CC BY
45
УДК 579.841:577.15
УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ ЕТАПОЛАНУ НА ЕТАНОЛІ
Т. П. Пирог Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ
Ю. В. Корж E-mail: tapirog@usuft.kiev.ua
Визначено особливості енергетичного й конструктивного метаболізму С2-субстратів у Acinetobacter sp. В-7005 — продуцента екзополісахариду етаполану, виявлено сайти метаболічного лімітування і розроблено підходи до їх усунення.
Показано, що «вузьким» місцем метаболізму етанолу в Acinetobacter sp. В-7005 є асиміляція ацетату: реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою, є швидкістьлімітувальною. Встановлено умови культивування бактерій, що дають змогу усунути лімітування С2-метаболізму і підвищити у три рази активність ацетил-КоА-синтетази.
За таких умов синтезується високоацильований етаполан зі ступенем ацилювання 3-15%. Середня молекулярна маса полісахариду становить 1,5 млн. і не змінюється у процесі виділення й очищення препарату. Підвищений вміст жирних кислот і висока молекулярна маса етаполану зумовлюють поліпшення реологічних властивостей його розчинів, що визначають практичну значущість цього полісахариду.
Ключові слова: екзополісахариди, біосинтез, метаболізм етанолу, регуляція С2-метаболізму, фізико-хімічні властивості.
Мікробні екзополісахариди (ЕПС) викликають великий інтерес у дослідників завдяки унікальним фізико-хімічним властивостям цих полімерів, що визначають їх використання у нафтодобувній, харчовій, хімічній промисловості, сільському господарстві, медицині.
Acinetobacter ер. В-7005 є продуцентом комплексного екзополісахариду, названого нами етаполаном [1]. На основі етаполану розроблено спосіб ізоляції припливу пластових вод, який дає змогу в разі застосування 1 т етаполану видобути додатково близько 240 т нафти та знизити її обводнення з 84 до 15%. З використанням етаполану як головної складової частини розроблено технології виготовлення косметичних кремів під загальною назвою «Екол», технічного мийного засобу БІМС-1. Встановлено можливість і доцільність застосування етаполану під час виробництва хліба та хлібопродуктів. Завдяки спроможності етаполану адсорбувати та виводити з організму солі важких металів його рекомендовано для профілактичного харчування [1].
Етаполан складається з нейтрального (мінорний компонент) і двох кислих полісахаридів, один з яких є ацильованим. Ацильо-ваний і неацильований полісахариди ідентичні за молярним співвідношенням О-глюкози, О-манози, О-галактози, L-рам-
нози, О-глюкуронової і піровиноградної кислот (3:2:1:1:1:1) та структурою повторюваної ланки вуглеводного ланцюга. Різниця між цими ЕПС полягає в тому, що ацильова-ний полісахарид містить жирні кислоти (С12-С18) [1].
Глюкуронова й піровиноградна кислоти є бічними замісниками повторюваної ланки вуглеводного ланцюга, з’єднаними із залишками рамнози і манози, відповідно. Залежно від умов культивування продуцента у складі етаполану міститься 25-35% мінеральних компонентів (одновалентних катіонів). Наявність мінеральних компонентів у складі етаполану зумовлена структуруванням цього ЕПС у процесі його біосинтезу катіонами, що містяться в середовищі культивування продуцента [1]. Реологічні властивості розчинів етаполану, що визначають його практичну значущість (здатність до емульгування, підвищення в’язкості за присутності одно- і двовалентних катіонів у разі зниження рН, за низьких швидкостей зсуву, у системі Си2+-гліцин), залежить від співвідношення у його складі ацильованих і неацильованих компонентів, а також від співвідношення жирних кислот в ацильованому полісахариді [1].
Слід зазначити, що сукупність таких реологічних властивостей не характерна для жодного з відомих мікробних полісахаридів.
Окрім того, для синтезу етаполану може бути використаний широкий набір вуглецевих субстратів (у тому числі й невуглеводних), тимчасом як інші відомі полісахариди одержують тільки на основі вуглеводної сировини.
Здатність до синтезу ЕПС виявлено у багатьох мікроорганізмів, проте рівень синтезу цих полімерів коливається в широких межах як для різних продуцентів ЕПС, так і для одного продуцента в різних умовах його культивування. Створення високоефективних технологій одержання практично важливих метаболітів базується на цілеспрямованій регуляції процесу біосинтезу, що у свою чергу потребує глибоких знань фізіології, біохімії та генетики продуцентів.
Відомо, що в послідовності метаболічних реакцій, пов’язаних з утворенням ключових інтермедіатів, існують лімітувальні реакції, швидкість яких нижча від інших або які супроводжуються великою витратою енергії чи втратою вуглецю субстрату. Виявлення таких сайтів метаболічного лімітування та розроблення на основі знань принципів регуляції метаболізму дасть змогу реалізувати біотехнологічні процеси з найвищою ефективністю.
Мета роботи полягала у визначенні шляхів регуляції різних ланок метаболізму у процесі вирощування штамів Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) на С2-субстра-тах для вдосконалення процесу біосинтезу ЕПС етаполану.
Матеріали і методи
Об’єкти досліджень. О’єктом досліджень був штам Acinetobacter sp. — продуцент комплексного екзополісахаридного препарату етаполану [2], депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером В-7005, а також мутантний штам Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, який було одержано з вихідного за допомогою нітро-зогуанідинового мутагенезу [3].
Культивування Acinetobacter sp. В-7005. Культивування бактерій здійснювали в колбах на качалці (220 об/хв) при 30 °С, рН 6,8-7,0, упродовж 16-120 год на рідких мінеральних середовищах такого складу (г/л): середовище 1: KH2PO4 — 6,8; NaOH — 0,9; NaCl — 1,05; NH4NO3 — 0,6; MgSO4 • 7H2O — 0,4; CaCl2 • 2H2O — 0,1; FeSO4 • 7H2O — 0,01; середовище 2: KH2PO4 — 6,8; KOH — 1,8; KCl — 1,4; NH4NO3 — 0,6; MgSO4 • 7H2O — 0,4; CaCl2 • 2H2O — 0,1; FeSO4 7H2O — 0,01; середовище 3: KH2PO4 — 3,4; KOH — 0,9;
N^N03 — 0,3; Мя804 • 7Н20 — 0,4; СаС12 • 2Н20 — 0,1; FeS04 • 7Н20 — 0,01; середовище 4: КН2Р04 — 3,4; КОН — 0,9; КС1 — 4,4; NH4N03 — 0,6; Мя804 • 7Н20 — 0,4; СаС12 • 2Н20 — 0,1; FeS04 • 7Н20 — 0,01; середовище 5: КН2Р04 — 1,7; КОН — 0,45; NH4N03 — 0,3; Мя804 • 7Н20 — 0,4; СаС12 • 2Н20 — 0,1; FeS04 • 7Н20 — 0,01; середовище 6: КН2Р04 — 2,0; КОН — 0,55; КС1 — 5,6; NH4N03 — 0,6; Мя804 • 7Н20 — 0,4; СаС12 • 2Н20 — 0,1; FeS04 • 7Н20 — 0,01. Середовища різнилися між собою молярністю фосфатного буфера, загальною кількістю солей, наявністю №+, концентрацією одновалентних катіонів. Так, молярність буфера становила (М): середовища 1 і 2 — 0,05; 3 і 4 — 0,025; 5 і 6 — 0,0125. У середовища додатково вносили 0,5% (об’ємна частка) дріжджового автолі-зату та 0,006-0,009 % пантотенату кальцію (вітамін В5). Штами В-7005 і В-7005 (1НГ) є ауксотрофами за цим вітаміном [2,3], який є попередником коензиму А. Джерелом вуглецю та енергії слугував етанол у концентрації 1% (об’ємна частка).
Як посівний матеріал використовували культуру з експоненційної фази росту (1624 год), вирощену на мінеральних середовищах 1^6 із різними джерелами вуглецю. Джерелом вуглецю та енергії у процесі одержання посівного матеріалу і біосинтезу ЕПС були: а) 0,5 % етанолу (об’ємна частка); б) 1% етанолу (об’ємна частка) за наявності або відсутності ацетату калію (0,1% або
0,01%); в) 1,6% ацетату калію. Кількість посівного матеріалу становила 5% від об’єму середовища.
Ензиматичні аналізи. Визначення активності ферментів здійснювали в безклі-тинних екстрактах. Одержання безклітин-них екстрактів проводили як описано в роботі [4].
Ключові ферменти С2-метаболізму та гліоксилатного циклу. Активність алко-гольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1), ацетальде-гіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4), ацетил-КоА-синтетази (КФ 6.2.1.1), ізоцит-ратліази (КФ 4.1.3.1) та малатсинтази (КФ
4.1.3.2) визначали як описано в роботі [4].
Ферменти циклу трикарбонових кислот. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7) аналізували за зниженням концентрації ацетилфосфату у присутності коензиму А та оксалоацетату, як описано в роботі [5]. Активність аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3) [6] встановлювали в присутності цис-аконітату за відновленням НАДФ+ при 340 нм. Активність ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41) [7], малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37) [8]
визначали за відновленням НАД+, а ізоцит-ратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42) [5], малат-дегідрогенази (КФ 1.1.1.82) [9] — за відновленням НАДФ+ при 340 нм у присутності ізоцитрату чи малату, відповідно. Активність 2-оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2) [10] встановлювали за відновленням НАД+ при 340 нм у присутності 2-оксоглутарату та коензиму А, сукцинатдегідрогенази (КФ
1.3.99.1) [6] - за відновленням дихлорфе-ноліндофенолу в присутності феназинмета-сульфату при 600 нм, фумарази (КФ
4.2.1.2) — за утворенням фумарату з малату при 250 нм [5].
Активність ключових ферментів глю-конеогенезу та деяких біосинтетичних шляхів. Активність фосфоенолпіруватсин-тетази (КФ 2.7.9.2) [11] аналізували колориметрично за зниженням концентрації пірувату в реакційній суміші (реакція з динітрофе-нілгідразином) при 445 нм [11], фосфо-енолпіруваткарбоксикінази (КФ 4.1.1.49)
[12], оксалоацетатдекарбоксилази (КФ
4.1.1.3) [6] — за утворенням фосфоенолпіру-вату (ФЕП) та пірувату при окисненні НАДН, а глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4)
[13] — за утворенням глутамату при окис-ненні НАДФН і 340 нм. Активність глута-матдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) [14] встановлювали за відновленням НАД+ при 340 нм у присутності 2-оксоглутарату.
Активність ферментів у безклітинних екстрактах визначали при температурі 2830 0С, що є оптимальною для росту даних бактерій, та виражали у нмольхв-1мг-1 білка. Вміст білка в безклітинних екстрактах установлювали за Bradford [15].
Визначення швидкості окиснення субстратів (етанолу, ацетальдегіду й ацетату) інтактними клітинами Acinetobacter sp. В-7005 та В-7005 (1НГ) проводили як описано в роботі [4].
Встановлення складу і фізико-хіміч-них властивостей етаполану. Комплексний полісахаридний препарат етаполан виділяли з культуральної рідини осадженням ізопро-панолом після попереднього відокремлення клітин продуцента та діалізу [1]. Розділення етаполану на ацильований і неацильований компоненти здійснювали за розробленим раніше методом [16]. Для дезацилювання проводили оброблення ЕПС КаОН у присутності КаВН4. Вміст вуглеводів в ЕПС визначали колориметричним методом за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою [17], піровиноградної кислоти — за реакцією з 2,4-диніт-рофенілгідразином [18], уронових кислот — за реакцією з карбазолом [19], жирних кис-
лот — ваговим методом після дезацилюван-ня розчинів ЕПС [16]. Встановлення вмісту мінеральних компонентів у складі етаполану здійснювали, обробляючи його катіонітом КУ-2-8 (Н+). Вміст нейтральних моносахаридів визначали за допомогою вуглеводного аналізатора Biotronik LC-2000 [1], а молекулярно-масовий склад ЕПС — методом аналітичного градієнтного центрифугування в розчині хлористого натрію [20]. Як стандарти молекулярних мас використовували декстрани фірми Fluka із молекулярною масою 13,5; 20; 40; 70; 110; 500 тис. і 2 млн. Вміст вуглеводнів в отриманих після центрифугування фракціях (об’єм 1 мл) встановлювали за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою.
Вміст компонентів певної молекулярної маси обчислювали, визначаючи кількість вуглеводів у відповідних фракціях, і виражали в процентах до вихідної (загальної) кількості вуглеводів. Знаючи процентний вміст у складі ЕПС компонентів різної молекулярної маси, розраховували середню молекулярну масу.
Властивості розчинів етаполану оцінювали за відносною зміною їхньої в’язкості у присутності 0,1 М KCl, рН 4-4,5 (за умови переведення ЕПС в Н+-форму), у системі ^^-гліцин. Відносну зміну в’язкості визначали за формулою:
П ~П° -100%,
П0
де п1 — в’язкість розчину ЕПС у досліджуваних умовах; п2 — в’язкість розчину ЕПС у дистильованій воді.
Результати та обговорення
Вивчення особливостей С2-метаболізму під час росту штамів Acinetobacter sp. В-7005 та В-7005 (1НГ) на етанолі показало, що окиснення етанолу до ацетальдегіду каталізується НАД+-залежною алкогольдегідроге-назою. Акцепторами електронів в ацетальде-гіддегідрогеназній реакції є НАД+ і НАДФ+. З’ясовано, що в Acinetobacter sp. ацетат залучається до метаболізму за участю аце-тил-КоА-синтетази; анаплеротичною послідовністю реакцій, що поповнюють пул С4-дикарбо-нових кислот, є гліоксилатний цикл [21].
Подальші дослідження було спрямовано на визначення активності ферментів циклу трикарбонових кислот (ЦТК) та деяких біосинтетичних шляхів [22]. У безклітинно-му екстракті Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ) виявлено високу активність усіх
ферментів цього циклу (табл. 1). На нашу думку, наявність обох ключових ферментів гліоксилатного циклу, а також висока активність ізоцитрат дегідрогенази, глутамат-дегідрогенази і низька активність 2-оксо-глутаратдегідрогенази є підтвердженням того, що ЦТК в ЛсіпвіоЬасієт ер. В-7005 і В-7005 (1НГ) під час росту на етанолі виконує переважно біосинтетичну роль.
У процесі асиміляції мікроорганізмами дво- або тривуглецевих субстратів або субстратів, катаболізм яких здійснюється через ацетил-КоА чи інтермедіати ЦТК, виникає необхідність синтезу молекул вуглеводів. Ці перетворення відбуваються шляхом глюко-неогенезу. Ензиматичні дослідження показали, що під час росту на етанолі в Лсіпєіо-Ьасієг ер. В-7005 і В-7005 (1НГ) піруват утворюється з оксалоацетату в оксалоаце-татдекарбоксилазній реакції, а в утворенні фосфоенолпірувату беруть участь обидва ключові ферменти глюконеогенезу — ФЕП-карбоксикіназа і ФЕП-синтаза (табл. 1).
Таблиця 1. Активність ферментів циклу трикарбонових кислот та деяких біосинтетичних шляхів у Acinetobacter вр. В-7005 та В-7005 (1НГ)
Фермент Активність, нмоль-хв-1-мг-1 білка
В-7005 В-7005 (1НГ)
Цитратсинтаза 421,3±25,1 405,6±21,6
Аконітаза 340,8±18,0 349,0±19,4
НАД+-залежна ізоцит-ратдегідрогеназа 0 0
НАДФ+-залежна ізоцит-ратдегідрогеназа 729,7±38,5 717,8±33,8
2-Оксоглутаратдегідро- геназа 96,2±4,8 93,4±5,3
Сукцинат дегідрогеназа 183,4±13,9 197,5±15,8
Фумараза 192,1±9,6 186,8±9,9
НАД+-залежна малат-дегідрогеназа 654,2±32,7 643,1±32,1
НАДФ+-залежна малат-дегідрогеназа 81,9±5,1 79,8±4,3
НАД+-залежна глута-матдегідрогеназа 653,9±33,5 642,6±31,8
НАДФ+-залежна глута-матдегідрогеназа 247,3±15,6 257,2±16,3
Оксалоацетатдекар- боксилаза 457,3±28,6 446,6±23,3
Фосфоенолпіруваткар- боксикіназа 58,5±2,9 48,7±3,5
Фосфоенолпіруватсин- тетаза 584,4±32,9 487,0±35,4
Аналіз активності ключових ферментів метаболізму етанолу у процесі культивування Acinetobacter ер. В-7005 на середовищах 1 і 2 показав, що активність ацетил-КоА-синтетази в безклітинному екстракті була в 2,7-5 разів нижчою, ніж активність алкоголь- і ацетальдегіддегідрогеназ (табл. 2). Досліджуючи швидкість окиснення С2-суб-стратів інтактними клітинами Acinetobacter ер. В-7005 (1НГ), вирощеними на середовищах 1 та 2, встановили, що після голодування клітин упродовж 20 год швидкість дихання за присутності етанолу й ацетальдегіду не змінювалась і становила 152,6-157,8 та 153,5-159,4 нмоль О2-хв-1-мг-1 клітин відповідно, а за присутності ацетату знижувалась у 2 і 4 рази на середовищі 2 і середовищі 1, відповідно, порівняно зі швидкістю окис-нення ацетату клітинами, що не голодували.
Таблиця 2. Активність ключових ферментів метаболізму етанолу в процесі культивування Acinetobacter вр. В-7005
Ферменти Активність (нмоль-хв-1-мг-1 білка) під час культивування бактерій
24 год 48 год
НАД+-залежна алко-гольдегідрогеназа 365,7±19,6 289,5±17,5
НАД+-залежна ацет-альдегіддегідрогеназа 119,5±7,6 93,7±6,5
НАДФ+-залежна ацет-альдегіддегідрогеназа 253,7±15,7 197,3±11,3
Ацетил-КоА-синте- таза 135,7±8,7 (74,5±5,2) 134,1±8,7
Ізоцитратліаза 130,0±7,8 (50,5±2,9) 144,9±9,4 (7,4±0,4)
Малатсинтаза 58,2±3,7 67,4±3,7
Примітки: 1. Культивування бактерій здійснювали на середовищі 1 з 0,0006% В5.
2. Для визначення активності ацетил-КоА-син-тетази, ізоцитратліази і малатсинтази бактерії вирощували на середовищі 2 з 0,0009 % В5. У дужках наведено дані культивування штаму на середовищі 1 з 0,0006 % В5.
Отже, під час росту на етанолі в клітинах ЛсіпєіоЬасієг ер. В-7005 і В-7005 (1НГ) ацетат утворюється з вищою швидкістю, ніж залучається до метаболізму. Тому наші наступні дослідження були спрямовані на пошук чинників, що забезпечують однакову швидкість утворення і подальшого метаболізму ацетату в клітинах бактерій у процесі культивування на етанолі.
У результаті ензиматичних і полярографічних досліджень встановлено, що інгібі-
торами ацетил-КоА-синтетази є іони натрію, а також продукти окиснення етанолу й аце-тальдегіду — НАДН і НАДФН; активаторами ферменту є катіони калію і магнію [23].
Виходячи з отриманих результатів ми припустили, що одним із можливих шляхів регуляції метаболізму ацетату в клітинах штамів В-7005 і В-7005 (1НГ) під час росту на етанолі може бути вилучення №+ із середовища культивування і підвищення в ньому концентрації К+ і Мg2+. Для усунення інгібувального впливу інтермедіатів окис-нення етанолу й ацетальдегіду на активність ацетил-КоА-синтетази було знижено початкову концентрацію етанолу в середовищі з подальшим додаванням його частинами у процесі культивування бактерій. Показано, що в разі зниження у два рази концентрації етанолу (до 0,5 %) спостерігалось підвищення швидкості дихання клітин за присутності ацетату, причому її величина практично не відрізнялася від швидкості окиснення етанолу й ацетальдегіду. Окрім того, швидкість окиснення ацетату істотно не змінювалась у процесі тривалого голодування клітин. Слід зазначити, що за початкової концентрації етанолу 0,5 % у середовищі вміст пантотенату кальцію можна було знизити до 0,0006 %, при цьому не було потреби підвищувати концентрацію Mg2+.
У табл. 3 наведено активність ключових ферментів метаболізму етанолу у штаму ЛсіпвіоЬасієт ер. В-7005, вирощеному за різних умов культивування. Встановлено, що зі зниженням початкової концентрації етанолу в середовищі, за відсутності сполук натрію і наявності 100 мМ К+ активність ацетил-КоА-синтетази підвищувалася більш ніж у два рази. За таких умов стала можливою реалізація процесу біосинтезу етаполану на не-забуферених середовищах 4 і 6 (0,025-0,125 М). Отримання аналогічного результату при початковій концентрації етанолу 1,0% забезпечувало підвищення вмісту вітаміну В5 в середовищі до 0,0009%, концентрації Mg2+ — до 5 мМ і катіонів калію — до 100 мМ.
Таким чином, у результаті досліджень регуляції активності ацетил-КоА-синтетази нам вдалось істотно знизити молярність буфера зі збереженням вмісту солей у середовищі культивування, що тільки частково усувало лімітування С2-метаболізму у продуцента етаполану.
Відомо, що ацетил-КоА-синтетаза є інду-цибельним ферментом, індуктором якого є ацетат [24]. У зв’язку із цим ми припустили, що можна повністю зняти лімітування С2-метаболізму внесенням екзогенного аце-
тату в середовище з етанолом або використовуючи посівний матеріал, вирощений на ацетаті чи етанолі у присутності ацетату. Встановлено, що додавання екзогенного ацетату під час одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС дало змогу збільшити у 2,5-3 рази активність ацетил-КоА-синтетази та швидкість дихання за присутності ацетату і реалізувати процес синтезу етаполану на неза-буферених середовищах 3 і 5, в яких загальний вміст солей було знижено у 2 і 4 рази (до 5,1-2,95 г/л) [25].
Умови культивування продуцента впливають не тільки на синтез ЕПС, ай на фізи-ко-хімічні властивості кінцевого продукту [26]. У різних умовах культивування можуть змінюватися хімічний склад ЕПС, їхня молекулярна маса, співвідношення декількох полісахаридів, що впливає на реологічні властивості ЕПС, які визначають практичну значущість цих полімерів. Раніше було з’ясовано, що необхідною умовою для синтезу ацильованого полісахариду є наявність у середовищі культивування продуцента етаполану 100 мМ К+ [1]. Встановлено, що тільки етаполан з високим вмістом ацильованого компонента (>50%) характеризувався сукупністю реологічних властивостей, необхідних для практичного використання. Оскільки вміст К+ у середовищах 3 і 5 становить 40 та 20 мМ відповідно, на наступному етапі досліджували реологічні властивості синтезованого за таких умов етаполану. Згідно з попередніми даними такої концентрації К+ недостатньо для синтезу ацильованого ЕПС з необхідними реологічними властивостями.
Результати дослідження, що їх наведено в табл. 4, свідчать, що ЕПС, синтезовані на середовищах з різним вмістом К+, мають практично однакові реологічні характеристики. Отже, культивування продуцента на незабуференому середовищі з низьким вмістом солей (і катіонів калію) не впливало на властивості синтезованого етаполану. Для з’ясування причин, що зумовлюють це явище, ми детальніше дослідили хімічний склад одержаних полісахаридів.
Встановлено, що незалежно від умов культивування продуцента (вміст мінеральних компонентів, співвідношення С/№ і мо-лярність буфера в середовищі культивування) нативні ЕПС характеризувалися практично однаковим вмістом вуглеводів (44,5-46,7%) та піровиноградної кислоти (3,2-3,7%) (табл. 5). Співвідношення глюкози, манози, галактози та рамнози у складі всіх ЕПС було однаковим і становило 3:2:1:1.
Таблиця 3. Вплив умов культивування Acinetobacter вр. В-7005 на активність ключових ферментів метаболізму етанолу
Умови культивування Активність, нмоль-хв ^мг 1 білка
концентрація В5, % концентрація Hg2+, мМ початкова концентрація етанолу, % НАД+-залежні алкоголь- дегідрогеназа і НАД++НАДФ+-залежна аль-дегіддегідрогена-за ацетил-КоА- синтетаза ізоцит- ратліаза
0,0006 1,6 1,0 354,8±17,7 367,3±21,2 95,0±5,6 98,4±6,3
0,0009 1,6 1,0 349,9±22,9 356,7±24,4 130,9±7,6 130,0±7,9
0,0009 5,0 1,0 359,6±17,9 349,7±24,0 180,9±9,6 185,4±11,8
0,0009 1,6 0,5 265,9±16,1 277,9±15,4 219,8±11,0 225,4±13,8
0,0006 1,6 0,5 279,4±13,9 285,7±19,0 225,3±15,2 230,7±15,5
Примітка. Культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 (у середовищі відсутні сполуки ^+ вміст К+ — 100 мМ).
Таблиця 4. Реологічні властивості 0,03%-х розчинів етаполану, синтезованого за різних умов культивування
Середовище Концентрація К+ у середовищі, мМ В відносне збільшення в’язкості, %
за присутності 0,1 М KCl у системі ^^-гліцин
2 100 325,7±21,0 1400,3±78,0
3 40 480,3±35,2 1865,0±93,2
5 20 315,6± : 18,8 1700,5±100,5
Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середовища 3 і 5 додатково вносили 0,1 % ацетату калію для одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.
Таблиця 5. Хімічний склад нативного і дезацильованого етаполану, синтезованого на середовищах різного складу
Компонентний склад ЕПС ЕПС Вміст складових компонентів (%) в ЕПС, синтезованих на середовищах
1 2 3 5
Вуглеводи нативний 44,5 45,0 46,7 45,9
після дезацилювання 60,0 59,1 58,6 55,7
Піровиноградна кислота нативний 3,3 3,7 3,4 3,2
після дезацилювання 4,8 4,4 4,7 4,8
Уронові кислоти нативний 7,5 7,7 11,4 13,8
після дезацилювання 20,0 22,0 20,6 -
Жирні кислоти нативний 6,5 6,8 8,8 5,9
після дезацилювання 0 0 0 0
Мінеральні компоненти нативний 24,3 28,6 7,2 6,2
після дезацилювання 3,5 3,9 - -
Примітки: 1. Концентрація етанолу 1 %; у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію для одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.
2. « - » — не визначали.
3. Дезацильований ЕПС одержано в результаті лужного оброблення нативного препарату.
Проте полісахариди різнилися за кіль кістю уронових (7,5-13,8 %), жирних (5,9' 8,8%) кислот, мінеральних компонентів (6,2-28,6 %), а також за вмістом ацильованого компонента (70-100 %). Ми припускаємо, що зниження вмісту мінеральних компонентів у складі етаполану, синтезованого на
середовищах 3 і 5, зумовлено зменшенням кількості одновалентних катіонів (зокрема катіонів калію) у цих середовищах. Так, раніше нами було встановлено, що у процесі культивування продуцента етаполану відбувається структурування синтезованих ЕПС катіонами, що містяться у живильному середовищі [1].
Після дезацилювання нативних ЕПС вміст уронових кислот збільшувався у 2-3 рази і становив 20-22 % для всіх досліджуваних полісахаридів (табл. 5). У попередніх роботах було з’ясовано, що реальний вміст уронових кислот у складі нативних ЕПС вдається виявити тільки після їх дезацилю-вання [1]. Підвищення вмісту уронових кислот у цьому разі можна пояснити тим, що під час дезацилювання відбувається дисоціація високомолекулярних конгломератів ЕПС, змінюється конформація поліса-харидних молекул і просторова структура ЕПС, внаслідок чого уронові кислоти стають доступнішими для взаємодії з різними реагентами. Варто зазначити, що після дезаци-лювання у складі етаполану суттєво знижувався вміст мінеральних компонентів. На сьогодні причини, що зумовлюють це явище, залишаються невідомими. На з’ясування цих причин буде спрямовано наші подальші дослідження.
Дослідження молекулярної маси етапо-лану, синтезованого за різних умов культивування, показало, що середня молекулярна маса полісахаридів, одержаних на середовищах 3 та 5, практично не змінювалась у процесі виділення й очищення і становила 1,5 млн. (табл. 6). Це можна пояснити тим, що одержані полісахариди є високоацильованими, а в результаті ацилювання вуглеводного ланцюга формується щільна структура ЕПС, яка залишається без змін у процесі оброблення розчинів етаполану органічними розчинниками. Слід зазначити, що аналіз молекулярно-масового складу етаполану, синтезованого в різних умовах культивування, показав наявність компонентів з молекулярною масою від 13,5 тис. до 2 млн., причому основну масу препарату становили фракції з молекулярною масою понад 2 млн. У попередніх дослідженнях встановлено, що тільки високомолекулярному етапола-ну, у складі якого міститься не більше 35% фракцій з молекулярною масою до 2 млн., притаманні необхідні для практичного використання реологічні властивості [1].
Дослідження реологічних властивостей ЕПС показало, що розчини етаполану, синтезованого на середовищі 5 з 20 мМ К+, на всіх етапах його виділення й очищення характеризувалися вищою в’язкістю у присутності 0,1 М КС1 і в системі Си2+-гліцин (1 200 та 1 500-2 000% відповідно) порівняно з ЕПС, синтезованими на середовищі зі 100 мМ К+ (1 000 та 800-1 000% відповідно).
Таблиця 6. Молекулярна маса етаполану, синтезованого за різних умов культивування
Се- редо- ви- ще Випарений концентрат ЕПС ЕПС після осадження і висушування
середня молекулярна маса, млн. фракції з молекулярною масою до 2 млн., % середня молеку- лярна маса, млн. фракції з молекулярною масою до 2 млн., %
1 1,44 31,7±2,19 0,48 82,7±4,89
2 1,44 29,9±1,92 0,50 71,2±3,56
3 1,61 23,7±1,59 1,54 25,7±1,80
5 1,57 25,4±1,27 1,48 27,8±1,39
Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію для одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.
Таким чином, на основі досліджень особливостей метаболізму у штаму АсіпвіоЬасівг ер. В-7005 і В-7005 (1НГ) визначено шляхи регуляції С2-метаболізму, що уможливило вдосконалення технології біосинтезу етапо-лану на етанолі. Ключовими елементами цієї технології є: відсутність у середовищі культивування катіонів натрію, підвищення в ньому концентрації пантотенату кальцію до 0,0009%, а також наявність 0,1% ацетату калію під час одержання інокуляту і біосинтезу полісахариду. Це дало змогу здійснити без зниження показників синтезу процес одержання етаполану на незабуференому середовищі, в якому вміст солей зменшено в 4 рази (з 11 до 2,95 г/л). За умов усунення лімітування С2-метаболізму молекулярна маса ета-полану становила 1,5 млн. і не знижувалась у процесі його виділення й очищення, а вміст жирних кислот в ацильованому полісахариді досягав 15%. Підвищений вміст жирних кислот у складі етаполану і висока молекулярна маса зумовлюють поліпшення реологічних властивостей, що визначають практичну цінність цього полісахариду.
ЛІТЕРАТУРА
1. Пирог Т. П. Принципы регуляции состава и физико-химических свойств экзополисахаридов,
синтезируемых Acinetobacter sp.: Дисс докт.
биол.наук: 03.00.20.- К., 1999. — 450 с.
2. Гринберг Т. А., Пирог Т. П., Малашенко Ю. Р., Пинчук Г.Э. Микробный синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. — К.: Наук. думка, 1992. — 212 с.
3. Пирог Т. П., Столяр С. М., Малашенко Ю. Р. Получение и исследование мутантных штаммов Acinetobacter sp., не образующих экзополисахариды // Микробиология. — 2000. — Т.60, № 5. — С. 674-680.
4. Пирог Т. П., Кузьмінська Ю. В., Коваленко М. О. Метаболізм С2-С6-субстратів в умовах міксотрофного росту штамів Acinetobacter sp. В-7005 та В-7005 (1НГ) // Укр. біохім. журн. — 2004. — Т.76, № 1. — С. 33-38.
5. O’Brien R. W., Stern J. R. Requirement for sodium in the anaerobic growth of Aerobacter aerogenes on citrate // J. Bacteriol. — 1969. — V.98, N2. — P. 388-393.
6. O’Brien R. W., Geisler J. Citrate metabolism in Aerobacter cloacae // Ibid. — 1974. — V. 119, N3. — P. 661-665.
7. Kornberg A. Isocitric dehydrogenase of yeast (DPN) // Methods in enzymology (Ed. Colowick S.P. and Kaplan N.O.). — New York: Acad. Press, 1955. — V. 1. — P. 707-709.
8.Kitto G.B. Intra- and extramitochondrial malate dehydrogenase from chiken and tuna heart // Methods in enzymology (Ed. Lowenstein J.M.).- New York and London: Acad. Press, 1969. — V. 13. — P. 106- 116.
9. Johnson H.S., Hatch M.D. Properties and regulation of leaf nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate-malate dehydrogenase and «malic» enzyme in plants with the C4-dacarboxylic acid pathway of photosynthesis // Biochem. J. —1970. — V.119, N2. — P. 273-280.
10. Mukherjee B. B., Matthews J., Horney D. L., Reed L.J. Resolution and reconstitution of the Escherichia coli -ketoglutarate dehydrogenase complex // J. Biol. Chem. — 1965. — V. 240, N5. — P. 2268- 2269.
11. Cooper R.A., Cornberg H.L. Phosphoenolpy-ruvate synthetase // Methods in enzymology (Ed. Lowenstein J.M.). - New York: Acad. Press, 1969. — V. 13. — P. 309- 314.
12. Huei-Che Chang, Lane M.D. The enzymatic carboxylation of phosphoenolpyruvate. II. Purification and properties of liver mitochondrial phosphoenolpyruvate carboxykinase // J. Biol. Chem. — 1966. — V. 241, N10. — P. 2413-2420.
13. Martinez-Bilbao M., Martinez A., Urkijo I.et al. Induction, isolation and some properties of the NADPH-dependent glutamate dehydrogenase from the nonheterocystous cyanobac-
terium Phormidium laminosum // J. Bacteriol. — 1988. — V. 170, N10. — P. 4897- 4902.
14. Nakamura I., Ohmura Y., Kamihara T. Effect of thiamin-induced vitamin Bg deficiency on NAD- and NADP-linked glutamate dechydrogenases in Yeast // J. Gen. Microbiol. — 1983. — V. 129, №4. — P. 945-952.
15. Bredford M. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — 72, N3. — P. 248- 254.
16. Пирог Т. П., Гринберг Т. А., Пинчук Г. Э. и др. Разделение экзополисахаридов, синтезируемых Acinetobacter sp., на ацилированный и неацилированный компоненты // Микробиология. — 1994. — Т.63, № 5. — С.840-846.
17. Dubois M., Gilles K., Hamilton J. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. — 1956. — V.28, N3. — P. 350-356.
18. Sloneker J.N., Orentas D. G. Pyruvic acid — a unique component of an exocellular bacterial polysaccharide // Nature. — 1962. — V.194, N4827. — P. 47 8-479.
19. Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acids // J. Biol. Chem. — 1947. — V.167, N1. — P. 189-198.
20. Votselko S. K., Pirog T. P., Malashenko Y. R., Grinberg T.A. A method for determining the mass-molecular composition of microbial exopolysaccharides // Microbiol. Methods. -1993. — V. 18. — P. 349-356.
21. Пирог Т.П., Соколов И.Г., КузьминскаяЮ.В., Малашенко Ю.Р. Некоторые особенности метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды // Микробиология. — 2002. — Т.71, № 2. — С. 222- 229.
22. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Особенности центрального метаболизма штамма Acinetobacter sp, растущего на этаноле // Там же. — 2003. — Т.72, № 4. — С. 459-465.
23. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Регуляция метаболизма ацетата у штамма Acinetobacter sp., растущего на этаноле // Прикл. био-хим. и микробиол. — 2003. — Т. 39, №2. — С. 180-188.
24. Kumari S., Beatty C. M., Browning D. F. et al. Regulation of acetyl coenzyme A synthetase in Escherichia coli // J.Bacteriol. — 2000. — V. 182, N15. — P. 4173-4179.
25. Пирог Т.П., Корж Ю.В. Влияние ацетата на синтез экзополисахарида этаполана при культивировании Acinetobacter sp. В-7005 на среде с этанолом // Мікробіол.журн.-2006. — Т.68, № 5. — С. 12- 19.
26. Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В. Вплив умов культивування мікроорганізмів-проду-центів екзополісахаридів на їхній синтез та фізико-хімічні властивості // Біополімери і клітина. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 393-413.
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ МИКРОБНОГО ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА ЭТАПОЛАНА НА ЭТАНОЛЕ
Т. П. Пирог, Ю. В. Корж
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: tapirog@usuft.kiev.ua
Определены особенности энергетического и конструктивного метаболизма С2-субстратов у Acinetobacter sp. В-7005 — продуцента экзополисахарида этаполана, выявлены сайты метаболического лимитирования и разработаны подходы к их устранению.
Показано, что «узким» местом метаболизма этанола в Acinetobacter sp. В-7005 является ассимиляция ацетата: реакция, катализируемая ацетил-КоА-синтетазой, — скоростьлими-тирующая. Установлены условия культивирования бактерий, позволяющие устранить лимитирование С2-метаболизма и повысить в три раза активность ацетил-КоА-синтетазы.
В таких условиях синтезируется высокоа-цилированный этаполан со степенью ацилиро-вания 3-15%. Средняя молекулярная масса полисахарида составляет 1,5 млн. и не изменяется в процессе выделения и очистки препарата. Повышенное содержание жирных кислот и молекулярная масса этаполана обусловливают улучшение реологических свойств его растворов, определяющих практическую ценность этого полисахарида.
Ключевые слова: экзополисахариды, биосинтез, метаболизм этанола, регуляция С2-метаболизма, физико-химические свойства.
IMPROVEMENT OF BIOTECHNOLOGY OF
MICROBIAL EXOPOLYSACCHARIDE ETHAPOLAN ON ETHANOL
T. P. Pirog, Ju. V. Korzh
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Science of Ukraine, Kiev
E-mail: tapirog@usuft.kiev.ua
The study is devoted to investigating of the basic stages of C2-compounds assimilation in Acinetobacter sp. B-7005, to reveal «bottleneck» of C2-metabolism and to develop of approaches to their removal to improve process of microbial exopolysaccharide ethapolan synthesis.
Limitation of ethanol metabolism in Acinetobacter sp. B-7005 by the rate of acetate assimilation in a reaction catalyzed by acetyl-CoA-synthetase, was shown. Basing on the investigations of C2-metabolism regulation the cultivation conditions were developed which allowed to increase the acetyl-CoA-synthetase activity in Acinetobacter sp. B-7005.
Ethapolan synthesized under these conditions was characterized by high level of acylation (3-15%). Molecular mass of this polysaccharide was 1,5 million and was not changed during purification. Improved reological properties of ethapolan were associated with high molecular mass and increasing fatty acids content.
Key words: exopolysaccharides, biosynthesis, metabolism of ethanol, regulation of C2-metabolism, physical and chemical properties.
