Влияние экстракта из туники асцидии пурпурной на функциональные свойства эритроцитов при гиперхолестеринемии

Лесникова Лариса Николаевна; Кушнерова Наталья Федоровна; Фоменко Светлана Евгеньевна; Спрыгин Владимир Геннадьевич; Момот Татьяна Викторовна

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ

Лесникова Лариса Николаевна

канд. биол. наук, научный сотрудник ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ E-mail: lorena-05@mail. ru Кушнерова Наталья Федоровна доктор биол. наук, профессор ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ E-mail: natasha50@mail. ru Фоменко Светлана Евгеньевна канд. биол. наук, вед. науч. сотр.

ТОИ ДВО РАН, г. Владивосток, РФ E-mail: sfomenko@mail.ru Спрыгин Владимир Геннадьевич канд.биол. наук, вед науч. сотр.

ТОИ ДВО РАН г. Владивосток E-mail: vsprygin@poi.dvo.ru Момот Татьяна Викторовна канд. мед. наук, доцент ДВФУ г. Владивосток, РФ E-mail: kushnerova83@mail.ru

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ТУНИКИ АСЦИДИИ ПУРПУРНОЙ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

Аннотация

Проведен анализ изменений физиологических характеристик эритроцитов экспериментальных животных в условиях гиперхолестеринемии. Показано увеличение диаметра и объема эритроцитов, повышение концентрации холестерина в их мембране, изменение осмотической резистентности клеток крови, что негативно отражается на их функциональном состоянии. Отмечена положительная тенденция в нормализации изученных параметров при введении животным экстракта из туники асцидии пурпурной.

Ключевые слова

Осмотическая резистентность, средний диаметр эритроцитов, холестерин, экстракт из туники асцидии

Гиперхолестериновый рацион является одной из распространенных экспериментальных моделей формирования гиперхолестеринемии (ГХС), при которой происходит встраивание холестерина (ХС) из липопротеинов в мембрану эритроцитов Существенное увеличение индекса холестерин/фосфолипиды (ХС/ФЛ) в мембране эритроцитов является признаком патологического процесса. Перегруженность эритроцитарной мембраны холестерином может приводить к нарушению функции эритроцитов вследствие изменения проницаемости мембраны, активности мембраносвязанных ферментов и клетки в целом. При этом повышается вязкость и «жесткость» мембран, что приводит к снижению скорости переноса кислорода [6, с. 134].

В настоящее время установлено, что «морские» липиды обладают выраженным гипохолестеринемическим действием за счет присутствия в них полиненасыщенных жирных кислот

(ПНЖК) семейства n-3. Экстракт из туники асцидии пурпурной является комплексным препаратом, содержащим в своем составе 53,1% ненасыщенных жирных кислот от суммы всех жирных кислот. Из них ПНЖК семейства n-3 составляют 33% [3, с. 66]. Данный факт обусловил возможность прогнозировать его гипохолестеринемический эффект.

Целью данной работы явилось изучение физиологических и биохимических показателей эритроцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии и возможности их коррекции с помощью экстракта из туники асцидии пурпурной.

Экспериментальную гиперхолестеринемию вызывали введением в рацион животных повышенного содержания насыщенных жиров в течение 6 недель (растительное сало 25% от веса рациона), включающих 2,5% холестерина.

Эритроциты выделяли по методу М.С. Усатенко и Г.И. Берлин [2, с. 60]. Экстракты общих липидов готовили по методу J.Folch et al. [5, с. 498]. В мазках крови с помощью окуляр-микрометра определяли диаметр эритроцитов (мкм). Средний объем эритроцита (СОЭр) вычисляли согласно метода Д.И. Гольдберг и др. [1, с. 56]. Осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) измеряли по методу Б. Эндрю [4, с. 164].

В эксперименте использовали белых крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. Все животные были разделены на 3 группы по 10 крыс в каждой: 1-я группа - контроль (интактные, стандартный рацион); 2-я группа -гиперхолестериновый рацион; 3-я группа - гиперхолестериновый рацион+экстракт из туники асцидии. Экстракт из туники асцидии вводили внутрижелудочно через зонд 2 раза в сутки в дозе 0,4 мл/кг массы, что соответствовало 28 мг/кг сухого остатка. Контрольным животным вводили дистиллированную воду в той же дозе.

Экстракт из туники асцидии пурпурной (Halocynthia aurantium) был приготовлен методом реперколяции на 40%-ном этиловом спирте (1:1). Способ получения запатентован (патент RU№ 1522487, ТУ 9169-007-20783642-96). Экстракт имеет товарный знак «Хаурантин®» (свидетельство на товарный знак № 236689).

Гиперхолестериновый рацион вызвал формирование типичной картины ГХС, при которой в крови количество ХС возросло в 2 раза (2,56±0,05 ммоль/л против 1,29±0,02 ммоль/л в контроле; р<0,001).

Изучение размерных характеристик эритроцитов показало, что при гиперхолестеринемии происходит увеличение СДЭ на 37% (р<0,001), что составляло 8,50±0,02 мкм по сравнению с 6,21±0,05 мкм в контроле. Также увеличился СОЭр до 122,82±1,55 мкм3 (в контроле 47,89±1,35 мкм3; р<0,001), что определяет развитие макроцитоза. При этом начало и завершение гемолиза эритроцитов происходило позже, чем у контрольных крыс (начало при концентрации NaCl 0,35±0,01%, а завершение - при 0,30±0,01%). В контроле начало гемолиза происходило при 0,40±0,01%, а завершение при 0,35±0,01% NaCl. Следовательно, при гиперхолестеринемии наблюдался сдвиг начала гемолиза в сторону более высокой устойчивости эритроцитов к низким концентрациям NaCl. Но интервал концентраций NaCl между началом и завершением гемолиза был минимальным (0,05%). Так как холестерин снижает эластичность мембраны, то при ГХС эритроцит имеет меньшие возможности к растяжению, что и обусловило более быстрое завершение гемолиза.

Гиперхолестеринемия сопровождалась снижением количества общих фосфолипидов до 47,67±1,72%, что на 25% (р<0,001) меньше контрольных значений (63,57±1,78%).

Исследование уровня холестерина в эритроцитах показало, что его содержание на 26% (р<0,01) превышало контрольный уровень и составляло 28,45±0,89% (в контроле 22,61±0,68%). В связи с этим увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,59±0,02 (в контроле 0,36±0,01; р<0,001).

Таким образом, введение в рацион больших количеств насыщенного жира (50% по калорийности) и ХС (2,5%) обусловливает увеличение размерных характеристик эритроцитов за счет повышения уровня ХС и насыщенных жирных кислот. Кроме того увеличиваются показатели осмотической резистентности эритроцитов к гемолизирующему агенту, что предполагает повышение плотности и жесткости мембран, снижение их фильтрационной способности и скорости движения по микроциркулярному руслу.

При сравнении размерных характеристик эритроцитов крыс 3-й группы (введение экстракта) относительно контрольных значений отмечается отсутствие достоверных различий. В то же время при сравнении изученных параметров с таковыми во 2-й группе (ГХС без экстракта) прослеживаются отличия с высокой степенью достоверности. Так, СДЭ составлял 6,19±0,03 мкм, а СОЭр - 47,88±1,72 мкм3 по сравнению с 8,50±0,02 мкм и 122,82±1,55 мкм3 (р<0,01-0,001), соответственно.

При исследовании осмотической резистентности эритроцитов у животных 3-й группы отмечался сдвиг границ периода до завершения гемолиза. Так, начало гемолиза происходило при 0,40±0,01% NaCl (0,35±0,01% во 2-й группе; р<0,01) и завершение при 0,35±0,01% NaCl (0,30±0,01% во 2-й группе; р<0,01). Следует отметить более высокий уровень общих фосфолипидов в мембране эритроцитов животных 3-й группы, чем таковой во 2-й группе (62,38±1,54% против 47,67±1,72%; р<0,001), что обусловило уменьшение коэффициента ХС/ФЛ до 0,38±0,02 по сравнению с 0,59±0,02 во 2-й группе (р<0,001).

При анализе величин холестерина в мембранах эритроцитов животных 3-й группы отмечалась тенденция к нормализации этого показателя, который составлял 23,88±0,82% (в контроле 22,61±0,68%; р<0,01). В то же время по сравнению со 2-й группой количество ХС снизилось на 16,06%. То есть, введение экстракта сопровождается снижением уровня холестерина в мембранах эритроцитов.

Таким образом, применение экстракта из туники асцидии пурпурной в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии способствует нормализации физиологических показателей клеток крови: размерные характеристики эритроцитов практически не отличались от контрольных величин, что обусловлено снижением уровня холестерина в мембране. Это, в свою очередь, указывает на повышение эластических свойств мембран эритроцитов, что отражается на расширении границы осмотической устойчивости к гемолизирующему агенту.

Математический анализ показал прямую корреляционную зависимость между достоверным увеличением СДЭ и холестерина, СОЭр и холестерина. При этом между изменениями размерных характеристик и содержанием общих фосфолипидов наблюдалась обратная корреляционная зависимость.

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать экстракт из туники асцидии пурпурной в качестве эффективного профилактического средства при нарушении липидного обмена в организме.

Работа поддержана Российским научным фондом, проект № 14-50-00034

Список использованной литературы

1. Гольдберг Д.И., Гольдберг Е.Д., Шубин Н.Г. Гематология животных. -Томск, 1973. - 100 с.

2. Усатенко М.С., Берлин Г.И. Активность и изоферментный состав лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в сыворотке крови детей с гемолитической болезнью // Вопр. мед. химии. - 1979. - № 1. - С. 59-62.

3. Фоменко С.Е., Кушнерова Н.Ф., Лесникова Л.Н. Экспериментальная оценка эффективности репарации мембран эритроцитов экстрактом из туники асцидии пурпурной при интоксикации четыреххлористым углеродом // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, № 10. - С. 65-71.

4. Эндрю Б.Л. Экспериментальная физиология. - М.: Мир, 1972. - 324 с.

5. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue // Biol. Chem. - 1957. - Vol. 226. - P. 497-509.

6. Lee C.Y., Kim K.C., Park H.W. et al. Reological properties of erythrocytes from male hypercholesterolemia // Microvasc. Res. - 2004. - Vol. 67, N. 2. - P. 133-138.

Текст научной работы на тему «Влияние экстракта из туники асцидии пурпурной на функциональные свойства эритроцитов при гиперхолестеринемии»