CC BY
64
Re R. [et al.]//Free Radic. Biol. Med.-1999.-Vol.26.-P.1231-1237.
13. Influence of a series of natural flavonoids on free-radical generating systems and oxidative stress Text]/Sanz M.J. [et al.]//Xenobiotica.-1994.-Vol.24.-P.689-699.
14. Serum cholesterol levels in college students: opportunities for education and intervention [Text]/ P.B.Sparling, T.K.Snow//J.American College Health.-1999.-Vol.48-P.123-127.
15. A universal reagent for phospholipids analysis [Text]/V.E.Vaskovsky, E.Y.Kostetsky, I.M.Vasenden//J. Chromatography.-1975.-Vol.114.-P.129-141.
Поступила 12.10.2006
УДК 615.322:582.783.2+616.153 Т.В.Кушнерова
ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ВИНОГРАДА УІШ АИиштК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, Владивосток
РЕЗЮМЕ
Приведены данные по изучению мембранопротекторного действия биологически активной добавки «Диприм», выделенной из винограда. Исследованы физиологические характеристики (объем, диаметр, осмотическая резистентность) и содержание фракций нейтральных липидов, фосфолипидов и жирных кислот в эритроцитах крыс, находящихся в условиях гиперхолестеринового рациона. Показано, что гиперхолестеринемия сопровождалась увеличением объема и осмотической резистентности эритроцитов, коэффициента ХС/ФЛ, количества холестерина, сфингомелина, лизофракций фосфолипидов, насыщенных жирных кислот, а также снижением уровня эфиров холестерина, фосфатидной кислоты и полинена-сыщенных жирных кислот. При введении диприма отмечалась нормализация изученных параметров эритроцитов.
SUMMARY
T.V.Kushnerova
APPLICATION OF THE EXTRACT FROM GRAPES (VITIS AMURENSIS) AT EXPERIMENTAL HYPERCHOLESTERINEMIA
The data cited on studying of membrane protecting activity of biologically active food supplement «Diprim», secured from grape. It were studied the physiological characteristics (volume, diameter, osmotic resistance) and the fractions pattern of the neutral lipids, phospholipids and fatty acids in rats erythrocytes of the animals that are being at conditions of hypercholesteric diet. It is shown, that the hypercholesterolemia was accompanied by a volumetric gain and osmotic resistance of erythrocytes, increasing of cholesterol/phospholipids ratio, amount of cholesterol, sphingomyelin, phospholipids lysofrac-
tions, saturated fatty acids, and also with reducing of cholesterol ethers, phosphatidic acid and polyunsaturated fatty acids. At administration of Diprim it was observed the normalization of the studied parameters of erythrocytes.
Г иперхолестериновый рацион является одной из распространенных экспериментальных моделей формирования гиперхолестеринемии, при которой происходит встраивание холестерина из липопро-теинов в мембрану эритроцитов [6]. Перегруженность эритроцитарной мембраны холестерином может приводить к нарушению функции эритроцитов вследствие изменения физических свойств мембраны и активности мембраносвязанных ферментов (Na+-K+-АТФ-азы, Mg2+-АТФ-азы, аденилатциклазы и ацетилхолинэстеразы), изменения проницаемости мембраны [12], снижения скорости переноса кислорода [13]. Также увеличиваются размеры эритроцитов и изменяется форма (превращение двояковогнутых дисков в сфероциты) с резким снижением их фильтрационной способности. Наличие больших эритроцитов служит надежным признаком атеросклеротического процесса. Все это может привести к затруднению движения по микроциркуляторному руслу и нарушению процессов переноса кислорода, то есть быть причиной возникновения ишемических состояний.
В настоящее время установлено, что растительные полифенолы обладают выраженным гипохолестерине-мическим действием за счет активации фермента лецитин: холестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) [3]. Следовательно, целесообразно использовать растительные препараты и биологически активные добавки (БАД), содержащие флавоноиды (полифенольные структуры). В связи с этим была создана и предлагается к употреблению биологически активная до- бавка к пище «Диприм» (cвидетельство на товарный знак - RU №228327 и En №225516), выделенная из отходов от переработки винограда Амурского (Vitis Amurensis Rupr.). Запатентована как БАД к пище (варианты) (патент RU №2199249).
БАД включает широкий диапазон полифенольных соединений: катехины, лейкоантоцианы, флавонолы, процианидины, олигомерные таннины и лигнин.
Целью работы явилось использование БАД «Диприм» из винограда для коррекции липидных нарушений в эритроцитах.
Материалы и методы
В мазках крови, окрашенных азур-эозиновой смесью, с помощью окуляр-микрометра определяли диаметр эритроцитов (мкм). Средний объем эритроцита (СОЭр) и средний диаметр эритроцита (СДЭ) -по методу Д.И. Гольдберг и др. [4], осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) - традиционным способом. Эритроциты выделяли по методу М.С. Усатенко и Г.И. Берлина [8]. Экстракты общих липидов из эритроцитов готовили по методу I. Ро1сИ й а1. [10]. Фракционное разделение фосфолипидов и их количественное определение осуществляли методом двумерной тонкослойной хроматографии [15]. Хроматографическое распределение нейтральных липидов и их количественное определение проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии [9]. Для определения жирнокислотного спектра экстракты подвергали метанолизу с хлористым ацетилом [5]. Эфиры жирных кислот анализировали на хроматографе «Биохром» с плазменно-ионизационным детектором. Жирные кислоты идентифицировали двумя способами: путем сравнения удерживаемых объемов в исследуемой смеси [1] и с помощью стандартных препаратов метиловых эфиров жирных кислот (С16-С24). Результаты выражали в процентах от сум-мых всех фракций.
В эксперименте использовали белых крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Экспериментальную гиперхолестеринемию вызывали в течение 6 недель введением в рацион животных повышенного содержания насыщенных жиров (растительное сало 25% от веса рациона), включающих 2,5% холестерина [7]. Диприм вводили перорально в дозе 100 мг/кг массы животных что является рекомендуемой суточной дозой для полифенольных соединений [2]. Животные были разделены на 3 группы по 10 крыс в каждой: 1 -я группа - контроль (интактные, стандартный рацион); 2-я группа - гиперхолестери-новый рацион; 3-я группа - гиперхолестериновый рацион +диприм.
Результаты и обсуждение
Гиперхолестериновый рацион вызвал формирование типичной картины гиперхолестеринемии, при которой в крови уровень холестерина (ХС) возрос в 2 раза (2,56±0,05 ммоль/л против 1,29±0,02 ммоль/л в контроле; р<0,001). Изучение размерных характеристик эритроцитов показало, что при гиперхолестери-немии происходит увеличение СДЭ на 37% (р<0,001), что составило 8,50±0,02 мкм по сравнению с 6,21±0,05 мкм в контроле. Так же увеличился СОЭр
(до 122,82±1,55 мкм3; в контроле - 47,89±1,35 мкм3; р<0,001), что определяет развитие макроцитоза. При этом начало и окончание гемолиза эритроцитов происходило позже, чем у контрольных крыс - начало при концентрации №СЬ 0,35±0,01%, а окончание -при 0,30±0,01%. В контроле начало гемолиза происходило при 0,40±0,01%, а окончание - при 0,35±0,01% №СЬ. Гиперхолестеринемия сопровождалась снижением количества общих фосфолипидов до 47,67±1,72%, что на 25% (р<0,001) меньше контрольных значений (63,57±1,78%). Исследование уровня холестерина в эритроцитах показало, что его содержание на 26% (р<0,01) превышало контрольный уровень и составляло 28,45±0,89% по сравнению с 22,61±0,68% в контроле. В связи с этим увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,59±0,02 (в контроле 0,36±0,01; р<0,001).
Обращает внимание значительное увеличение уровня триацилглицеринов (ТАГ) до 23,36±0,94% и свободных жирных кислот (СЖК) до 16,85±0,57%, что на 28% (р<0,001) выше контрольных величин (табл. 1).
Таблица 1
Содержание нейтральные липидов в эритроцитах крыс при гиперхолестеринемии и введении экстракта из винограда (диприм) (в % от суммы всех фракций, М+м)
Нейтраль- ные липиды 1 группа 2 группа 3 группа
ТАГ 18,29+0,49 23,36+0,94*** ***17,73+0,76
СЖК 13,19+0,19 16,85+0,57*** **14,86+0,32***
ЭЖК 18,52+0,52 13,33+0,68*** ***17,45+0,59
ХС 22,61+0,68 28,45+0,89*** ж ж 24,11+0,71
ЭХС 16,30+0,66 10,11+0,76*** ***17,70+0,64
Оста- точная фракция 11,09+0,27 7,10+0,23 11,15+0,49
Примечание: здесь и в табл. 2 - р<0,05; -
р<0,01; - р<0,001; звездочки справа - сравнение с
контролем; слева - со 2-й группой.
Одновременно уменьшилось содержание эфиров жирных кислот (ЭЖК) и эфиров холестерина (ЭХС), что составляло 15,33±0,68% и 10,11±0,76% по сравнению с 18,52±0,52% и 16,3±0,66% в кон-троле.При исследовании фосфолипидного спектра эритроцитов (табл. 2) отмечалось достоверное снижение относительно контроля уровня фосфатидилхо-ли на (ФХ) на 11% (р<0,01) при одновременном увеличении уровня сфингомиелина (СМ) на 26% (р<0,05). Значительно увеличилось количество лизо-фосфатидилхолина (ЛФХ) (на 63%; р<0,001) по сравнению с 9,47±0,44% в контроле. Гиперхолестерине-мия сопровождалась снижением количества фосфти-дилинозита (ФИ) до 4,13±0,12% и фосфатидной кислоты (ФК) до 1,3±0,08%, что на 26 и 47% было ниже контроля.
Таблица 2
Содержание фосфолипидных фракций в эритроцитах крыс при гиперхолестеринемии и введении экстракта из винограда (диприм) (в % от суммы всех фракций)
Фракции фосфолипидов 1 группа 2 группа 3 группа
ФХ 37,92+0,67 33,77+0,85** *36,73+0,81
ЛФХ 9,47+0,44 15,44+0,51*** **12,00+0,58*
СМ 9,42+0,75 11,86+0,68* **8,90+0,69
ФЭ 24,63+0,82 23,49+0,87 24,00+0,78
ЛФЭ 6,04+0,36 5,84+0,25 5,95+0,28
ФС 4,46+0,13 4,17+0,20 4,27+0,11
ФИ 5,60+0,11 4,13+0,12*** ***5,65+0,08
ФК 2,46+0,27 1,30+0,08** ***2,50+0,10
В жирнокислотном спектре общих липидов эритроцитов отмечено увеличение суммы насыщенных жирных кислот до 53,5% (в контроле 48,61%) и уменьшение суммы ненасыщенных жирных кислот до 46,5% (в контроле 51,39%). В связи с этим вырос индекс насыщенности до 1,15 (в контроле 0,94). Причем, среди насыщенных жирных кислот следует отметить увеличение количества 16:0 (33,62±0,74% против 30,39±0,83% в контроле; р<0,05) и 18:0 (19,13±0,36% против 17,61±0,57% в контроле; р<0,05). В ряду мононенасыщенных жирных кислот достоверно увеличилось количество 16:1 (2,0±0,15% против 1,57±0,07% в контроле; р<0,001). Среди по-линенасыщенных жирных кислот (ПНЖК) обращает внимание достоверное снижение количества жирных кислот, являющихся основой для синтеза кислот семейств п-6 (18:2) и п-3 (18:3). В семействе п-6 это18:2 (9,03±0,27% против 10,22±0,30% в контроле), 20:3 (0,42±0,04% против 0,63±0,09%; р<0,05), 20:4
(15,18±0,47% против 17,47±0,76%; р<0,05) и 22:4 (1,39±0,03% против 1,83±0,02% в контроле; р<0,001). В семействе п-3 это 18:3 (0,14±0,002% против 0,18±0,006% в контроле; р<0,001), 20:5 (2,34±0,04% против 2,59±0,07% в контроле; р<0,01) и 22:6 (2,86±0,07% против 5,19±0,12% в контроле; р<0,001).
Таким образом, введение в рацион больших количеств насыщенного жира (50% по калорийности) и ХС (2,5%) меняет соотношение липидных структур в мембране эритроцитов по сравнению с нормой. Эти изменения обусловливают увеличение размерных физиологических характеристик эритроцитов: СДЭ и СОЭр за счет увеличения ХС, ТАГ, СМ, насыщенных жирных кислот. В связи с этим увеличивается осмотическая резистентность эритроцитов к гемолизи-рующему агенту, что предполагает увеличение плотности и жесткости мембран, снижение их фильтрационной способности.
При сравнении размерных характеристик эритроцитов крыс 3-й группы (ГХС+диприм) относительно контрольных значений отмечается нормализация исследованных показателей. В то же время при сравнении изученных параметров с таковыми во 2-й группе (рацион без препарата) прослеживаются отличия с высокой степенью достоверности. Так, СДЭ составлял 6,19±0,03 мкм, а СОЭр - 47,88±1,72 мкм3
по сравнению с 8,50±0,02 мкм и 122,82±1,55 мкм (р<0,01-0,001), соответственно, при гиперхолестери-немии.
Осмотическая резистентность эритроцитов имела более широкие границы устойчивости, чем таковые во 2-й группе, и составляла 0,40±0,01% NaCL при начале гемолиза (0,35±0,01% во 2-й группе; р<0,01) и 0,35±0,01% NaCL при его завершении (0,30±0,01% во 2-й группе; р<0,01). Следовательно, диприм не только восстановил устойчивость мембран к снижению концентрации NaC1, но и расширил границы осмотической резистентности.
В эритроцитах 3 -й группы животных отмечался более высокий уровень общих фосфолипидов, чем таковой во 2-й группе (63,52±1,63% против 47,67±1,72%; р<0,001), что обусловило уменьшение-коэффициента ХС/ФЛ до 0,38±0,02 по сравнению с
0,59±0,02 во 2-й группе (р<0,001).
При введении диприма одновременно с гиперхо-лестериновым рационом (3-я группа) обращает внимание факт снижения ХС до 24,11+0,71% и увеличения ЭХС до 17,70+0,64% по сравнению с таковыми во 2-й группе (р<0,001). Данный феномен обусловлен активацией фермента лецитин-холестерин-ацил-
трансферазы (ЛХАТ) полифенолами диприма [3] и, соответственно, насыщением липопротеинов эфирами холестерина. Следует отметить сохраняющийся повышенный уровень СЖК (14,86+0,32%), что обусловлено рационом с высоким содержанием насыщенных жирных кислот. При сравнении количественных показателей других фракций нейтральных липидов с таковыми во 2-й группе прослеживается выраженный гипотриглицеридемическом эффект диприма (величина ТАГ составляла 17,73±0,76%).
Анализ фосфолипидного спектра показал восстановление фракционного состава до контрольных значений, за исключением ЛФХ, величина которого была выше на 27% (р<0,001). В то же время, при сравнении со 2-й группой отмечались достоверные различия по ряду показателей.
Так, действие диприма сопровождалось ростом уровня ФХ до 36,73±0,81% (р<0,001) и снижением ЛФХ и СМ, соответственно, до 12,00±0,58% и 8,90±0,69%.
Обращают внимание более высокие величины ФИ (5,65±0,08%) и ФК (2,50±0,10%). По-видимому, под действием диприма активируется синтез фосфолипидов из ТАГ для восстановления структуры мембран. Важно отметить достоверное снижение уровня ли-зофракций (ЛФХ и ЛФЭ), что свидетельствует об ингибировании фосфолипаз полифенолами экстракта [14]. Данный вывод согласуется с отмеченным выше снижением концентрации СЖК и ТАГ.
При сравнении величины жирных кислот общих липидов эритроцитов крыс в 3-й группе с таковыми у контрольных животных прослеживается высокая сходимость результатов. Однако при сравнении показателей 3-й и 2-й групп были выявлены статистически достоверные различия по ряду показателей. Так, сумма насыщенных жирных кислот составляла 49,70% (во 2-й группе 53,5%), а сумма полиненасы-щенных жирных кислот - 50,30% (во 2-й группе 46,5%). Эти изменения способствовали снижению индекса насыщенности до 0,99 (во 2-й группе 1,15). Снижение суммы насыщенных жирных кислот обусловлено уменьшением доли 14:0 (0,60±0,05%;
р<0,05) и 16:0 (31,01±0,89%; р<0,05). Заметна тенденция к снижению количества 18:0 (18,12±0,85%). Уменьшилось количество моноеновых кислот за счет 16:1 (1,65±0,08%; р<0,05). Характерно отметить, что величины эссенциальных жирных кислот (18:2 семейства п-6 и 18:3 семейства п-3) остались на уровне таковых во 2-й группе, так как в рационе преобладали насыщенные жирные кислоты. В то же время прослеживается увеличение количества жирных кислот относительно 2-й группы, которые составляют каскад семейства п-6 и п-3. Так, возросло количество кислот, синтезируемых из 18:2. Это 20:3 (0,68±0,04%;
р<0,001), 20:4 (17,15±0,66; р<0,05) и 22:4
(1,81±0,02%; р<0,001). Также увеличилось количество жирных кислот, которые синтезируются из 18:3. Это 20:5 (2,53±0,01%; р<0,001) и 22:6 (4,90±0,11; р<0,001). При суммировании ПНЖК семейства п-6 и ПНЖК семейства п-3 обращает внимание тот факт, что полученные суммы значительно приблизились к таковым в контроле (соответственно, 28,74% и 7,58% против 30,15% и 7,96%), тогда как во 2-й группе эти величины составляли 26,02% и 5,34%. Данный феномен обусловлен активацией полифенолами реакций десатурации и элонгации жирных кислот [11].
Сопоставляя полученные результаты и оценивая позитивный эффект применения экстракта из винограда, следует отметить его высокий потекторный эффект в условиях гиперхолестеринемии. Данный феномен объясняется тем, что молекулы полифенолов активируют фермент 7а-холестерингидрокси-лазу, участвующий в окислении ХС в желчные кислоты, а также ЛХАТ [3], что обусловливает выведение холестерина из мембран и поступление в гепато-цит возросшего потока холестерина в этерифициро-ванной форме в составе липопротеинов высокой плотности.
Таким образом, введение диприма сопровождается гипохолестеринемическим эффектом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Г азовая хроматография в биохимии
[Текст]/Г.Берчфилд, Э.Сторрс; пер. с англ.-М.: Мир, 1964.-620 с.
2. Доклиническое изучение гепатозащитных
средств [Текст]/А.И.Венгеровский, И.В.Маркова, А.С.Саратиков//Ведомости фарм. комитета.-1999.-
№2.-С.9-12.
3. Изменение скорости лецитин:холестерин-ацилтрансферазной реакции и липидных показателей сыворотки крови под влиянием катергена в условиях острого экспериметального перерождения печени [Текст]/Т.К.Гаскина, С.А.Курилович, В.Н.Горчаков //Вопр. мед. химии.-1989.-Т.35, №4.-С.24-28.
4. Гематология животных [Текст]/Д.И. Гольдберг, Е.Д.Гольдберг, Н.Г.Шубин.-Томск, 1973.-100 с.
5. Техника липидологии [Текст]/М.Кейтс.-М.: Мир, 1975.-221с.
6. Пищевые детерминанты липидного состава биологических мембран [Текст]/М.М.Левачев//Вестн. АМН СССР.-1986.-№11.-С.15-21.
7. О методике первичного отбора средств,
влияющих на обмен холестерина
[Текст]/К.А.Мещерская, Г.П.Бородина, Н.П.Короле-ва//Лаб. дело.-1979.-№1.-С.53-57.
8. Активность и изоферментный состав лактат-дегидрогеназы и малатдегидрогеназы в сыворотке крови детей с гемолитической болезнью [Текст]/М.С.Усатенко, Г.И.Берлин//Вопр. мед. химии.-1979.-№1.-С.59-62.
9. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography [Text]/ J.S.Amenta.//J. Lipid. Res.-1964.-Vol.5, №2.-P.270-272.
10. .A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue [Text]/j.Folch, M.Less, G.H.Sloane-Stanley [Text]//Biol. Chem.-1957.-Vol.226.-P.497-509.
11. Effect of flavonoids on arachidonic acid metabolism and prostacyclin (PGI2) formation in human vascular endothelial cells [Text]/H.Khaza'ai, K.W.Wahle //Biochem. Soc. Trans.-1996.-Vol. 24,№2.-P.173S.
12. Damage to the structure of erythrocyte plasma membrane in patients with type-2 hypercholesterolemia [Text]/Koter M. [et al.]//Int. J. Biochem. Cell Biol.-2004.-Vol.36, №2.-P.205-215.
13. Reological properties of erythrocytes from male hypercholesterolemia [Text]/Lee C.Y. [et al.]//Microvasc. Res.-2004.-Vol.67, №.2.-P.133-138.
14. Flavonoids as phospholipase A2 inhibitors: importance of their structure for selective inhibition of group II phospholipase A2 [Text]/M.Lindahl, C.Tages-son//Inflammation. -1997.-Vol.21, №3.-P.347-356.
15. A universal reagent for phospholid analysis [Text]/V.E.Vaskovsky, E.Y.Kostetsky, I.M.Vasenden//J. Chromatography.-1975.-Vol.114 , №1.-P.129-141.
Поступила 12.10.2006
