 .
63 . Santos J . M ., Barcia R . N ., Simöes S . I . et al . The role of human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells (UCX®) in the treatment of inflammatory arthritis . J . Transl . Med . 2013; 11: 18 .
64 . Liu A . M . , Lu G . , Tsang K . S . et al . Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with forced expression of hepatocyte growth factor enhance remyelination and functional recovery in a rat intracerebral hemorrhage model . Neurosurgery 2010; 67(2): 357-65
65 . Li J ., Zheng C . Q . , Li Y . et al . Hepatocyte growth factor gene-modified mesenchymal stem cells augment sinonasal wound healing Stem Cells Dev . 2015; 24(15):1817-30 . .
66 Tang J , Wang J , Guo L et al Mesenchymal stem cells modified with stromal cell-derived factor 1 alpha improve cardiac remodeling via paracrine activation of hepatocyte growth factor in a rat model of myocardial infarction . Mol . Cells 2010; 29(1): 9-19 .
67 Database of publicly and privately supported clinical studies of human participants . URL: http://www . clinicaltrials . gov/ (дата обращения 03 . 03 . 2015) .
68 Hu J , Yu X , Wang Z et al Long term effects of the implantation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells from the umbilical cord for newly-onset type 1 diabetes mellitus Endocr J 2013; 60(3): 347-57 .
69 Wang D , Feng X , Lu L et al A CD8 T cell/indoleamine 2,3-dioxygenase axis is required for mesenchymal stem cell suppression of human systemic lupus erythematosus Arthritis Rheumatol 2014; 66(8): 2234-45 .
70 Sun L , Wang D , Liang J et al Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus . Arthritis Rheum . 2010; 62(8): 2467-75 .
71. Chang Y . S ., Ahn S .Y ., Yoo H . S . et al . Mesenchymal stem cells for bronchopulmonary dysplasia: dose-escalation clinical trial J Pediatr . 2014; 164(5): 966-72 . e6 .
72 Zhang Z , Fu J , Xu X et al Safety and immunological responses to human mesenchymal stem cell therapy in difficult-to-treat HIV-1-infected patients . AIDS 2013; 27(8): 1283-93 .
73 Wang L , Li J , Liu H et al Pilot study of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transfusion in patients with primary biliary cirrhosis . J . Gastroenterol . Hepatol . 2013; 28 Suppl 1: 85-92 .
74 Shi M , Zhang Z , Xu R et al Human mesenchymal stem cell transfusion is safe and improves liver function in acute-on-chronic liver failure patients . Stem Cells Transl . Med . 2012; 1(10): 725-31
75 Liang L , Han Z C Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells: Biology and Clinical Application . In: Stoltz J . F ., editor. Regenerative Medicine and Cell Therapy . Amsterdam: IOS Press; 2012 . p . 62-70 .
76 Martins J P , Santos J M , de Almeida J M et al Towards an advanced therapy medicinal product based on mesenchymal stromal cells isolated from the umbilical cord tissue: quality and safety data Stem Cell . Res . Ther . 2014; 5(1): 9 .
77 Cooper K , Viswanathan C Establishment of a mesenchymal stem cell bank . Stem Cells Int . 2011; 2011: 905621.
78 . Уфимцева А . И ., Канов Е . В . Характеристика и ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пупо-винной крови . КТТИ 2012; VII(4) 21-7 .
79 Secco M , Zucconi E , Vieira N M et al Mesenchymal stem cells from umbilical cord: do- not discard the cord! Neuromuscul . Disord . 2008; 18(1): 17-8 .
Поступила: 21.03.2015
