CC BY
71
УДК 759.87З.088.5:661.185
ВПЛИВ ОРГАНІЧНИХ КИСЛОТ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН ШТАМОМ Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 У СЕРЕДОВИЩІ З ГЛІЦЕРОЛОМ
Т. П. Пирог1 2 інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
Т. А. Шевчук1 НАН України, Київ
М. О. Шулякова2 2Національний університет харчових технологій, Київ
Е-mail: tapirog@nuft.edu.ua
Отримано 10.0б.2012
Встановлено можливість інтенсифікації синтезу поверхнево-активних речовин Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на гліцеролі за присутності фумарату (С4-дикарбонова кислота, попередник глюконеогенезу) і цитрату (регулятор синтезу ліпідів).
Одночасне внесення у середовище з гліцеролом (1%, об’ємна частка) фумарату і цитрату (0,01-0,02%) супроводжувалося підвищенням у 2-2,5 раза концентрації позаклітинних поверхнево-активних речовин A. calcoaceticus ШВ В-7241 порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без органічних кислот. Збільшення синтезу їх за таких умов зумовлено одночасним функціонуванням двох анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу і фосфоенолпіруват-карбоксилазної реакції), а також підвищенням у З-б разів активності ензимів біосинтезу поверхнево-активних гліко- (фосфоенолпіруват-синтетаза і фосфоенолпіруват-карбоксикіназа) та аміноліпідів (НАДФ-залежна глутаматдегідрогеназа).
Максимальні показники синтезу A. calcoaceticus МВ В-7241 на гліцеролі спостерігалися за наявності в середовищі дріжджового автолізату та мікроелементів і в разі використання посівного матеріалу, вирощеного на середовищі без факторів росту. За присутності в гліцеролвмісному середовищі для одержання інокуляту і культивування бактерій сульфату заліза відбувалося зниження синтезу поверхнево-активних речовин, зумовлене інгібуючим впливом Fe2+ на активність ензимів біосинтезу їх у штаму МВ В-7241.
Одержані дані можуть бути основою для розроблення нової технології одержання поверхнево-активних речовин A. calcoaceticus ШВ В-7241.
Ключові слова: поверхнево-активні речовини, інтенсифікація біосинтезу, органічні кислоти, гліцерол, Acinetobacter calcoaceticus !МВ В-7241.
Упродовж останніх 15-20 років мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР) є об’єктом інтенсивних теоретичних і прикладних досліджень, що зумовлено їхніми унікальними фізико-хімічними властивостями [1]. ПАР мікробного походження широко використовують у багатьох галузях народного господарства, зокрема для підвищення нафтовидобутку, надання специфічних смакових і структурних властивостей продуктам харчування, створення нових високоефективних форм фармацевтичних препаратів, а також у процесах біоремедіації екосистем. Такого широкого застосування мікробні ПАР набули завдяки біодеградабельності, низькій токсичності, стабільності фізико-хімічних властивостей у широкому діапазоні рН і температури тощо [1].
Раніше [2] ми повідомляли про здатність ізольованого нами штаму Acinetobacter cal-
coaceticus ІМВ В-7241 синтезувати ПАР під час культивування на гідрофільних і гідрофобних субстратах (гексадекан, рідкі парафіни, етанол, глюкоза) [2].
Слід зазначити, що представники роду Acinetobacter синтезують високомолеку-лярні сурфактанти, яким притаманні емульгувальні, проте не поверхнево-активні властивості [3, 4]. Найбільш вивченими на сьогодні є емульсан (продуцент Acinetobac-ter calcoaceticus RAG-1, нова назва — А. venetianus RAG-1 [3], A. calcoaceticus BD4), алазан (продуцент A. radioresistens К53 и КА53) та дисперсан (продуцент A. cal-coaceticus А2). За хімічною природою ці продукти мікробного синтезу є комплексом позаклітинних полісахаридів і протеїнів. Лише нещодавно у літературі з’явилося одне з перших повідомлень [5] про здатність бактерій роду Acinetobacter синтезувати
низькомолекулярні ПАР, але тільки на гідрофобних субстратах.
Селекціонований нами штам A. calcoace-ticus IMB В-7241 синтезує незвичні за хімічним складом ПАР, які є комплексом нейтральних, аміно- і гліколіпідів [2], причому гліколіпіди представлені трегалозомікола-тами — метаболітами, характерними для бактерій роду Rhodococcus, проте не Acineto-bacter [4]. Здатність A. calcoaceticus IMB В-7241 до утворення трегалозоміколатів було підтверджено також і ензимологічними дослідженнями [6].
Незважаючи на комерційно привабливі властивості мікробних ПАР та значні переваги їх порівняно із синтетичними аналогами, промислове виробництво цієї групи речовин в Україні дотепер не реалізовано, а чинниками, що стримують впровадження технологій мікробних ПАР у світі є високі витрати на біосинтез (сировина, енергетика), виділення та очищення цільового продукту, а також недостатньо висока концентрація синтезованих речовин [7]. Тому багато-обіцяльним підходом до інтенсифікації технологій мікробних ПАР є використання дешевих ростових субстратів (продуктів перероблення основної сировини або відходів різних галузей промисловості) [8].
Зі зростанням обсягів виробництва біо-дизеля у світі постала проблема утилізації гліцеролу — побічного продукту трансете-рифікації рослинних олій чи тваринних жирів, причому на кожні 100 л біодизеля утворюється майже стільки ж літрів технічного гліцеролу [9]. Тільки за період з 2004 до 2006 р. ціна на гліцерол знизилась більш ніж у 10 разів. Це зумовило істотні зміни в багатьох галузях промисловості, наприклад фірма Procter and Gamble перестала виробляти власний гліцерол, як і багато інших косметологічних компаній. Тому переробка технічного гліцеролу на більш цінні продукти є актуальною проблемою [9].
Уже на сьогодні спектр речовин, одержуваних мікробною конверсією гліцеролу достатньо широкий. Це органічні кислоти (про-піонат, сукцинат, піруват, цитрат) [9-12], спирти (етанол, 1,3-пропандіол) [9, 11, 13], кетони (дигідроксіацетон) [9, 11], амінокислоти (фенілаланін) [14], поліефіри (полігідроксіалканоати) [1б], пігменти (ас-таксантин, продигіозин) [9, 11], екзополіса-хариди [16] і поверхнево-активні речовини [9, 11, 17, 18].
Ще одним підходом до підвищення ефективності технологій мікробного синтезу є внесення у середовище екзогенних поперед-
ників біосинтезу [19]. Раніше такий підхід був використаний нами для підвищення синтезу ПАР Rhodococcus erythropolis ЕК-1, які є комплексом нейтральних ліпідів і гліко-ліпідів [19]. Встановлено, що за наявності у середовищі з етанолом або гексадеканом цитрату (регулятор синтезу ліпідів) і фума-рату (попередник глюконеогенезу) показники синтезу ПАР збільшувалися на 40-100%.
У зв’язку із цим метою даної роботи було дослідження синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 на гліцеролі за присутності органічних кислот і встановлення механізмів, що забезпечують інтенсифікацію біосинтезу поверхнево-активних речовин.
Матеріали і методи
Об’єктом досліджень був штам Acineto-bacter calcoaceticus К-4 [2], ізольований із забрудненого нафтою зразка ґрунту і депонований у Депозитарії !нституту мікробіології та вірусології за номером IMB В-7241.
Вирощування бактерій здійснювали на модифікованому нами [2] рідкому мінеральному середовищі Mюнца (г/л): (NH2)2CO — 0,3; NaCl — 1,0; Na2HPO4 — 0,6; KH2PO4 — 0,14; MgSO47H2O — 0,1; рН 6,8-7,0. У середовище додавали дріжджовий автолізат — 0,5% (об’ємна частка) і розчин мікроелементів — 0,1% (об’ємна частка). Розчин мікроелементів мав такий склад (г/100мл): ZnSO4 7H2O — 1,1; MgSO4 7H2O — 0,6; FeSO4 7H2O — 0,1; CoSO4 7H2O — 0,03; CuSO45H2O — 0,004; H3BO3H2O — 0,006; KI — 0,0001; трилон Б — 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовували гліцерол у концентрації 1% (об’ємна частка).
Як попередники синтезу ПАР застосовували цитрат натрію та фумарат натрію в концентраціях 0,01-0,5% (масова частка), які додавали у середовище у вигляді 10%-х розчинів. Органічні кислоти вносили у середовище з гліцеролом на початку стаціонарної фази росту продуцента.
Посівним матеріалом слугувала добова культура, вирощена на м’ясо-пептонному агарі ^ПА), а також культура з експонен-ційної фази росту (48 год), вирощена на середовищі наведеного вище складу з 0,5% гліцеролу, в яке вносили (окремо і разом) дріжджовий автолізат і мікроелементи. Кількість посівного матеріалу становила 5% від об’єму середовища (104-105 клітин/мл). Культивування бактерій здійснювали в колбах об’ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °С упродовж 48-120 год.
Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу відповідно до калібрувального графіка.
Поверхневий натяг (os) визначали за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовували показник «умовної концентрації ПАР» (ПАР*, безрозмірні одиниці). Цей показник визначали як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності os від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР.
Для визначення емульгувальної здатності (індекс емульгування) до 2 мл культу-ральної рідини додавали 2 мл субстрату для емульгування (соняшникову олію) та струшували упродовж 2 хв. !ндекс емульгування (Е24) вимірювали через 24 год як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці й виражали у відсотках.
Кількість синтезованих позаклітинних ПАР (г/л) визначали так. Культуральну рідину центрифугували (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанта переносили у циліндричну ділильну воронку об’ємом 100 мл, додавали 5 мл 1 M НС!, воронку закривали пришліфованим корком і струшували упродовж 3 хв, далі додавали ще 4 мл 1 M НС й 16 мл суміші хлороформу та метанолу (2:1) і струшували протягом 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишали у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію зливали (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагували. Під час повторної екстракції у водну фазу додавали 9 мл 1M НШ, 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) і здійснювали екстракцію ліпідів упродовж 5 хв. Після розділення фаз збирали нижню фракцію (органічний екстракт 2). На третьому етапі до водної фази додавали 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) і проводили екстракцію як описано вище, при цьому одержували органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об’єднували і упарювали на роторному випарнику ИР-Ш2 (Росія) при температурі 50 “С за абсолютного тиску 0,4 атм до постійної маси.
Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину, одержану після культивування А. calcoaceticus K-4 на рідкому се-
редовищі з гліцеролом, центрифугували (5 000 g, 20 хв, 4 “С). Отриманий осад клітин двічі відмивали від залишків середовища 0,05 M К+-фосфатним буфером (рН 7,0) і центрифугували (4 000 g, 15 хв, 4 “С). Відмиті клітини ресуспендували в 0,05 M К+-фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнували ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 40 с при 4 “С на апараті УЗДН-1 (Росія). Одержаний дез-інтеграт центрифугували (12 000 g, 30 хв, 4 “С), осад відділяли, а супернатант використовували для подальших досліджень як безклітинний екстракт.
Активність ензимів аналізували як описано нами раніше [20]: ізоцитратліази (КФ 4.1.3.1.) — за швидкістю утворення феніл-гідразону гліоксилату при 324 нм, ізоцитрат-дегідрогенази (КФ 1.1.1.42) і глутаматдегід-рогенази (КФ 1.4.1.2) — за відновленням НАДФ+ при 340 нм за присутності ізоцитра-ту і 2-оксоглутарату відповідно, фосфое-нолпіруват(ФЕП)-синтетази (систематична назва ензиму — піруват, вода дикіназа; КФ 2.7.9.2) — за швидкістю утворення пірувату, яку визначали за окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з лактатдегідрогеназою, ФЕП-карбоксилази (КФ 4.1.1.31) і ФЕП-кар-боксикінази (КФ 4.1.1.49) — за швидкістю утворення малату з оксалоацетату, яку визначали за окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з малатдегідрогеназою.
Активність ензимів виражали в нмоль одержаного за 1 хв продукту реакції у перерахунку на 1 мг протеїну. Вміст протеїну у безклі-тинних екстрактах визначали за Bradford [21].
Активність ензимів аналізували при 28-30 “С — температурі, оптимальній для росту А. calcoaceticus IMB В-7241.
Усі досліди проводили в 3 повторах, кількість паралельних визначень в експериментах становила 3-5. Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за алгоритмом, описаним у роботі [22]. Відмінності середніх показників вважали достовірними на рівні значущості Р < 0,05.
Результати та обговорення
Вплив способу підготовки посівного матеріалу на синтез ПАР А. calcoaceticus ІМВ В-7241. У попередніх дослідженнях [2] нами було встановлено, що під час культивування штаму A. calcoaceticus IMB В-7241 на етанолі показники синтезу ПАР підвищувалися за внесення у середовище дріжджового автолізату і мікроелементів. Водночас за умов росту А. calcoaceticus IMB В-7241 в середовищі з гліцеролом внесення до нього
дріжджового автолізату і мікроелементів супроводжувалося суттєвим зниженням показника умовної концентрації ПАР та індексу емульгування (до 1,1 і 40% відповідно, табл. 1). Найвищі показники синтезу ПАР (ПАР* 3,2 і Е24 60%) спостерігали за використання посівного матеріалу, вирощеного на середовищі без факторів росту (табл. 1).
Подальші ензиматичні дослідження підтвердили дані ростових експериментів (табл. 2). Так, у разі застосування інокуля-ту, одержаного на середовищі з гліцеролом, дріжджовим автолізатом і мікроелементами, активність ензимів анаплеротичних шляхів (ФЕП-карбоксилаза), біосинтезу поверхнево-активних аміноліпідів (НАДФ+-за-лежна глутаматдегідрогеназа) і гліколіпідів (ФЕП-карбоксикіназа) були в кілька разів нижчими порівняно з використанням посівного матеріалу, вирощеного за відсутності у середовищі факторів росту. Зазначимо, що у процесі культивування на гліцеролі, на відміну від вирощування на етанолі [6], у дослідженого штаму не функціонує гліок-силатний цикл (не виявлено активності ізо-цитратліази), а роль анаплеротичної виконує ФЕП-карбоксилазна реакція (табл. 2).
Реакція карбоксилювання фосфоенолпі-рувату (як і карбоксилювання пірувату) є анаплеротичною у процесі культивування мікроорганізмів на вуглеводних субстратах [23], тому функціонування її в клітинах А. calcoaceticus IMB В-7241, вирощених на гліцеролі, потребує додаткових пояснень. У попередніх дослідженнях [2] нами було встановлено, що найвищі показники синтезу ПАР за умов росту штаму IMB В-7241 на етанолі спостерігалися за використання сечовини як джерела азотного живлення. У наступній праці [24] ми обговорювали фізіологічну роль ФЕП-карбоксилази у процесі культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі з етанолом і сечовиною
як спосіб знешкодження вуглекислого газу, утворюваного в уреазній реакції, що, у свою чергу, супроводжується підвищенням у клітинах бактерій пулу С4-дикарбонових кислот, посиленням глюконеогенезу і збільшенням синтезу поверхнево-активних гліколіпідів.
Таблиця 2. Активність ензимів анаплеротичних шляхів і біосинтезу ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 залежно від способу підготовки інокуляту
Ензими Активність (нмоль-хв-1мг-1про-теїну) за використання інокуляту, вирощеного на середовищі
з дріжджовим автолізатом і мікроелементами без дріжджового автолізату і мікроелементів
^оцитрат^аза G G
ФЕП-карбок- силаза 191±9 1045±52
НАДФ+-залеж-на глутамат-дегідрогеназа 223±11 597±30
ФЕП-синтетаза 1684±88 1780±89
ФЕП-карбо- ксикіназа 159±8 448±22
Примітка. Тут і в табл. 3 активність ензимів визначали в безклітинних екстрактах, одержаних з клітин, які перебували у середині експоненційної фази росту (48 год).
Аналізуючи результати, наведені у табл. 1 і 2, ми припустили, що недоцільність внесення дріжджового автолізату і мікроелементів у середовище для одержання рідкого інокуляту зумовлена наявністю у посівній культурі так званих «ендогенних» запасів після вирощування її на багатому агаризова-ному середовищі ^ПА), а додаткове внесення ростових факторів чи мікроелементів може призвести до підвищення концентрації якихось із них вище оптимального рівня.
Оскільки як у дріжджовому автолізаті, так і в складі мікроелементів міститься Fe2+, то цілком імовірно, що критичним фактором для біосинтезу ПАР А. calcoaceticus IMB В-7241 можуть бути катіони заліза. Для перевірки цього припущення на наступному етапі аналізували активність ензимів біосинтезу ПАР за наявності у реакційній суміші різних концентрацій Fe2+. Як свідчать дані, наведені в табл. З, активність усіх досліджуваних ензимів за присутності 0,05-0,1 мM катіонів заліза знижувалась на 20-40%. У зв’язку з цим у наступних дослідженнях посівний матеріал вирощували на середовищі з гліцеролом без дріжджового автолізату і мікроелементів.
Таблиця 1. Вплив якості інокуляту на синтез поверхнево-активних речовин за умов росту A. calcoaceticus ІМВ В-7241 на гліцеролі
Наявність дріжджового автолізату і мікроелементів у середовищі для ПАР* Е24, %
одержання інокуляту біосинтезу ПАР
- - 1,8±0,09 45±2,2
+ - 1,6±0,08 47±2,3
- + 3,2±0,16 60±3,0
+ + 1,1±0,05 40±2,0
Таблиця 3. Вплив катіонів заліза на активність ензимів біосинтезу ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241
Концентрація FeSO47H2O, мМ Активність, % від контролю
НАДФ+-залежна глутамат-дегідрогеназа ФЕП-синтетаза ФЕП-карбоксилаза ФЕП-карбоксикіназа
0,05 80±4 73±4 71±3 Н.в.
0,1 70±3 66±3 65±3 73±4
Примітка. Посівний матеріал вирощено на середовищі
Особливості синтезу ПАР A. calcoaceti-cus ІМВ В-7241 за присутності органічних кислот. Оскільки ПАР А. calcoaceticus IMB B-7241 є комплексом нейтральних, аміно-
і гліколіпідів [2], ми припустили, що як і для штаму R. erythropolis ЕК-1 [19] можна підвищити синтез ПАР уведенням у середовище фумарату і цитрату. Фумарат, як й інші С4-дикарбонові кислоти, є попередником глю-конеогенезу, що забезпечує синтез вуглеводів, а отже й гліколіпідів (трегалозоміколатів). Стимулювальний вплив цитрату натрію на утворення ПАР мікроорганізмами було встановлено у 80-90 роках ХХ ст. [25]. Такий ефект пояснюють активуючим впливом цитрату на ензим ацетил-КоА-карбоксилазу, який каталізує перетворення ацетил-КоА на малоніл-КоА, що, у свою чергу, супроводжується підвищенням синтезу жирних кислот, а отже, й ПАР ліпідної природи.
Раніше [19] нами було встановлено, що збільшення показників синтезу ПАР R. ery-thropolis ЕК-1 на середовищі з етанолом або гексадеканом спостерігали у разі одночасного внесення на початку стаціонарної фази росту продуцента цитрату і фумарату в концентрації 0,1 і 0,2% відповідно. Проте дослідження, проведені зі штамом IMB В-7241, показали, що підвищення умовної концентрації ПАР відбувалося за нижчих на порядок концентрацій органічних кислот (0,01-0,02%, табл. 4), причому воно було незначним порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без фумарату або цитрату. Незалежно від концентрації органічних кислот, доданих у середовище з гліцеролом, рівень біомаси практично не змінювався і становив 0,7-0,8 г/л, тобто стільки ж, як і за умов росту А. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі без фумарату або цитрату (табл. 4).
На наступному етапі на початку стаціонарної фази росту бактерій у середовище з гліцеролом одночасно вносили органічні кислоти у визначених оптимальних концентраціях (табл. 5). У цих дослідженнях як основний критерій синтезу ПАР використовували кількість їх (у г/л), яку визначали ваговим методом після екстракції сумішшю Фолча. Це було зумовлено тим, що графік
гліцеролом, дріжджовим автолізатом і мікроелементами.
Таблиця 4. Вплив різних концентрацій фумарату і цитрату на синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241
Концентрація фу-марату, % Концентрація цитрату, % ПАР* Біомаса, г/л
0 0,01 3,5±0,17 0,70±0,03
0 0,02 3,4±0,17 0,73±0,03
0 0,03 3,2±0,16 0,69±0,03
0 0,05 3,2±0,16 0,72±0,03
0 0,1 3,0±0,15 0,80±0,04
G 0,3 2,9±0,14 0,79±0,04
G 0,5 2,9±0,14 0,80±0,04
0,01 G 3,9±0,19 0,73±0,03
0,02 0 3,6±0,18 0,71±0,03
0,03 0 3,3±0,16 0,70±0,03
0,05 0 3,2±0,16 0,73±0,03
0,1 0 3,0±0,15 0,76±0,04
0,3 0 2,9±0,14 0,78±0,04
0,5 0 2,8±0,14 0,80±0,04
0 0 3,2±0,16 0,79±0,04
Примітка. Тут і в табл. 5 і 6 фумарат і цитрат вносили у середовище з гліцеролом, дріжджовим автолізатом і мікроелементами на початку стаціонарної фази росту (72 год). Посівний матеріал вирощено на середовищі з гліцеролом.
залежності поверхневого натягу від логарифму розведення вільної від клітин культу-ральної рідини штаму IMB В-7241 відрізнявся від характерних для інших штамів наявністю кількох точок підвищення поверхневого натягу з наступним зниженням за більшого розведення і тому коректно визначити дійсний показник умовної концентрації ПАР було неможливо. Дані, наведені в табл. 5, свідчать, що за одночасного внесення фумарату і цитрату (0,01-0,02%) концентрація позаклітинних ПАР підвищувалась удвічі порівняно з вирощуванням бактерій на середовищі без органічних кислот. Важливо, що за таких умов не спостерігали підвищення рівня біомаси.
Слід зазначити, що кількість ПАР, синтезованих мікроорганізмами на гліцеролі, суттєво нижча, ніж на традиційних гідрофобних субстратах. Так, Pseudozyma antarctica JCM 10317T утворює 3,5 г/л ПАР з 10% (об’ємна частка) гліцеролу [17], дещо вищою є концентрація рамноліпідів: до 8 г/л на середовищі з 3% (об’ємна частка) гліцеролу
Таблиця 5. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 залежно від концентрації одночасно внесеного фумарату і цитрату
для Pseudomonas aeruginosa UCP0992 [18]. Враховуючи, що концентрація гліцеролу в середовищі культивування досліджуваного нами штаму IMB В-7241 становить усього 1% (об’ємна частка), а кількість позаклітинних ПАР за наявності незначних концентрацій фумарату і цитрату досягає 2,5 г/л (табл. 5), така технологія за своєю ефективністю не поступається, а в деяких випадках і перевершує відомі у світі.
Механізми інтенсифікації синтезу ПАР А. calcoaceticus ІМВ В-7241 на гліцеролі за присутності органічних кислот. На даному етапі досліджень аналізували активність ензимів, що беруть участь у синтезі поверхнево-активних гліко- (ФЕП-синтетаза, ФЕП-карбоксикіназа) і аміноліпідів (НАДФ-за-лежна глутаматдегідрогеназа), а також ензимів анаплеротичних шляхів.
Дані, наведені у табл. 6, свідчать про посилення синтезу гліко- і аміноліпідів за умов росту штаму IMB В-7241 на середовищі з гліцеролом, фумаратом і цитратом. Так, у разі одночасного внесення органічних кислот активність глутаматдегідрогенази і ФЕП-карбоксикінази підвищувалась у 3, ФЕП-карбоксилази — у 3,5, а активність ФЕП-син-тетази — більш ніж у 5 разів порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без фумарату і цитрату. На особливу увагу заслуговує той факт, що за внесення в середовище з гліцеролом органічних кислот
у клітинах А. calcoaceticus IMB В-7241 починає функціонувати гліоксилатний цикл (активність ізоцитратліази 50-80 нмоль-хв-1мг-1 протеїну). Підвищення активності ензимів біосинтезу поверхнево-активних аміно- і гліколіпідів та анаплеротичних шляхів спостерігали також у разі внесення в середовище з гліцеролом або тільки цитрату, або фу-марату (табл. 6).
Встановлені нами закономірності впливу органічних кислот на синтез ПАР A. cal-coaceticus IMB В-7241 відрізняються від таких для R. erythropolis ЕК-1 [19]: по-перше, оптимальна концентрація фумарату і цитрату для штаму IMB В-7241 у 10 разів нижча; по-друге, ефект від одночасного внесення фумарату і цитрату у середовище культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 з гліцеролом суттєвіший.
Результати наших досліджень відрізняються також і від відомих даних літератури. По-перше, у джерелах описано збільшення синтезу ПАР за наявності в середовищі тільки цитрату, який вносили на початку культивування [25, 26]. По-друге, оптимальна концентрація цитрату при цьому становила
0,5-1,0%. За такої концентрації цитрат можна розглядати не як регулятор синтезу ліпідів, а як додатковий ростовий субстрат. По-третє, нам не вдалося знайти у літературі відомостей про підвищення синтезу ПАР за наявності як цитрату, так і С4-дикарбонових кислот.
Отже, в результаті проведеної роботи встановлено, що підвищення синтезу ПАР за умов росту А. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі з гліцеролом, фумаратом і цитратом зумовлено збільшенням у 3-5 разів активності ензимів біосинтезу поверхнево-активних аміно- і гліколіпідів, а також одночасним функціонуванням двох анаплеротичних шляхів (гліок-силатного циклу і ФЕП-карбоксилазної реакції) порівняно з вирощуванням бактерій на середовищі без органічних кислот.
Концентрація фу-марату, % Концентрація цитрату, % ПАР* ПАР, г/л
0 0 3,2±0,16 1,1±0,05
0,01 0,01 3,6±0,18 2,4±0,12
0,02 0,02 3,5±0,18 2,5±0,12
0,01 0,02 3,4±0,17 2,3±0,11
0,02 0,01 3,4±0,17 2,3±0,11
Таблиця 6. Вплив органічних кислот на активність ензимів біосинтезу ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241
Органічні кислоти Активність (нмоль^хв 1мг 1 протеїну)
^оцитрат- ліаза НАДФ+-залежна глу-таматдегідрогеназа ФЕП-карбокси- лаза ФЕП-карбо- ксикіназа ФЕП-синтетаза
Контроль (без органічних кислот) 0 122±6 285±14 163±8 610±30
Фумарат 52±2 422±21 571±29 857±43 1429±71
Цитрат 56±3 769±38 462±23 923±46 1231±62
Цитрат + фумарат 74±4 380±19 1013±51 506±25 3924±196
Примітка. Концентрація фумарату і цитрату — 0,02%; активність ензимів визначали у безклітинних екстрактах, одержаних з клітин, які перебували наприкінці стаціонарної фази росту (96 год).
ЛІТЕРАТУРА
1. Banat I., Franzetti A., Gandolfi I. et al. Microbial biosurfactants production, applications and future potential // Appl. Microbiol. Biotech-nol. — 2010. — V. 87, N 2. — P. 427-444.
2. Пирог Т. П., Антонюк И. С., Карпенко Е. В., Шевчук Т. А. Влияние условий культивирования штамма Acinetobacter calcoaceti-cus К-4 на синтез поверхностно-активных веществ // Прикл. биохим. микробиол. — 2009. — T. 45, № 3. — C. 304-310.
3. Bach H., Berdichevsky Y., Gutnick D. An exo-cellular protein from the oil-degrading mic-robeAcinetobacter venetianus RAG-1 enhances the emulsifying activity of the polymeric bioemulsifier emulsan // Appl. Environ. Microbiol. — 2003. — V. 69, N 5. — P. 2608-2615.
4. Rosenberg E., Ron E. Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1999. — V. 52, N 2. — P. 154-162.
5. Zhao Z., Wong J. W. C. Biosurfactants from Acinetobacter calcoaceticus BU03 enhance the solubility and biodegradation of phenan-threne // Environ. Technol. — 2009. — V. 30,N 3. — P. 291-299.
6. Пирог Т. П., Шевчук Т. А., Дугинец О. С. Особенности окисления этанола у продуцента поверхностно-активных веществ Acinetobacter calcoaceticus К-4 // Mикробиол. журн. — 2010. — T. 72, N 6. — С. 3-10.
7. Mukherjee S., Das P., Sen R. Towards commercial production of microbial surfactants // Trends in Biotechnol. — 2006. — V. 24, N 11. — P. 509-515.
8. Пирог Т. П., Ігнатенко С. В. Mікробні поверхнево-активні речовини: проблеми промислового виробництва // Біотехнологія. —
2008. — T. 1, № 4. — С. 29-38.
9. Da Silva G., Mack M., Contiero J. Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology // Biotechnol. Adv. —
2009. — V. 27, N 1. — P. 30-39.
10. Rywinska A., Rymowicz W. High-yield production of citric acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch bioreactors // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 2010. — V. 37, N 5. — P. 431-435.
11. Yazdani S., Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry // Curr. Opin. Bio-technol. — 2007. — V. 18, N 3. — P. 213-219.
12. Zhu Y., Li J., Tan M. et al. Optimization and scale-up of propionic acid production by propionic-tolerant Propionibacterium acidipropionici with glycerol as the carbon source // Biores. Technol. — 2010. — V. 101, N 22. — P. 8902-8906.
13. Yu K. O., Kim S. W., Han S. O. Reduction of glycerol production to improve ethanol yield in an engineered Saccharomyces serevisiae using glycerol as a substrate // J. Bacteriol. —
2010. — V. 150, N 2. — P. 209-214.
14. Khamduang M., Packdibamrung K., Chutmanop J. et al. Production of l-phenyl-alanine from glycerol by a recombinant Escherichia coli // J. Ind. Microbiol. Biotech-nol. — 2009. — V. 36, N 10. — P. 1267-1274.
15. Ciesielski S., Pokoj T,, Klimiuk E. Cultivation-dependent and independent characterization of microbial community producing polyhydroxyal-kanoates from raw glycerol // J. Microbiol. Biotechnol. — 2010. — V. 20, N 5. — P. 853-861.
16. Freitas F., Alves V., Pais J. et al. Characterization of an extracellular polysaccharide produced by a Pseudomonas strain grown on glycerol // Biores. Technol. — 2009. — V. 100, N 2. — P. 859-865.
17. Morita T., Konishi M., Fukuoka T. et al. Microbial conversion of glycerol into glycoli-pid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by a basidiomycete yeast, Pseudozyma antarctica JCM 10317T // J. Biosci. Bioeng. — 2007. — V. 104, N 1. — P. 78-81.
18. Silva S. N. R. L., Farias C. B. B., Rufino R. D. et al. Glycerol as substrate for the production of biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa UCP0992 // Colloids Surf. B: Biointerfaces. —
2010. — V. 79, N 1. — P. 174-183.
19. Підгорський В. С., Іутинська Г. О., Пирог Т. П. ^тенсифікація технологій мікробного синтезу. — К.: Наук. думка, 2010. — 327 с.
20. Пирог Т. П., Кузьмінська Ю. В., Коваленко М. О. Mетаболізм С2-С6-субстратів в умовах міксотрофного росту штамів Аcinetobac-ter sp. В-7005 та В-7005 (1НГ) // Укр. біохім. журн. — 2004. — T. 76, № 1. — С. 33-38.
21. Bradford M. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72, N 3. — P. 248-254.
22. Лакин Г. Ф. Биометрия. — M.: Высш. школа, 1990. — 352.
23. Пирог Т. П., Коваленко М. А., Кузьминская Ю. В. Образование на углеводных субстратах экзополисахаридов штаммом Acinetobacter sp. и особенности его С6-мета-болизма // Mикробиология. — 2002. — T. 71, № 2. — С. 215- 221.
24. Пирог Т. П., Шевчук Т. А Долотенко Є. Ю. Роль фосфоенолпіруваткарбоксилази у синтезі поверхнево-активних речовин Acineto-bacter calcoaceticus К-4 // Mікробіол. журнал. — 2011. — T. 73, № 4. — С. 9-15.
25. De Roubin M. R., Mulligan C. N., Gibbs B. F. Correlation of enhanced surfactin production with decreased isocitrate dehydrogenase activity // Can. J. Microbiol. — 1989. — V. 35, N 9. — P. 854-859.
26. Лесык О. Ю., Елисеев С. А., Полулях О. В., Карпенко Е. В. Образование поверхностноактивного комплекса культурой каротинообразующих дрожжей Phaffia rhodozyma и его эмульгирующие свойства // Mикробиол. журн. — 1991. — T. 53, № 2. — С. 36-40.
ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ШТАММОМ
Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 НА СРЕДЕ С ГЛИЦЕРОЛОМ
Т. П. Пирог1, 2
Т. А. Шевчук1 М. А. Шулякова2
1Институт микробиологии и вирусологи им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев 2Национальный университет пищевых технологий, Киев
E-mail: tapirog@nuft.edu.ua
Установлена возможность интенсификации синтеза поверхностно-активных веществ Acinetobacter calcoaceticus ИMB В-7241 на гли-цероле в присутствии фумарата (С4-дикарбо-новая кислота, предшественник глюконеоге-неза) и цитрата (регулятор синтеза липидов).
Одновременное внесение в среду с глицеролом (1%, по объему) фумарата и цитрата (0,01-0,02%) сопровождалось повышением в 2-2,5 раза концентрации внеклеточных поверхностно-активных веществ A. calcoaceticus ИMB В-7241 по сравнению с культивированием бактерий на среде без органических кислот. Увеличение синтеза их при таких условиях обусловлено одновременным функционированием двух анаплеротичес-ких путей (глиоксилатного цикла и фосфоенол-пируват-карбоксилазной реакции), а также повышением в 3-5 раз активности энзимов биосинтеза поверхностно-активных глико- (фос-фоенолпируват-синтетаза и фосфоенолпируват-карбоксикиназа) и аминолипидов (НАДФ+-зави-симая глутаматдегидрогеназа).
Mаксимальные показатели синтеза A. calcoaceticus ИMB В-7241 на глицероле наблюдались при наличии в среде дрожжевого автолизата и микроэлементов и в случае использования посевного материала, выращенного на среде без факторов роста. При наличии в глицеролсодер-жащей среде для получения инокулята и культивирования бактерий сульфата железа наблюдали снижение синтеза поверхностно-активных веществ, обусловленное ингибирующим влиянием Fe2+ на активность энзимов биосинтеза их у штамма ИMB В-7241.
Полученные данные могут быть основой для разработки новой технологии получения поверхностно-активных веществ A. calcoaceti-cus ИMB В-7241.
Ключевые слова: поверхностно-активные вещества, интенсификация биосинтеза, органические кислоты, глицерол, Acinetobacter cal-coaceticus ИMB В-7241.
THE INFLUENCE OF ORGANIC ACIDS ON BIOSURFACTANT SYNTHESIS BY STRAIN Acinetobacter calcoaceticus IMV В-7241 CULTURE ON GLYCEROL MEDIUM
T. P. Pirog1, 2 T. A. Shevchuk1 M. A. Shulyakova2
1 Zabobltny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2National University of Food Technologies, Kyiv
E-mail: tapirog@nuft.edu.ua
The possibility of intensification of biosurfactant synthesis by strain Acinetobacter cal-coaceticus IMV B-7241 on glycerol in the presence of fumarate (C4-dicarboxylic acid, precursor of gluconeogenesis) and citrate (lipid synthesis regulator) was found.
Complex addition into the medium with glycerol (1%, v/v) of fumarate and citrate (0,01-0,02%) was accompanied by increasing of the exocellular biosurfactant quantity in 2-2,5 times compared to cultivation of IMV B-7241 strain on medium without organic acids.
Increase in surfactant concentration was arisen from simultaneous functioning of two anaplerotic ways (both the glyoxylate cycle and phosphoenolpyruvate(PEP)-carboxylase reaction) as well as enhancing in 3-5 times of enzyme activity of biosynthesis of surface-active glyco-(phosphoenolpyruvate synthetase and phospho-enolpyruvate carboxykinase) and aminolipids (NADP+-dependent glutamate dehydrogenase).
Maximal characteristics of A. calcoaceticus IMV B-7241 biosurfactant synthesis on glycerol were observed in the presence of yeast autolisate and microelements in the medium if inoculums was used that had been grown in medium without growth factors.
In the presence of ferrous sulfate in glycerol containing medium for inoculums obtaining and bacteria culturing, synthesis parameters of surfactants decreased due to Fe2+ inhibitory effect on activity of enzyme biosynthesis of IMV B-7241 strain.
The obtained data are bases for development of new technology of biosurfactant synthesis by strain A calcoaceticus IMV B-7241.
Key words: biosurfactants, intensification of synthesis, organic acids, glycerol, Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241.
