CC BY
732
ТОМ 1
НОМЕР 2
АПРЕЛЬ - ИЮНЬ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О. її/ ч СЕМИНАР ПО ГЕМАТОЛОГИИ
Н КОгематология
Blood coagulation: methods of research and mechanisms of regulation
M. A. Panteleev, F. I. Ataullakhanov Keywords:
hemostasis, thrombosis, blood coagulation, clotting assays, thrombelastography, thrombin generation, spatial dynamics.
Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции (часть 2)
М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов
Ключевые слова
гемостаз, тромбоз, свертывание крови, тесты свертывания, тромбоэ-ластография, генерация тромбина, пространственная динамика.
National Research Center for Hematology, Moscow Контакты: mapanteleev@yandex.ru Принято в печать: 24 марта 2008 г.
ВВЕДЕНИЕ
Система свертывания крови является частью системы гемостаза, функция которого заключается в остановке кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Чаще всего в гемостазе выделяют следующие основные элементы: 1) сосудистый
гемостаз — сокращение гладких мышц при повреждении сосуда ведет к вазоконстрикции и уменьшению потери крови; 2) тромбоцитарный гемостаз — тромбоциты, специализированные клетки крови, прилипают к месту повреждения и друг к другу, формируя агрегаты, препятствующие кровопотере; 3) плазменный гемостаз, или свертывание, — в месте повреждения происходит полимеризация белка фибрина, приводящая к формированию геля и локальному превращению плазмы крови в плотный сгусток, полностью блокирующий потерю крови; 4) фибринолиз — по мере восстановления поврежденных тканей система фибринолиза разрушает фибриновый сгусток.
Само по себе формирование фибринового сгустка осуществляется в результате всего лишь одной, хотя и достаточно сложной реакции — полимеризации белка фибрина [1]. Однако для того, чтобы эта полимеризация происходила в нужное время и в нужном месте (а в остальное время не происходила, ибо неконтролируемое свертывание смертельно опасно), в организме существует крайне сложная система свертывания. Она состоит из десят-
ков белков, взаимодействующих в сотнях реакций друг с другом, со стенками нормальных и поврежденных сосудов, с клетками крови. Ее устройство на настоящий момент достаточно хорошо изучено, но принципы этого устройства и механизмы регуляции системы до сих пор остаются плохо понятными. И поэтому сейчас исследователи редко могут с уверенностью предсказать, как поведет себя свертывание при том или ином воздействии. А это сильно ограничивает развитие методов диагностики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями свертывания.
Лишь в последние десятилетия постепенно наметились черты нового подхода к изучению свертывания. Недавние открытия новых белков и реакций в этой системе знаменовали собой переход в ее познании от стадии анализа к стадии синтеза, произошедший в начале 1990-х годов. С тех пор количество работ, посвященных различным видам теоретического и экспериментального моделирования свертывания, возрастало лавинообразно [2—7]. Работы последних лет привели к появлению новых методов, моделей и концепций — экспериментальных, математических, умозрительных. К исследователям в этой области постепенно приходит осознание того, что невозможно понимать свертывание, основываясь исключительно на его биохимии. Процессы диффузии белков и переноса их кровотоком являются ключевыми в регуляции этой системы, которая по своему устройству является принципиально пространственно неоднородной.
174
Гематологический научный центр РАМН, Москва
Свертывание крови
Настоящая статья является второй в нашей серии обзоров, посвященных современным представлениям о каскаде свертывания крови. Первая часть была сосредоточена на детальном рассмотрении биохимического устройства системы свертывания. Здесь же мы делаем следующий логический шаг, пытаясь ответить на вопрос: а как эта система работает? С этой целью рассматриваются методы исследования свертывания и существующие сведения о том, как оно функционирует в организме. Темой заключительной, третьей части обзора будет использование современных знаний о регуляции свертывания крови для практических задач: разработки лекарственных препаратов, диагностики и терапии нарушений свертывания.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящее время регуляция свертывания крови находится в состоянии интенсивного изучения, состояние знания о ней остается достаточно неустойчивым. Исследователи нередко получают противоречащие друг другу результаты, используя различные подходы. По этой причине обсуждение используемых методов должно предшествовать любому обсуждению полученных результатов.
Особенности свертывания in vivo и их исследование in vitro
Какими качествами эти методы должны обладать, чтобы корректно отражать свертывание in vivo?
1. Биохимия: в экспериментальной модели должны присутствовать все те же биохимические реакции, что и в организме, и они должны проходить с теми же скоростями. Подавляющее большинство реальных экспериментальных систем не удовлетворяет этому требованию. Например, тест активированного частичного тромбопластинового времени проводится в условиях, очень далеких от условий в организме, что, однако, не помешало ему успешно использоваться для фундаментальных исследований и диагностики на протяжении многих десятилетий. Это хорошо иллюстрирует общий принцип, применимый к данному и последующим требованиям: они должны выполняться не абсолютно точно, но в достаточной степени, чтобы полученные результаты имели физиологический смысл.
2. Компоненты системы: в модели должны присутствовать не только белки свертывания, но и прочие участники процесса свертывания — клетки крови, эндотелия и субэндотелия. Подавляющее большинство работ по свертыванию выполняется на бедной тромбоцитами плазме. Достаточно редко исследования проводятся в богатой плазме или цельной крови. Как и в предыдущем случае, такое упрощение не является абсолютно запрещенным, но накладывает ограничения на применимость получаемых результатов.
3. Пространство: система должна учитывать неоднородность свертывания in vivo. Иначе говоря, факторы свертывания, активированные в одном месте, диффундируют в другое для того, чтобы выполнить там свою функцию.
4. Поток: физиологическое свертывание функционирует в присутствии кровотока. Этот поток непрерывно приносит к месту повреждения новые факторы свертывания взамен израсходованных, а также уносит активные факторы. Строго говоря, нужно также учесть, что этот поток является пульсирующим.
5. Какое свертывание изучается? В зависимости от состояния системы свертывания и от типа активации экспериментальная система может моделировать разные процессы. Например, она может хорошо имитировать тромбоз (формирование патологического сгустка ВНУТРИ сосуда,
препятствующего нормальному кровоснабжению), но полученные данные о регуляции свертывания могут быть неприменимы к гемостазу (формирование физиологического сгустка, обычно ВНЕ сосуда, препятствующего кровопотере). Процесс свертывания может протекать по-разному и регулироваться различными механизмами в зависимости от скорости потока и размера сосуда (артерия, вена, капилляр), от величины активации (глубокое повреждение или соскабливание эндотелия), от локализации активатора (точечное ранение или массовое попадание тканевого фактора в кровь при тяжелой операции).
6. Удобство использования. Этот последний показатель не имеет прямого отношения к тому, насколько правильно модель имитирует свертывание в организме, скорее, наоборот. Тем не менее его уместно привести в списке требований, которые мы предъявляем к диагностическим и исследовательским системам. Речь идет о том, что эти системы должны быть оптимальными не только с точки зрения соответствия реальному свертыванию, но и с точки зрения стоимости, воспроизводимости, объема и ценности получаемой информации, неинвазивности и т. д. В настоящее время уже существуют методы, позволяющие изучать формирование тромба in vivo [8]. Однако стоимость оборудования, затруднительность изменения условий, низкая воспроизводимость, обилие экспериментальных артефактов делают такие методы плохо подходящими для большинства исследовательских задач. А высокая инвазивность почти исключает их использование в диагностике.
Подводя итог, можно заключить, что экспериментальные и математические модели свертывания должны быть максимально адекватными свертыванию in vivo, но не больше, чем нужно для выполнения поставленной задачи.
Экспериментальные модели свертывания in vivo
Основа практически всех используемых подходов такого рода заключается в нанесении подопытному животному контролируемого повреждения с тем, чтобы вызвать гемостатическую или тромботическую реакцию. Можно рассмотреть несколько наиболее типичных конкретных методов, фигурирующих в современных работах.
Время кровотечения [9]. Человеку или лабораторному животному наносится контролируемый надрез или прокол, после чего регистрируется время прекращения кровотечения. В клинической практике надрез обычно делается поверхностным, и тест служит для характеристики первичного, сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. При исследованиях на лабораторных животных стандартным и широко распространенным подходом является вариант «хвостового кровотечения». В зависимости от величины повреждения и условий эксперимента этот тест позволяет наблюдать нарушения разных частей системы гемостаза. Из всех подходов in vivo этот тест — самый простой и дешевый. Он также единственный, который допустимо использовать на человеке.
FeC^-индуцированный тромбоз [10]. Крупный сосуд животного (обычно сонная артерия) хирургически обнажается, фиксируется и термостатируется. К нему прикладывается небольшой кружок фильтровальной бумаги, пропитанной раствором FeCl3, который вызывает химический ожог, повреждение стенки сосуда и формирование тромба. Обычно несколько выше по потоку крови размещается электромагнитный датчик, который регистрирует изменение потока по мере перекрывания артерии. Данный подход используется только для исследования тромбоза. Метод относительно прост и недорог, но не позволяет детально наблюдать рост тромба в реальном времени и применим только к достаточно крупным сосудам.
www.medprint.ru
175
М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов
Лазер-индуцированный тромбоз [8]. В этом подходе лазерный луч используется для того, чтобы повредить эндотелий сосуда, расположенного под кожей и доступного для наблюдения. Формирование тромба регистрируется оптически с помощью конфокального микроскопа. Для этого в кровь мыши вводятся антитела к факторам свертывания, и их накопление в тромбе может быть зарегистрировано по флюоресценции в реальном времени. Типичный эксперимент подобного рода изображен на рис. 1. Этот метод используется только для исследования тромбоза. Его преимущество — возможность нанесения очень точных микроскопических повреждений, высокая временная и пространственная разрешающая способность. Исследования с его помощью возможны лишь в небольших подкожных сосудах. Существенный недостаток такого подхода — артефактное воздействие антител на формирующийся тромб.
Рис. 1. Формирование тромба in vivo в модели тромбоза, индуцированного лазером. Повреждение наносится лазерным лучом, сфокусированным на стенке артериолы мыши. В кровь мыши предварительно вводятся антитела к различным компонентам тромба (в данном случае — к активированным тромбоцитам). Путем наложения фотографий, снятых без ультрафиолетового освещения и в различных каналах флюоресценции (авторы работы использовали до трех каналов, одновременно измеряя тромбоциты, фибрин и тканевый фактор), можно получить композитное изображение структуры растущего тромба. Делая снимки с короткими промежутками на протяжении нескольких минут, можно получить видеофильм тромба, растущего в организме. Воспроизведено из [8]
Поскольку каждая из существующих моделей обладает ограниченной областью применения, для максимальной объективности обычно используется комбинация как минимум двух моделей: одной для гемостаза и одной для тромбоза.
В настоящее время общепринятым животным для изучения свертывания и первичного тестирования лекарственных препаратов стали мыши — сравнительно недорогие, небольшие, быстро растущие и размножающиеся. Для них существует большое количество генетических линий с разнообразными мутациями факторов свертывания. К сожалению, тут есть и обратная сторона: мыши достаточно далеки от человека и имеют некоторые серьезные отличия в системе гемостаза [11] (например, у них не существует тромбинового рецептора PAR-1 на тромбоцитах и не бывает атеросклероза).
Экспериментальные модели свертывания in vitro: классические
Классическая постановка эксперимента по свертыванию in vitro заключается в том, что плазма крови (или кровь) смешивается в некоторой емкости с активатором, после чего проводится наблюдение за процессом свертывания.
По типу активации эти постановки можно разделить на активируемые по:
1) внутреннему пути (тест активированного частичного тромбопластинового времени — АЧТВ; время рекальцификации — ВР);
2) внешнему пути (например, тест протромбинового времени — ПВ).
По типу исследуемого объекта можно выделить следующие группы методов:
1) в бедной тромбоцитами плазме (АЧТВ, ПВ, ВР, генерация тромбина);
2) в богатой тромбоцитами плазме (генерация тромбина);
3) в цельной крови (тромбоэластография).
По методу наблюдения все методы подразделяются на две группы:
1) наблюдение за самим процессом свертывания по светопропусканию или вязкости (АЧТВ, ПВ, ВР, тромбоэла-стография);
2) наблюдение за кинетикой факторов свертывания (генерация тромбина).
Эта классификация не является жесткой, т. к. многие подходы могут быть адаптированы к иным условиям. Например, для генерации тромбина и тромбоэластографии они могут быть активированы по любому пути. К тому же, как мы увидим ниже, для всех методов существуют модификации, позволяющие проводить измерения в любой среде — от бедной плазмы до цельной крови.
Рассмотрим конкретные методы.
Тесты времени свертывания. Наиболее распространенными методами исследования свертывания являются АЧТВ и ПВ. Тесты обычно выполняются на бедной тромбоцитами плазме, в некоторых случаях они могут проводиться и на цельной крови. Обычно эти варианты используются в тех случаях, когда доступно очень мало крови, или когда лабораторное оборудование недоступно, или когда некогда центрифугировать (анализы у новорожденных, домашний контроль за приемом оральных антикоагулянтов, исследование свертывания у аквариумных рыбок).
Тест ПВ был создан в 1935 г. Армандом Квиком [12]. В этом тесте активация производится высокой концентрацией тромбопластина, что ведет к быстрому (10—15 с) свертыванию нормальной плазмы. При недостатке факторов VII, X, V II это время увеличивается. Изначально этот тест предназначался только для выявления протромбина, единственного известного на тот момент белка каскада свертывания (за исключением фибриногена). Однако последующие исследования обнаружили удлинение ПВ у некоторых пациентов с нормальным протромбином, что привело к открытию новых факторов свертывания. ПВ также увеличивается при назначении многих антикоагулянтов, и этот тест сыграл значительную роль в открытии некоторых из них, в т. ч. варфарина.
Использование различных тромбопластинов нередко дает сильно различающиеся зависимости ПВ от концентрации факторов свертывания. Поэтому результаты теста обычно выражают с использование международного нормализованного отношения. Этот параметр рассчитывается по формуле:
мно
/ ля \мич
___/ ' '^образец \
\ ^^контроль /
где МНО — международное нормализованное отношение, ПВобразец — время свертывания исследуемой плазмы, ПВконтроль — время свертывания контрольной нормальной плазмы, а МИЧ — международный индекс чувствительности тромбопластина, который определяется каждым производителем для своего тромбопластина.
В тесте ПВ используется очень сильная активация по внешнему пути. Она приводит к тому, что фактор X очень быстро активируется внешней теназой и внутренний путь свертывания не успевает внести заметного вклада. Поэтому ПВ не меняется при дефиците факторов внутреннего пути, в т. ч. при всех видах гемофилии. Для того чтобы диагностировать гемофилию, в 1953 г. был создан тест АЧТВ.
В АЧТВ активация свертывания производится по контактному пути, обычно с добавлением каолина. Само название «активированное частичное тромбопластиновое время» является неправильным и вводящим в заблуждение, т. к. тромбопластина в современном понимании там как раз нет. Но тест и название для него появились задолго до того, как молекулярное устройство тканевого фактора и состав тромбопластина были выяснены. В норме плазма в АЧТВ свора-
176
Клиническая онкогематология
Свертывание крови
чивается за 30—40 с. Это время увеличивается при дефиците факторов свертывания II, X, V, VIII, IX, XI, а также факторов контактной активации. Как и ПВ, АЧТВ увеличивается не только при простых дефицитах, но и при использовании разнообразных антикоагулянтов, волчаночном антикоагулянте, коагулопатии потребления и других сложных нарушениях свертывания.
Как видно из этих описаний, оба теста не являются специфичными. Для выяснения конкретных причин нарушения обычно необходимы дополнительные исследования. Стандартной стратегией в таких случаях является определение времени свертывания при смешивании исследуемой плазмы с плазмами, дефицитными по разным факторам свертывания, в соотношении 1:1. Дело в том, что АЧТВ и ПВ обладают низкой чувствительностью и начинают увеличиваться только при падении активности факторов до 30 % нормы. Поэтому смешивание исследуемой и дефицитной плазмы дает нормальное время свертывания почти всегда, за исключением единственного случая, когда в этих плазмах не хватает одного и того же фактора.
Время свертывания в обоих тестах почти не меняется при прокоагулянтных изменениях в плазме (тромбофилии и гиперкоагуляционные состояния).
Считается, что в совокупности эти два теста более или менее характеризуют оба пути свертывания и их комбинация является стандартной для анализа крови. Иногда, в зависимости от показаний и от финансовых затруднений медицинского учреждения, они дополняются более специальными (тромбиновое время, активация нерекальцифицированной плазмы тромбином; этот тест позволяет диагностировать дефицит фибриногена и антитромбина III) или более дешевыми тестами (ВР, свертывание плазмы при простом добавлении кальция; плохо поддается стандартизации, т. к. по существу активация свертывания происходит от контакта с поверхностью пробирки, зато не требует никаких реагентов, кроме кальция).
Важной модификацией стандартных тестов является так называемый анализ формы сигнала (waveform analysis). При обычном измерении АЧТВ приборы обычно регистрируют только время свертывания плазмы. В новом же подходе коагулометр непрерывно измеряет и записывает величину светопропускания как функцию времени, а сама форма этой кривой является важным диагностическим показателем. Обнаружено, что изменение светопропускания в тесте АЧТВ при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания имеет характерный двухфазный вид (рис. 2, А): в норме светопропускание начинает падать только после некоторой задержки, а при патологии падение начинается немедленно после рекальцификации, а затем ускоряется [13]. Было показано, что это изменение светопропускания вызвано не свертыванием, а преципитацией одного из плазменных белков в присутствии кальция [13]. Чувствительность и специфичность раннего обнаружения диссеминированного внутрисосудистого свертывания таким методом составили
97,6 и 98 % соответственно [14].
Тромбоэластография. Метод тромбоэластографии был создан Хеллмуттом Хартертом в 1948 г. Она основана на измерении физической прочности сгустка. Небольшое количество крови (обычно около 0,4 мл) помещается в кювету, которая совершает медленные (6 раз в минуту) вращательные колебания на несколько градусов (4,5°). В камеру помещается стержень датчика и добавляются активаторы свертывания. Когда в кювете формируется сгусток, стержень начинает вращаться вместе со сгустком. Амплитуда отклонения стержня регистрируется как функция времени. Типичная кривая тромбоэластографии изображена на рис. 2, Б.
Рис. 2. Современные тесты свертывания крови:
А — анализ формы сигнала в АЧТВ: светопропускание регистрируется как функция времени для нормальной плазмы (О), плазмы с двухфазной формой сигнала (А) и ее же при добавлении гирудина (□). Воспроизведено из [13]. Вместо традиционного времени свертывания в этом методе снимается вся кривая (символы на рисунке показаны лишь для того, чтобы пометить кривые). Различия в ее форме позволяют выявить ранние фазы диссеминированного внутрисосудистого свертывания; Б — тром-боэластограмма (по [52]). Изображены стандартные параметры: время реакции (R, мин), скорость формирования сгустка (а, градусы), прочность сгустка (G, дин/см2); В — генерация тромбина: 1 — бедная тромбоцитами плазма при активации тканевым фактором, 2 — бедная тромбоцитами плазма при активации каолином, 3 — богатая тромбоцитами плазма, запуск свертывания рекальцификацией. Воспроизведено из [15]
Хотя кривая практически симметрична относительно оси абсцисс вследствие того, что амплитуд на самом деле две (для колебаний в каждую сторону), в тромбоэластографии традиционно изображают обе половинки кривой. На ней можно выделить разнообразные параметры, характеризующие как скорость формирования сгустка, так и его финальные характеристики.
Основные достоинства тромбоэластографии: 1) возможность измерить свертывание в цельной крови — это ближе к ситуации in vivo и позволяет не тратить время на подготовку плазмы; 2) возможность измерять реальную прочность сгустка, а не условные оптические характеристики типа светопропускания, которые могут ее отражать недостоверно;
3) возможность использовать все разнообразие активаторов свертывания и фибринолиза, позволяет изучать и диагностировать нарушения разных элементов системы свертывания.
Генерация тромбина. Тромбин — главный фермент системы свертывания крови. Исследование кинетики тромбина может принести массу дополнительной информации, которая недоступна из простого наблюдения за процессом полимеризации фибрина. Оно обычно проводится с помощью хромогенных или флюорогенных субстратов [15, 16]. Такой синтетический субстрат представляет собой молекулу, которая распознается и разрезается сериновой проте -иназой. Этот разрез ведет к отщеплению от субстрата сигнальной молекулы, метки. Метка либо изменяет оптическую
www.medprint.ru
177
М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов
плотность раствора (хромогенный, т. е. окрашивающий субстрат), либо способна флюоресцировать при освещении (флюорогенный субстрат). Скорость увеличения сигнала пропорциональна концентрации тромбина, так что зависимость тромбина от времени получается из экспериментальной кривой путем простого дифференцирования. Начиная с 1990-х годов метод генерации тромбина начал активно использоваться в клинике. Разработанный и развиваемый Конрадом Хемкером в Нидерландах, этот подход с каждым годом все более активно применяется в Европе, в последние годы он также стал доступен почти по всему миру. Обзор этого метода на русском языке можно найти в работе Х. К. Хем-кера и С. Бегуина [17].
Типичная кривая генерации тромбина приведена на рис. 2, В. Как правило, в этой кривой выделяют два основных параметра: лаг-тайм (время задержки свертывания) и тромбиновый потенциал (площадь под кривой генерации тромбина). Многочисленные эксперименты и испытания показали, что эти два параметра — эффективные показатели патологических процессов.
Как и при тромбоэластографии, результаты теста генерации тромбина существенно зависят от условий эксперимента: метода активации, концентрации активатора, использования бедной или богатой плазмы, добавления вспомогательных веществ. Меняя эти параметры, можно выявлять разнообразные нарушения свертывания. Стандартная активация небольшим количеством тканевого фактора в бедной плазме используется для выявления дефицита факторов свертывания [18]. Она удобна для массового анализа образцов, особенно когда требуется их транспортировка или заморозка. Генерация тромбина в богатой плазме может дополнительно выявлять нарушения тромбоцитарного свертывания, успешно обнаруживая склонность к кровотечению при тромбастении Гланцманна, болезни Бернара— Сулье, приеме антитромбоцитарных препаратов [19]. Если добавить в плазму тромбомодулин, то этот тест становится максимально близким к ситуации in vivo и начинает определять даже некоторые тромбофилические нарушения: мутацию фактора свертывания Лейден V последствия приема оральных контрацептивов и др. [20].
In vitro: учет пространственной неоднородности и потока
Легко заметить колоссальный разрыв, существующий между описанными выше экспериментальными моделями in vivo и гомогенными диагностическими тестами in vitro. Свертывание в организме протекает неоднородно. Иначе говоря, формирование сгустка происходит в пространстве. Оно запускается внешней теназой на поврежденной стенке, распространяется с участием протромбиназы на активированных тромбоцитах в объеме плазмы и тормозится реакциями с участием тромбомодулина на здоровом эндотелии. Адекватно изучить эти процессы с помощью гомогенных методов невозможно. Вторым важным фактором является наличие потока крови.
Осознание этих проблем привело к появлению начиная с 1970-х годов разнообразных проточных экспериментальных систем in vitro [21—24]. Несколько больше времени потребовалось на осознание пространственных аспектов проблемы. Только в 1990-х годах стали появляться методы, учитывающие пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания [3, 25, 26], и только в последние десятилетия они стали активно использоваться в научных лабораториях [4, 27—35]. Коммерчески доступных вариантов таких методов для диагностики пока не существует.
Основные принципы устройства пространственно неоднородных экспериментальных постановок можно пояснить
УВІЯІЯІ ш\ щ
g-g 4______II_____21_____ЗІ_____41 I
Рис. 3. Рост фибринового сгустка в экспериментальной модели свертывания в реакционно-диффузной системе. Свертывание активировалось в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы монослоем клеток, экспрессирующих тканевый фактор. Формирование фибринового сгустка регистрировалось по светорассеянию методом темного поля. Темная полоска слева — активатор (пленка с фибробластами). Серая расширяющаяся полоса — растущий от активатора фибриновый сгусток. Белая линия на первом кадре показывает масштаб 1 мм, белый прямоугольник — область около активатора. Воспроизведено из [30]
на примере установки, разработанной в нашей лаборатории (рис. 3). В этом приборе свертывание происходит в кювете, содержащей неперемешиваемую рекальцифицированную плазму. В качестве активатора используется поверхность с иммобилизованными фибробластами, клетками с большим количеством поверхностного тканевого фактора. При контакте плазмы с этой поверхностью на ней начинается свертывание, которое затем распространяется от активатора в глубь плазмы и которое можно наблюдать по светорассеянию от растущего сгустка. Такая экспериментальная модель хорошо себя зарекомендовала в исследовательской работе и продемонстрировала хорошую чувствительность к различным нарушениям системы свертывания [25, 27, 29—31, 34].
РЕГУЛЯЦИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Каскадное устройство системы свертывания
Начнем наш анализ регуляции свертывания с самого простого и очевидного вопроса: какова функция его каскадного устройства? Есть один фермент, который распознает место повреждения, — это фактор Vila, который связывается с тканевым фактором. Есть другой фермент, который делает сгусток, — это тромбин, который производит фибрин и активирует фибринстабилизирующий фактор XIII. Для чего же нужны все остальные факторы? Нельзя ли было сделать систему попроще?
Первая гипотеза, объясняющая необходимость ферментативного каскада, появилась в 1960-х годах [36], сразу после того, как концепция каскада утвердилась в свертывании. Эта идея, навеянная физическими соображениями, предполагала, что каскад работает простым усилителем. Представим себе каскад из N ферментов, каждый из которых активирует следующий фермент ниже по каскаду. Для простоты пусть все реакции происходят с одинаковыми скоростями. Пусть за некий промежуток времени первый фермент каскада может активировать 10 молекул второго фермента. Тогда за следующий промежуток каждая из этих 10 сможет активировать 10 молекул третьего. Увеличивая длину каскада, мы можем получить громадное усиление исходного сигнала.
Но эксперимент показал, что такая гипотеза вряд ли правильна. В системе свертывания возможность каскадного усиления не реализуется. Напротив, при взгляде на систему вообще возникает ощущение, что дополнительное усиление ей не нужно. Дело в том, что скорости реакций свертывания как будто бы нарочно замедлены: они идут на много порядков медленнее, чем обычно протекают реакции такого типа. Например, одиночный фактор Xa практически не активирует протромбин [37]. Зачем так сделано? Никаких физических законов, запрещающих сделать эту реакцию быстрой, не существует. Это свидетельствует о том, что усиление сигнала не является тем принципом, из-за которого эволюция привела к появлению каскадной структуры. Если бы было нужно простое усиление, этого можно было бы добиться с помощью одной реакции, работающей на несколько порядков быстрее.
178
Клиническая онкогематология
Свертывание крови
Точного ответа на вопрос о роли каскадной структуры пока не существует. Однако некоторые соображения высказывались.
Прежде всего, зависимость конечного сигнала от времени для ферментативного каскада кардинально отличается от зависимости для одного фермента. Один фермент, работающий с постоянной скоростью, дает линейную зависимость концентрации продукта от времени. У каскада из N ферментов, эта зависимость будет иметь вид tN, где t — время [36]. Скорее всего, для эффективной работы системы важно, чтобы ответ носил именно такой, «взрывной» характер. Именно это может объяснить распространенность ферментативных каскадов в биологии.
Кроме того, можно видеть, что ни одна из ступеней каскада не работает как просто ступень, к каждой подключена какая-то регуляция. На факторы XI, IX, X идут разнообразные положительные и отрицательные обратные связи. А тромбин, наоборот, является источником этих многочисленных обратных связей. Таким образом, структура каскада эффективно и удобно используется для того, чтобы «навешивать» на него управляющие элементы. Можно также отметить, что добавление положительных обратных связей превращает кинетику каскада из степенной (вида tN) в экспоненциальную (вида ekt), еще более усиливая «взрывность» ответа системы. Так мы естественно переходим к теме следующего раздела.
Запуск свертывания и роль положительных обратных связей
Как упоминалось выше, многие реакции свертывания «преднамеренно» замедлены. Так, факторы IXa и Xa сами по себе являются очень «плохими» ферментами и для эффективного функционирования нуждаются в кофакторах — факторах VIIIa и Va соответственно. Эти кофакторы активируются тромбином в петлях положительных обратных связей. В нашем рассмотрении системы свертывания мы и раньше сталкивались с примерами «намеренной порчи» ферментов с регуляторной целью. Например, так устроена работа фактора VIIa, который нуждается в тканевом факторе для запуска свертывания. Там идея ясна: нужно, чтобы свертывание запускалось только в присутствии тканевого фактора. А зачем же портить остальные реакции каскада?
Существование и устройство этих реакций стали известными к концу 1970-х годов [38—40], но только 10 лет спустя были высказаны первые обоснованные предположения об их предназначении. В теоретической работе М. А. Хани-на [2] показано, что добавление в каскад положительных обратных связей может приводить к появлению в системе нескольких устойчивых состояний, между которыми возможно переключение. Позднее эти положения были развиты в других работах [32, 41—43].
В совокупности они привели к следующей концепции. Положительные обратные связи в сочетании с ингибиторами факторов свертывания способны формировать порог — свойство системы почти не реагировать на малую активацию, но быстро срабатывать при появлении большой. Подобное качество представляется весьма ценным для свертывания. Несмотря на то что система тканевый фактор — фактор VIIa сама по себе способна распознавать места повреждения, эта система на любые повреждения отвечает пропорционально их размеру. Иными словами, одна-единственная молекула тканевого фактора, попавшая в кровоток, теоретически могла бы вызвать свертывание, пусть и через долгое время. Система с положительными обратными связями и ингибиторами способна более продуманно реагировать на повреждения: она будет почти полностью игнорировать маленькие, случай-
но присутствующие молекулы активатора, но при превышении порога ответит всей своей мощью.
Роль внутреннего пути в пространственной динамике свертывания
«Золотой эпохой» исследования свертывания крови принято называть период с середины 1940-х по начало 1960-х годов [12]. Именно за этот промежуток времени было открыто подавляющее большинство факторов системы свертывания и в итоге сформулирована гипотеза о ее каскадной структуре. Разгадывать смысл и функцию открытых факторов пришлось последующим поколениям.
Одной из интригующих загадок, преследовавших биохимиков на протяжении многих лет после «золотой эпохи», была загадочная роль фактора XI. Как и прочие факторы свертывания, он был обнаружен в функциональном тесте: плазма от больного гемофилией С не свертывалась в тесте АЧТВ [12]. Смешивание дефицитных плазм от разных доноров и комбинирование АЧТВ и ПВ позволили выяснить, что фактор XI работает во внутреннем пути свертывания и находится в каскаде между факторами IX и XII. Но, к величайшему удивлению исследователей, фактор XII (единственный известный тогда активатор фактора XI) не имел никакой наблюдаемой роли в гемостазе. Его дефицит в отличие от дефицита фактора XI не сопровождался нарушениями свертывания [44].
Частично тайна была раскрыта почти 40 лет спустя, когда c развитием биохимии была обнаружена активация фактора XI тромбином [45]. По-видимому, эта медленная реакция (само существование которой было предметом споров еще на протяжении 10 лет) объясняет физиологическую активацию фактора XI в организме при активации по внешнему пути. Из-за избытка тромбопластина в тесте ПВ вклад этой реакции не виден — он становится заметным только при уменьшении активации [46]. Но зачем же дополнительно активировать фактор IX с помощью фактор XIa, когда фактор IX и так прекрасно активируется внешней теназой? Более того, если подумать, то и фактор IX не кажется очень нужным. Фактор X тоже активируется напрямую внешней теназой в мощной реакции, и необходимость в дополнительной активации внутренней теназой выглядит непонятной. Как мы помним, ответы типа «внешняя теназа слишком медленна и потому нужна внутренняя» неправильны: нет никаких физических запретов, которые помешали бы эволюции сделать эту реакцию быстрее.
Один из наиболее правдоподобных вариантов разгадки роли внутреннего пути был предложен с появлением пространственно неоднородных экспериментальных систем [27, 29—31,43, 47]. Как описывалось выше, в отличие от традиционных подходов АЧТВ, ПВ, генерации тромбина и тром-боэластографии, в пространственно неоднородных системах активатор свертывания локализован в небольшой области экспериментальной кюветы. Из-за этого начинает иметь значение диффузия факторов свертывания. Обнаружено, что положительные обратные связи имеют большое значение именно для распространения свертывания. Эффективная активация фактора X внешней теназой на активаторе не поможет сформировать сгусток вдали от активатора, т. к. фактор Xa быстро ингибируется в плазме и не может далеко отойти от активатора. Зато фактор IXa, который ингибируется на порядок медленнее, вполне на это способен. А там, куда тяжело дойти и ему, начинает работать фактор XIa, активированный тромбином. Таким образом, наличие петель положительных обратных связей помогает создать трехмерную структуру сгустка, позволяя ему эффективно формироваться вдали от активатора.
www.medprint.ru
179
М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов
Рис. 4. Схематическое представление пространственной концепции регуляции свертывания. Свертывание активируется клетками, экспрессирующими тканевый фактор (слева), и распространяется в глубь плазмы. Генерация тромбина регулируется фактором Xa, лимитирующим компонентом протромбиназы. Свертывание около активатора (фаза инициации) определяется исключительно производством фактора Xa внешней теназой. Однако фактор Xa быстро ингибируется и не может диффундировать далеко от активатора. Поэтому в фазе распространения сгустка он образуется внутренней теназой. Лимитирующий же компонент внутренней теназы, фактор IXa, производится внешней теназой. В отличие от Xa он ингибируется слабо и диффундирует далеко. При дальнейшем удлинении сгустка дополнительный фактор IXa производится фактором XIa в петле положительной обратной связи. Наконец, формирование сгустка останавливается вследствие действия тромбомодулина: петля отрицательной обратной связи активирует протеин С, который останавливает распространение тромбина, разрушая факторы Va и VIIIa. Воспроизведено из [31]
Путь протеина С как возможный механизм локализации тромбообразования
Наличие автокатализа в системе свертывания в виде положительных обратных связей таит в себе и потенциальную опасность. Если тромбин может активировать фактор XI, а тот, в свою очередь, может активировать весь нижележащий каскад свертывания, то такая система теоретически способна к неограниченному самоускорению и распространению самоподдерживающейся активации свертывания в пространстве.
Даже если не настаивать именно на такой картине пространственного распространения, разумно предположить, что в организме существуют механизмы, регулирующие размер фибринового сгустка в зависимости от тяжести и формы повреждения, а также от геометрии и гидродинамики поврежденного сосуда. Одним из предполагаемых механизмов такого рода является путь протеина С [48].
Протеин С активируется тромбином. Эта реакция очень медленная сама по себе, но драматически ускоряется при связывании тромбина с тромбомодулином, трансмембранным белком, в большом количестве экспрессируемым клетками эндотелия [49]. Активированный протеин С способен разрушать факторы Va и VIIIa, на порядки замедляя работу системы свертывания.
Казалось бы, зачем нужна такая система? Да, факторы Va и VIIIa не являются сериновыми протеиназами и не могут быть ингибированы обычными ингибиторами плазмы. Это теоретически могло бы объяснить, зачем нужно инактивировать их самым грубым способом — порезав на куски. Но фактор VIIIa, например, нестабилен и может ингибироваться сам по себе путем диссоциации на субъединицы [50]. Так что у природы была масса возможностей сделать оба фактора нестабильными и простым образом обеспечить им инактивацию с высокой скоростью. Но зачем-то потребовалась именно петля отрицательной обратной связи. Второй вопрос: зачем делать эту обратную связь «намеренно испорченной» и нуждающейся в тромбомодулине?
Как и в предыдущем случае, ключом к ответу стали пространственно неоднородные экспериментальные подходы. Было показано, что добавление в пространственно неоднородную экспериментальную систему тромбомодулина приводит к остановке растущего сгустка на некотором расстоянии от активатора, зависящем от концентрации тромбомодулина [31]. Также показано, что мыши, дефицитные по тромбомо-дулину, имеют сокращенное время окклюзии и увеличенное число случаев полной окклюзии при FeClg-индуцированном тромбозе [51]. Несмотря на то что эти феномены еще не из-
учены досконально, существующие данные позволяют уверенно предположить, что протеин С играет важную роль в пространственной локализации процесса свертывания.
Рис. 4 представляет собой попытку суммировать представления о регуляции пространственной динамики свертывания в виде наглядной схемы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последние годы сложность системы свертывания постепенно перестает быть такой загадочной, как раньше. Открытие всех существенных компонентов системы, разработка математических моделей, использование новых экспериментальных моделей позволили приоткрыть завесу тайны. Структура каскада свертывания постепенно расшифровывается, и сейчас, как мы видели выше, практически для каждой существенной части системы выявлена (хотя бы пока на уровне гипотез) роль, которую она играет в регуляции процесса.
Вполне возможно, что эта картина не вполне точная и совершенно точно, что она неполная. Тем не менее прогресс, достигнутый в этой области в последние годы, вселяет надежду, что в обозримом будущем оставшиеся неразгаданные участки на схеме свертывания уверенно обретут осмысленную физиологическую функцию. И тогда можно будет говорить о рождении новой концепции свертывания, пришедшей на смену старинной каскадной модели, которая хорошо служила медицине на протяжении многих десятилетий.
Благодарности
Мы хотели бы выразить глубокую благодарность М. А. Волковой за приглашение написать эту серию обзоров, неоднократное чтение рукописи и важную критику. Мы признательны А. Н. Баландиной, И. В. Грибковой и Е. И. Синаурид-зе за чтение рукописи и ценные замечания. Работа авторов поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 07-04-00146 и 06-04-48426, грантом Федерального агентства по науке и инновациям МК-340.2008.4 и грантом «Разработка принципиально нового плазмозамещающего раствора, обладающего функцией коррекции гемостаза в условиях массивных переливаний» в рамках программы фундаментальных исследований президиума РАН
«Фундаментальные науки — медицине».
180
Клиническая онкогематология
Свертывание крови
ЛИТЕРАТУРА
1. Blomback B. Fibrinogen and fibrin — proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb. Res. 1996; 83(1): 1-75.
2. Khanin M. A., Semenov V. V. A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J. Theor. Biol. 1989; 136(2): 127-34.
3. Ataullakhanov F. I., Guria G. T., Sar-bash V. I., Volkova R. I. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim. Biophys. Acta 1998; 1425(3): 453-68.
4. Hoffman M, Monroe D. M. A cell-based model of hemostasis. Thromb. Haemost. 2001; 85(6): 958-65.
5. Ataullakhanov F. I., Panteleev M. A. Mathematical modeling and computer simulation in blood coagulation. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2005; 34(2-3): 60-70.
6. Mann K. G., Brummel-Ziedins K., Orfeo T, Butenas S. Models of blood coagulation. Blood Cells Mol. Dis. 2006; 36(2): 108-17.
7. Panteleev M. A., Ananyeva N. M., Ataullakhanov F. I., Saenko E. L. Mathematical models of blood coagulation and platelet adhesion: clinical applications. Curr. Pharm. 2007; 13(14): 1457-67.
8. Falati S., Gross P., Merrill-Skoloff G. et al. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 2002; 8(10): 1175-81.
9. Dejana E., Villa S., de Gaetano G. Bleeding time in rats: a comparison of different experimental conditions. Thromb. Haemost. 1982; 48(1): 108-11.
10. Kurz K. D., Main B. W., Sandusky G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb. Res. 1990; 60(4): 269-80.
11. Jirouskova M., Shet A. S., Johnson G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. J. Thromb. Haemost. 2007; 5(4): 661-9.
12. Owen C. A. A History of Blood Coagulation. — Rochester: Mayo Foundation, 2001.
13. Toh C. H., Samis J., Downey C. et al. Biphasic transmittance waveform in the APTT coagulation assay is due to the formation of a Ca(++)-dependent complex of C-reactive protein with very-low-density lipoprotein and is a novel marker of impending disseminated intravascular coagulation. Blood 2002; 100(7): 2522-9.
14. Downey C., Kazmi R., Toh C. H. Early identification and prognostic implications in disseminated intravascular coagulation through transmittance waveform analysis. Thromb. Haemost. 1998; 80(1): 65-9.
15. Hemker H. C., Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb. Haemost. 2000; 84(5): 747-51.
16. Hemker H. C., Al Dieri R., De Smedt E., Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb. Hae-most. 2006; 96(5): 553-61.
17. Хемкер Х. К, Бегуин С. Фенотипирование системы свертывания. Новое в трансфузиол. 2004; 39: 53-69.
18. Al Dieri R., Peyvandi F., Santagostino E. et al. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to clinical bleeding. Thromb. Haemost. 2002; 88(4): 576-82.
19. Hemker H. C., Al Dieri R., Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr. Opin. Hematol. 2004; 11(3): 170-5.
20. Dargaud Y., Trzeciak M. C., Bordet J. C. et al. Use of calibrated automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the prothrombotic phenotype. Thromb. Haemost. 2006; 96(5): 562-7.
21. Baumgartner H. R. The role of blood flow in platelet adhesion, fibrin deposition, and formation of mural thrombi. Microvasc. Res. 1973; 5(2): 167-79.
22. Weiss H. J., Turitto V. T., Baumgartner H. R. Role of shear rate and platelets in promoting fibrin formation on rabbit subendothelium. Studies utilizing patients with quantitative and qualitative platelet defects. J. Clin. Invest. 1986; 78(4): 1072-82.
23. Balasubramanian V., Grabowski E., Bini A., Nemerson Y. Platelets, circulating tissue factor, and fibrin colocalize in ex vivo thrombi: real-time fluorescence images of thrombus formation and propagation under defined flow conditions. Blood 2002; 100(8): 2787-92.
24. Sakariassen K. S., Turitto V. T., Baumgartner H. R. Recollections of the development of flow devices for studying mechanisms of hemostasis and thrombosis in flowing whole blood. J. Thromb. Haemost. 2004; 2(10): 1681-90.
25. Атауллаханов Ф. И., Волкова Р. И., Гурия Г. Т., Сарбаш В. И. Пространственные аспекты свертывания крови. III. Рост сгустков in vitro. Биофизика 1995; 40(6): 1320-8.
26. Hoffman M., Monroe D. M., Oliver J. A., Roberts H. R. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995; 86(5): 1794-801.
27. O vanesov M. V., Krasotkina J. V., Ul’yanova L. I. et al. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim. Biophys. Acta 2002; 1572(1): 45-57.
28. Hoffman M., Monroe D. M. III. The action of high-dose factor VIIa (FVIIa) in a cell-based model of hemostasis. Dis. Mon. 2003; 49(1): 14-21.
29. Ovanesov M. V., Lopatina E. G., Saenko E. L. et al. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb. Haemost. 2003; 89(2): 235-42.
30. Ovanesov M. V., Ananyeva N. M., Panteleev M. A. et al. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J. Thromb. Haemost. 2005; 3(2): 321-31.
31. Panteleev M. A., Ovanesov M. V., Kireev D. A. et al. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein C pathways, respectively. Biophys.
J. 2006; 90(5): 1489-500.
32. Kastrup C. J., Runyon M. K., Shen F., Is-magilov R. F. Modular chemical mechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complex network of hemostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103(43): 15747-52.
33. Hoffman M., Monroe D. M. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 2007; 21(1): 1-11.
34. Sinauridze E. I., Kireev D. A., Popen-ko N. Y. et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant
activity than activated platelets. Thromb. Haemost. 2007; 97(3): 425-34.
35. Faxalv L., TengvallP., Lindahl T. L. Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 2007.
36. Levine S. N. Enzyme amplifier kinetics. Science 1966; 152: 651-3.
37. Monkovic D. D., Tracy P. B. Activation of human factor V by factor Xa and thrombin. Biochemistry 1990; 29(5): 1118-28.
38. Nesheim M. E., Mann K. G. Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V. J. Biol. Chem. 1979; 254(4): 1326-34.
39. Nesheim M. E., Taswell J. B., Mann K. G. The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase. J. Biol. Chem. 1979; 254(21): 10952-62.
40. van Dieijen G., Tans G., Rosing J., Hemker H. C. The role of phospholipid and factor VII-Ia in the activation of bovine factor X. J. Biol. Chem. 1981; 256(7): 3433-42.
41. Beltrami E., Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math. Biosci. 2001; 172(1): 1-13.
42. Jesty J., Beltrami E. Positive feedbacks of coagulation: their role in threshold regulation. Arte-rioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005; 25(12): 2463-9.
43. Zarnitsina V. I., Pokhilko A. V., Ataullakhanov F. I. A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results. Thromb. Res. 1996; 84(5): 333-44.
44. Colman R. W., Schmaier A. H. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-43.
45. Gailani D., Broze G. J. Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253(5022): 909-12.
46. He R., Xiong S., He X. et al. The role of factor XI in a dilute thromboplastin assay of extrinsic coagulation pathway. Thromb. Haemost. 2001; 85(6): 1055-9.
47. Oliver J. A., Monroe D. M., Roberts H. R., Hoffman M. Thrombin activates factor XI on activated platelets in the absence of factor XII. Arterio-scler. Thromb. Vasc. Biol. 1999; 19(1): 170-7.
48. Walker F. J., Fay P. J. Regulation of blood coagulation by the protein C system. FASEB J. 1992; 6(8): 2561-7.
49. Esmon N. L., DeBault L. E., Esmon C. T. Proteolytic formation and properties of gamma-car-boxyglutamic acid-domainless protein C. J. Biol. Chem. 1983; 258: 5548-53.
50. Fay P. J. Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action. Blood Rev. 2004; 18(1): 1-15.
51. Dorffler-Melly J., deKruif M., SchwarteL. A. et al. Functional thrombomodulin deficiency causes enhanced thrombus growth in a murine model of carotid artery thrombosis. Basic Res. Cardiol. 2003; 98(6): 347-52.
52. Nielsen V. G., Lyerly R. T. III, Gurley W. Q. The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on antithrombin activity and mode of activation. Anesth. Analg. 2004; 99(6): 1587-92, table.
www.medprint.ru
181
