Свертывание крови: биохимические основы Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ТОМ 1

НОМЕР 1

ЯНВАРЬ - МАРТ 2008

КЛИНИЧЕСКАЯ

О. її/ ч СЕМИНАР ПО ГЕМАТОЛОГИИ

НКиГЕМАТОЛОГИЯ

Blood coagulation: basical biochemistry

Свертывание крови: биохимические основы

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

РЕФЕРАТ

M.A. Panteleev, F.I. Ataullakhanov Summary:

Blood coagulation is a composite net of biochemical reactions activated by blood vessels integrity abnormalities. The goal of blood coagulation is the controlled local liquid-jelly transition results in arrest of bleeding. Any abnormalities in this fragile balance lead to severe consequences connected with thrombosis or bleeding. The aim of the fist part of our review is to introduce to current opinion about blood coagulation biochemistry. The mechanisms of its regulation will be considered in the next second part. We will discuss the attempts of applying into practice these fundamental conceptions in the third part of the review.

Keywords:

hemostasis, thrombosis, blood coagulation, thrombin, fibrinogen

Hematology Research Center, Moscow Контакты: mpanteleev@yandex.ru

Свертывание крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, активирующуюся при нарушении целостности сосудистой системы. Целью работы свертывания является управляемый локальный переход плазмы крови из жидкого состояния в желеобразное и, как результат, остановка кровотечения. Любые нарушения в тонком балансе этой системы ведут к тяжелым последствиям, связанным с тромбозами или с кровоточивостью. Задачей данной, первой части нашего обзора является познакомить читателя с современными представлениями о биохимии свертывания. Во второй части будут рассмотрены механизмы его регуляции, а в третьей будет рассказано о попытках применить эти фундаментальные концепции к решению практических проблем диагностики и терапии нарушений гемостаза.

Ключевые слова

гемостаз, тромбоз, свертывание крови, тромбин, фибриноген

ВВЕДЕНИЕ

Около полумиллиарда лет назад на нашей планете начали появляться многоклеточные животные, отдаленными потомками которых являются современные млекопитающие. Одним из последствий достижений многоклеточ-ности было увеличение размеров организма. Новые организмы больших размеров нуждались в эффективных системах доставки питательных веществ и кислорода, а также удаления продуктов обмена веществ. Решением этой проблемы стало создание жидкой внутренней среды, которая была способна растворять необходимые вещества и быстро доносить их до каждой клетки организма.1

К сожалению, у текучести жидкой среды есть и обратная сторона: то, что способно течь, способно также вытекать. Поэтому, как только жидкое содержимое «кровеносной» системы древнего организма стало заметно отличаться от «забортной» морской воды, у него возникла новая проблема — быстрой и надежной остановки кровотечения, проблема гемостаза (от греческого haimatos — кровь, stasis —остановка).

Судя по устройству современных беспозвоночных, ранние многоклеточные не имели специализированного гемостаза.2 Состав их «крови» мало отличался от морской воды, скорости и давления в кровеносной системе были низкими, а сама система была очень просто устроена. Организмы с открытой системой крообращения не боялись тромбозов (сосуды немногочисленны и широки, вместо создания многочисленных капилляров внутренние органы просто омываются снаружи протекающей гемолимфой) и потому не нуждались в сложной системе ингибирования гемостаза. Возникающие дырки затыкались агрегатами универсальных клеток гемоцитов, они же амебоциты. Такой агрегат имел скорее иммунный, нежели гемостатический характер. Кровь тогда была не слишком ценной с точки зрения восполнения ее потери, но второе опасное свойство текучей среды — способность моментально разносить по организму не только питательные вещества, но и проникающие в рану микробы — заставило организмы в первую очередь озаботиться иммунной защитой. И именно с тех времен, с первого амебоцитарного агрегата, система иммунитета и систе-

50

Гематологический научный центр РАМН, Москва

Биохимия свертывания крови

ма гемостаза всегда работали рука об руку. Наблюдаемая в настоящее время в условиях реанимации тесная связь воспаления и свертывания — эхо того давнего сотрудничества.3

По мере усложнения организмов их кровеносная система также усложнялась, одновременно совершенствовалась и система гемостаза. У современных млекопитающих, включая человека, кровь течет с высокими скоростями и давлениями. Она также является очень сложно структурированной и сравнительно тяжело восполнимой средой. Необходимость ее защиты постепенно привела к развитию известного нам гемостаза, чрезвычайно сложной, многоуровневой системы, способной быстро и эффективно предотвращать кровотечения.4 Наличие многочисленных мелких сосудов превращает тромбоз в грозную проблему, и закупорка всего лишь нескольких может привести к смерти: это привело к возникновению сложной системы регуляции процессов гемостаза. Помимо клеточной системы защиты, трансформировавшейся в современный тромбоцитарный гемостаз, возникла плазменная система свертывания — разветвленный каскад биохимических реакций, результатом работы которого является полимеризация белка фибрина и появление идеальной затычки для раны вследствие желирования плазмы крови. Именно каскад свертывания будет находиться в фокусе внимания данного обзора.

В последние десятилетия усилия исследователей привели к значительному прогрессу в исследовании гемостаза человека и особенно — в исследовании системы свертывания. Последние новые белки и последние значимые реакции в этой системе были открыты в начале 90-х годов XX века. За последние пятнадцать лет, несмотря на активные усилия исследователей, новых компонентов открыто не было. С учетом того, насколько интенсивно развивается современная биология, пятнадцать лет — это колоссальный срок. И казалось бы, систему свертывания можно спокойно сдавать в архив как хорошо изученную.

Но есть одна проблема: знание устройства системы совершенно не означает понимания ее функционирования. Когда мы имеем дело с многими десятками белков, сложным образом в сотнях реакций взаимодействующих друг с другом, со стенками сосуда и с клетками крови, и все это происходит в реальном сосуде в присутствии быстрого потока крови, то наши способности проанализировать такую систему оказываются совершенно недостаточными. И лучше всего это иллюстрируется тем фактом, что наши современные методы диагностики нарушений свертывания и их лечения весьма несовершенны. Именно по этой причине в последние годы наблюдается интенсивный всплеск числа работ, посвященных именно проблеме понимания принципов функционирования системы свертывания, а не только ее устройства.5,6 Целью нашего обзора является освещение текущего состояния дел в данной области. В настоящей, первой части обзора, будет рассмотрено устройство системы свертывания. Вторая часть сосредоточится на современном прогрессе в понимании его регуляции. Третья часть будет посвящена попыткам использовать это понимание для успешной диагностики и терапии нарушений свертывания.

СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА

Устройство системы гемостаза удобнее всего объяснить с помощью наглядной аналогии. Представьте себе древний акведук, снабжающий водой целый город, и представьте себя на месте начальника бригады рабочих, ответственных за поддержание этого акведука в рабочем состоянии. Не бригады ремонта (полноценный ремонт есть вещь сложная и небыстрая), а скорее аварийной бригады, задачей которой является быстрое залатывание повреждений. В распоряжении

рабочих есть простейшие строительные инструменты и материалы. Как действовать в случае аварии?

Если задать этот вопрос в аудитории студентов, то слушатели обычно предлагают три варианта.

Самый простой способ — перекрыть поток воды и спокойно заниматься ремонтом. Такой механизм выглядит самым разумным и простым, и он действительно используется в организме. Это так называемый сосудистый гемостаз, обусловленный вазоконстрикцией, сужением сосуда, которое ведет к остановке кровотечения. Механизм сосудистого гемостаза заключается в сокращении мышц оболочки сосуда под действием активаторов — серотонина и тромбокса-на А2, секретируемых активированными тромбоцитами. Но такой способ имеет серьезные ограничения. Он применим лишь тогда, когда «акведук» не слишком важный или когда есть дублирующий. Ведь поток крови в сосудах часто нельзя прерывать ни на минуту, не говоря уже о днях, требуемых для восстановления тканей. Впрочем, даже в том случае, когда этот механизм нельзя использовать на все 100%, его можно применять для частичного перекрывания сосуда, что уменьшит потерю крови и облегчит работу по заделке дыры.

Можно было бы попытаться залепить отверстие, не выключая потока, но давление будет все время вымывать любую замазку, которую рабочие будут пытаться приложить. Поэтому второй подход заключается в том, чтобы завалить поврежденное дно акведука грудой камней (или чего-то еще, в зависимости от воображения слушателей), которые создадут пробку. Такая пробка будет в принципе проницаема для воды, но поток и напор заметно снизятся, так что щели между камнями можно будет спокойно замазать цементом. Аналогом этого подхода в организме можно назвать тромбоцитарный гемостаз. В крови присутствуют специализированные клетки крови, тромбоциты, способные к активации. Будучи активированы, они приклеиваются к поврежденным тканям и друг к другу, формируя агрегаты, перекрывающие путь потере крови. Плазма крови может просачиваться через этот тромб, но клетки крови пройти уже не могут. К тому же, щели между тромбоцитами быстро заполняются фибриновым гелем. Биохимия тромбоцитарного гемостаза очень сложна и ее изучение далеко от завершения. Тромбоциты несут на поверхности сотни рецепторов, регулирующих их активацию, и секретируют при активации десятки веществ, влияющих на остальные системы гемостаза. Например, как указано выше, именно секретируемые тромбоцитами вещества вызывают сужение сосудов.

Наконец, в некоторых случаях можно все-таки просто закрыть отверстие в акведуке цементной замазкой. Это допустимо, если отверстие небольшое или если поток воды не слишком силен и позволит заплате затвердеть раньше, чем она будет размыта. В организме данный подход реализован в плазменной системе свертывания. Эта система использует для остановки кровотечения тот же принцип, который домохозяйки используют при приготовлении холодца; такой же подход используется в современных одноразовых детских подгузниках. Физическая основа идеи заключается в превращении жидкости в гель — особую форму коллоидной системы, в которой пористая сеть пронизывает жидкость на микроскопическом уровне. Трехмерная сеть, создаваемая полимеризующимися молекулами белка фибрина, способна удерживать в своих ячейках жидкость, многократно превосходящую ее по массе.

Итак, мы придумали три основных подхода к заделке повреждения — перекрывание (или ослабление) потока, грубое затыкание дырки достаточно крупными объектами, нечувствительными к размывающей силе потока, или замазывание ее неким клеем, который во время своего форми-

www .medprint.ru

51

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

рования может размываться, но после затвердевания делает затычку прочной и совершенно непроницаемой. И мы видим, что природа в организме человека предусмотрительно реализовала все эти три подхода. В литературе чаще всего группируют механизмы гемостаза в две категории: первичный (сосудисто-тромбоцитарный) и вторичный (плазменный).7 Эти названия отражают существующие наблюдения. Первичный гемостаз реагирует на повреждение наиболее быстро (1—3 мин), зато плазменная система свертывания (характерное время около 10 мин) делает сгусток прочным и предотвращает возобновление кровотечения.

Однако, не следует слишком сильно упирать на эти названия. В зависимости от условий, каждый из механизмов может работать независимо от остальных. Вазоконстрик-ция может сама по себе обеспечить остановку кровотечения в маленьком сосуде,7 но более крупные сосуды заметным образом не пережимаются. Тромбоцитарное свертывание лучше всего проходит в сосудах с быстрым течением, которое способно обеспечить эффективный принос тромбоцитов к месту повреждения и их адгезию; только потом этот агрегат «прорастает» фибриновой сеткой.8 Наоборот, для плазменной системы свертывания поток, вымывающий активные ферменты, является только помехой. Она лучше функционирует при медленном потоке.9 То же самое относится и к патологическому случаю — тромбозу. Именно поэтому в артериях чаще наблюдаются «белые» тромбы, состоящие из тромбоцитов. А в сосудах с более медленным течением формируются «красные» тромбы, поскольку здесь преобладает плазменное свертывание, и главным компонентом сгустка является фибриновая сетка, в которую вовлечены эритроциты.10

БИОХИМИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

Общее представление о структуре плазменного свертывания можно получить из рис. 1. Далее мы разберем его устройство, ограничиваясь, тем не менее, основными принципами и оставляя детальное рассмотрение на долю более специализированных обзоров.11 Кроме того, в конце данного обзора, в Приложении, вы можете найти таблицу с детализированными и упорядоченными сведениями о каждом из компонентов системы свертывания.

Формирование фибринового сгустка

В самом низу каскада стрелки на рисунке изображают реакцию превращения белка фибриногена в фибрин и последующую полимеризацию фибрина. Эти реакции являются главными в системе свертывания и представляют собой итог ее работы. Если быть точным, эти реакции представляют собой единственные реакции в системе, имеющие прямой физический смысл — превращение жидкой крови в гель. Весь остальной огромный каскад имеет исключительно регуляторное значение. Его целью является обеспечить превращение фибриногена в фибрин в нужном месте и в нужное время, и ни в коем случае не в другом месте.

Этот момент очень важен и его стоит подчеркнуть особо. Когда мы говорим о какой-либо метаболической системе, то в такой системе часто почти каждая реакция имеет физическое или химическое значение (например, в гликолизе каждая реакция представляет собой очередной шаг в постепенном превращении глюкозы в АТФ). В таких системах регуляция вплетена в систему неразрывно с химической функцией. Напротив, в свертывании конечный продукт делает только одна реакция полимеризации фибрина, она является необходимой и достаточной для результата — желирования плазмы. Все остальные реакции несут лишь сигнальную, информационную нагрузку и служат для того, чтобы эта реакция прошло в нужном месте в нужное время.

Белок фибриноген, постоянно присутствующий в крови, имеет выраженно неглобулярную форму (рис. 2, А), отличающую его от большинства плазменных белков.12 Он напоминает стержень или эллипсоид длиной 45 — 50 нм и толщиной 5—7 нм. Фибриноген является димером, состоящим из двух половинок, каждая из которых состоит из трех полипептидных цепей: Aa, Був, у. Эти половинки ковалентно связаны на своих N-концах. В области этих N-концов, в центре молекулы, находятся активные сайты. Активация этих сайтов осуществляется тромбином путем отрезания фибринопептидов A и Б, закрывающих активные сайты, которые также называются сайтами A и Б. В силу симметрии, на каждую молекулу отрезается по два фибринопептида каждого типа. Отщепление фибринопептидов A всегда происходит заметно быстрее, и является необходимым и достаточным для полимеризации. молекула фибриногена также несет комплементарные сайты a и b, по два на моле-

Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Реакции активации факторов свертывания показаны односторонними тонкими черными стрелками. При этом фигурные стрелки показывают под действием каких именно ферментов происходит эта активация. Обратимые реакции формирования комплексов показаны двусторонними тонкими черными стрелками. Ингибирование показано короткими белыми стрелками. Чтобы избежать перегруженности, на схеме не показаны: связывание тромбина с тромбомодулином, активация тромбоцитов какими-либо активаторами кроме тромбина, секреция тромбоцитов и контактная активация свертывания.

52

Клиническая онкогематология

Биохимия свертывания крови

Рис. 2. Фибриноген и фибриновый сгусток. А — Схематическое устройство молекулы сфибриногена. Основа молекулы составлена из трех пар полипептидных цепей, а, в и у, расположенных зеркально. FPA и FPB — фибринопептиды A и B. * — Карбогидратные кластеры. t — дисульфидные кольца. Воспроизведено из.70 Б — механизм сборки фибринового волокна: мономеры связываются «внахлест», по механизму «конец-к-середине». Воспроизведено из.71 В — электронная микрофотография фибринового сгустка. Отрезок в левом нижнем углу показывает масштаб — 5 мкм. Воспроизведено из.72

кулу. Две молекулы могут формировать A:a связи и строить фибриновую нить (рис. 2Б). Когда на этих нитях обрезаны фибринопептиды B, две нити могут латерально агрегировать, склеиваясь по B:b связям, и формировать фибриновое волокно. Это волокно дополнительно укрепляется поперечным сшивками, производимыми фактором XIIIa (белки свертывания называются факторами и нумеруются римскими цифрами в порядке офицального открытия; однако, для важнейших и старейших белков, таких, как тромбин и фибриноген, в литературе используются собственные имена, а не номера; индекс «а» означает активную форму, а его отсутствие — неактивный предшественник), который также активируется тромбином. Волокна могут разветвляться, образуя трехмерную сеть фибринового сгустка, изображенную на рис. 2, В.

Реакция полимеризации фибрина достаточно сложна, и до сих пор многие ее детали непонятны. В первую очередь, это связано с тем, что, как и большинство реакций полимеризации, это не одна, а бесконечное множество реакций: каждый олигомер фибрина может прореагировать с любым другим олигомером. Однако, для наших целей дальнейшее погружение в этот вопрос излишне. Достаточно знать, что эта реакция происходит быстро, полностью и необратимо, когда концентрация фибрина превышает некоторый уровень.13 А это значит, что вопрос об управлении свертыванием сводится к вопросу об управлении тромбином.

Тромбин - сериновая протеиназа

Поднимемся по схеме свертывания на шаг выше и перейдем к тромбину, ферменту, который производит разрезы на молекуле фибриногена и превращает его в фибрин. Тромбин принадлежит к семейству сериновых протеиназ, ферментов, способных осуществлять протеолиз — расщепление

пептидных связей в белках. Их отличают от других протеи-наз по наличию функционально необходимой аминокислоты серина в активном сайте. Таким образом, тромбин является близким родственником пищеварительных ферментов трипсина и химотрипсина (а также эластазы и ферментов комплемента и фибринолиза).2,4

Все сериновые протеиназы, включая пищеварительные, синтезируется в неактивном виде: это необходимая мера предосторожности, так как тот же химотрипсин или трипсин может запросто разрушить клетку, в которой он синтезировался. В этой форме, называемой зимогеном (предшественником фермента), белок свернут так, что активный сайт его закрыт и недоступен для других белков. Зимоген не обладает никакой активностью и может спокойно находиться в клетке или в крови. Чтобы его активировать, необходимо расщепить пептидную связь, удерживающую ту часть белка, которая закрывает активный сайт. После этого разрезания белок может начинать свою работу. Собственно, активация сериновой протеиназы очень напоминает превращение фибриногена в фибрин.

Весь каскад свертывания крови построен на этом принципе, и появление тромбина — классический пример. Он синтезируется в виде протромбина, неактивного зимогена, который может быть превращен в тромбин посредством разрезания двух пептидный связей в молекуле. Как видно из рис. 1 (на котором протромбин обозначен своим номенклатурным названием — фактор II), эта реакция катализируется другой сериновой протеиназой, фактором Xa. После разрезания «лишняя» часть протромбина отваливается, а оставшийся активный фермент тромбин начинает расщеплять фибриноген.

Активация каскада свертывания

Фибрин получается из фибриногена в результате частичного протеолиза фибриногена тромбином. Тромбин получается из протромбина в результате похожего процесса с участием фактора Xa. Как видно из схемы, эта цепочка продолжается выше: фактор X активируется фактором IXa, фактор IX — фактором XIa. Эта система активирующих друг друга ферментов, собственно, и называется каскадом. Но где-то необходимо поставить точку и разобраться, как же активируется самая первая сериновая протеиназа?

Главный «вход» в каскаде свертывания находится в середине, как раз на уровне фактора X. Эта система реакций, отвечающих за срабатывание системы свертывания называется внешним путем свертывания, или путем тканевого фактора.14 Основными компонентами этого пути являются два белка — фактор VIIa и тканевый фактор.

Фактор VIIa — сериновая протеиназа, близкая по своему строению к фактору Xa. Ее основная функция заключается в активации фактора X. Однако, фактор VIIa сам по себе практически не обладает ферментативной активностью, даже в «активированном» виде. Его активный сайт несовершенен, и благодаря этому фактор VIIa может присутствовать в крови в активированной форме: в отличие от других протеиназ свертывания, он не может причинить никакого вреда. Следует отметить, что не весь фактор VIIa присутствует в крови в активной форме; активировано лишь около 1—2% от общего количества.

Чтобы обрести полную ферментативную активность, фактору VIIa необходим кофактор, и в данной роли выступает белок тканевый фактор. Этот трансмембранный белок присутствует в мембранах почти всех клеток организма, за исключением эндотелия сосудов и клеток крови. Так он надежно изолирован от крови, но малейшее повреждение при-

www.medprint.ru

53

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

водит к его обнажению и контакту с кровью. Связывание фактора VIIa с тканевым фактором приводит к изменению конформации фактора VIIa, и фактор VIIa приобретает способность расщеплять и активировать фактор X. Комплекс фактора VIIa и тканевого фактора называется комплексом «внешней теназы».

Таким образом, система свертывания решает проблему распознавания повреждения благодаря тканевому фактору. Его присутствие делает любые ткани организма мощными активаторами свертывания, и кровь остается жидкой только благодаря тому, что в норме она всегда защищена тончайшей защитной оболочкой эндотелия. Любое нарушение целостности сосуда означает нарушение этой оболочки и контакт крови с субэндотелием, ведущий к связыванию фактора VIIa и тканевого фактора.

Кроме тканевого фактора, кофактором фактора VIIa может быть отрицательно заряженная фосфолипидная поверхность. В ее присутствии фактор VIIa может активировать фактор X, хотя и очень медленно. В организме такой поверхностью могут быть мембраны активированных тромбоцитов.15 Скорее всего, физиологическая роль этой реакции совершенно ничтожна. Однако, десять лет назад было высказано предположение, что она может играть ключевую роль в терапевтическом эффекте рекомбинантного активированного фактора VIIa (препарат НовоСэвен).15

Ингибиторы свертывания

Рассмотренные части системы свертывания, включающие в себя фибриноген, протромбин, факторы VIIa, X и тканевый фактор, уже вполне составляют систему, способную решить задачу свертывания. В отсутствие повреждения свертывания в такой системе не будет (тканевый фактор недоступен), но любое соскабливание эндотелия обнажает тканевый фактор и вызывает цепочку, ведущую к свертыванию.

Достаточно ли этих реакций? Какие еще реакции нам нужны? Простейшие оценки показывают, что каскад реакций сам по себе будет неустойчивым.16 Да, без тканевого фактора реакции не запустятся, но ведь в реальности не бывает абсолютов. Одна молекула тканевого фактора в такой системе сможет со временем активировать неограниченное количество молекул фактора X, в конечном итоге приведя к свертыванию всей плазмы. Каскад реакций без ингибиторов можно уподобить камню на вершине горы: он находится в равновесии, но оно неустойчиво. Малейший сдвиг вызовет лавину.

Для предотвращения неконтролируемой активации в крови присутствуют ингибиторы сериновых протеиназ свертывания. Этих ингибиторов много, некоторые из них специализированы, в то время как другие (а2-макроглобулин) работают как универсальные «ингибиторы-мусорщики», подавляющие активность любой сериновой протеина-зы. Основными ингибиторами свертывания являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора (tissue factor pathway inhibitor или TFPI).

Антитромбин III, ингибитор из семейства серпинов, ингибирует тромбин и факторы Xa, IXa, XIa посредством прямого связывания и блокирования их активных сайтов.17,18 Единственный фермент, на который он не оказывает почти никакого действия — это фактор VIIa. Для этого фермента существует специализированный ингибитор, TFPI.19 Он, в отличие от антитромбина, имеет несколько доменов для связывания. Он способен связать фактор VIIa одним из доменов только тогда, когда другой домен связывает фактор Xa. Т.о., этот необычный ингибитор работает только тогда, когда фактор X уже хотя бы частично, но активирован. Важное замечание — TFPI действует только на фак-

тор VIIa, связанный с тканевым фактором (так что в итоге получается четверичный комплекс белков). Свободный VIIa может циркулировать в кровотоке часами практически беспрепятственно.

Кроме описанных ингибиторов с прямым «связывающим» механизмом действия, предназначенных для инактивации сериновых протеиназ, в системе свертывания существует система реакций пути протеина С, занимающихся деградацией кофакторов свертывания. Она будет рассмотрена отдельно.

Кофакторы и мембранно-зависимые реакции

Фактор Xa сам по себе очень плохо активирует протромбин. Для того, чтобы эта реакция шла с высокой скоростью, ему необходимы кофакторы — фактор Va и отрицательно заряженная фосфолипидная поверхность.20 По-видимому, эта поверхность в организме предоставляется активированными тромбоцитами, микрочастицами и липопротеинами плазмы.21-24 При активации системы свертывания происходит активация тромбоцитов (об этом феномене мы еще поговорим подробнее), и в результате тромбоциты экспрессируют на внешнем слое своей мембраны отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин и специальные белки, улучшающие связывание факторов свертывания.21 Факторы Xa и Va связываются с мембранами тромбоцитов через мостики, образованные ионами кальция, и формируют ферментативный комплекс, протромбиназу, способный активировать протромбин на пять порядков быстрее, чем одиночный фактор Xa.20,21

Фактор Va представляет собой белок-кофактор, получающийся из фактора V путем частичного расщепления под действием тромбина.25 Как видим, круг замыкается. Фактор Xa изначально активирует небольшое количество протромбина в тромбин, который активирует фактор V Затем фактор Va увеличивает скорость активации протромбина фактором Xa, а продукт этой реакции, тромбин, опять активирует фактор V. Это называется петлей положительной обратной связи: продукт реакции стимулирует свое собственное производство.

Вторая важнейшая петля положительной обратной связи в свертывании крови связана с активацией фактора X. Помимо того, что этот фактор активируется комплексом внешней теназы, он активируется фактором IXa, который, в свою очередь, может активироваться внешней теназой. Однако, эта реакция сама по себе тоже протекает крайне медленно. Она ускоряется благодаря формированию комплекса факторами IXa и VIIIa на поверхности активированных тромбоцитов, который во многом аналогичен комплексу протром-биназы.26 Этот комплекс, который, как и внешняя теназа, активирует фактор X, называют «внутренней теназой». Факторы V и VIII являются гомологичными и оба активируются тромбином.

Отступление: доменная структура фактора VIII

Детальное рассмотрение внутримолекулярного устройства факторов свертывания лежит за пределами целей данного обзора. Тем не менее два исключения из этого правила (помимо уже сделанного выше исключения для фибриногена) будут здесь сделаны, так как знакомство с этим устройством весьма полезно для понимания обсуждаемых нами реакций. Нельзя, чтобы по прочтении текста образ белка в сознании читателя представлял собой лишь квадратик или кружок на реакционной схеме (рис. 1) с подходящими к нему и выходящими из него стрелочками. Кроме того, в некоторых случаях аспекты устройства белка имеют большое практическое значение.

54

Клиническая онкогематология

Биохимия свертывания крови

м и и

I 336 372 711 740 1649 1689 2021 2174 2332

Рис. 3. Доменная структура фактора VIII. Номера под схемой указывают аминокислотные остатки, являющиеся границами доменов. Домен B изображен не в масштабе. Указаны приблизительные положения свободных остатков цистеина (SH), сульфатированных остатков тирозина (SO4) и предположительного сайт связывания кальция (Ca2+). Воспроизведено из.27

К этим случаям относится фактор VIII. Этот белок-прокофактор синтезируется в виде одной полипептидной цепи, изображенной на рис. 3. В этой цепи выделяют три домена «А», один домен «В» и два домена «С», а также менее крупные «вставочные» домены. В кровотоке фактор VIII присутствует в виде димера: изображенная цепочка разрезается на границе между доменами В и А3, но молекула не разваливается, так как получившиеся цепи остаются связаны нековалентными связями. Внутри фрагмента В могут быть дополнительные разрезы, не влияющие на активность белка. При активации в молекуле делается еще несколько разрезов. Тромбин расщепляет фактор VIII около аргининового остатка под номером 372 (Арг372, между А1 и А2), в Арг740 (А2—В) и в Арг1689 на конце белка. При этом домен В уходит, а оставшийся гетеротример из А1, А2 и А3-С1-С2 может выполнять свою кофакторную функцию.27

В настоящий момент структура фактора VIII/VIIIa активно изучается и многие из описанных выше деталей обрели некоторый смысл. Например, выяснено, что разрез в Арг1689 жизненно важен для отсоединения активированного фактора VIII от фактора фон Виллебранда, в комплексе с которым он циркулирует в кровотоке. Если сделать точечную мутацию в этом месте, то разрезание не происходит, и фактор VIIIa не может отсоединиться от переносчика и выполнить свои функции. Это ведет к фенотипу типа гемофилии. Среди доменов выявлены те, которые отвечают за связывание с факторами IXa, X, Xa, тромбоцитами.

Самую большую загадку представляет собой огромный домен В, который отрезается и теряется в процессе активации (а иногда и до нее) и из-за этого не играет роли в активности фактора VIIIa. Тем не менее, именно этот домен в начале 2000-х годов послужил причиной довольно большого шума в фармацевтической промышленности. Когда рекомбинантный фактор VIII без фрагмента В начал использоваться в качестве лекарства при гемофилии, выяснилось, что два основных метода определения активности этого фактора (хромогенный тест и тест, основанный на времени свертывания) дают результаты, различающиеся на 30—50%. Это привело к большим проблемам по причине неясности того, какому методу верить при оценке физиологичности и как стандартизовать второй метод. Причины расхождения выясняются и обсуждаются до сих пор, равно как и роль домена В. А на практике решением проблемы с калибровкой стало использование специального отдельного стандарта для рекомбинантного фактора.28

Прочие петли положительной обратной связи

Несмотря на то, что фактор IX активируется внешней те-назой, он активируется еще одним ферментом свертывания, фактором XIa.29 Этот фактор, в свою очередь, активируется тромбином.30 [30]. Это — самая длинная из петель положительной обратной связи в свертывании крови, она ведет с самого низа каскада на самый его верх. Судя по относительно мягкому фенотипу гемофилии С, дефицита фактора XI, по сравнению с тяжелыми гемофилиями А и В, роль этой положительной связи не так существенна, как роль активации фактора VIII. Тем не менее она достаточно важна, чтобы ее нарушение вело к клинически значимым проявлениям.

Наконец, надо упомянуть еще об одной петле положительной обратной связи, связанной с активацией фактора VII. Фактор VIIa, способный активировать факторы IX и X, составляет всего лишь 1% от неактивного фактор VII. Этот зимоген может активироваться многими ферментами, но основными считаются фактор Xa и тромбин.31

Путь протеина С

В свертывании крови есть не только положительные, но и отрицательные обратные связи. С одной из них мы уже столкнулись выше: TFPI не может ингибировать внешнюю теназу сам по себе, необходимо присутствие фактора Xa. Так фактор Xa, продукт работы внешней теназы, способствует ее ингибированию. Другой важнейшей отрицательной обратной связью в свертывании является путь протеина С.32

Протеин С — предшественник сериновой протеиназы, очень похожей на факторы IX, X, VII и протромбин. Он активируется тромбином, как и фактор XI. Однако при активации получившаяся сериновая протеиназа использует свою ферментативную активность не для того, чтобы активировать другие белки, а для того, чтобы их инактивировать. Активированный протеин С производит несколько протеолитических расщеплений в факторах свертывания Va и VIIIa, заставляя их полностью терять свою кофакторную активность. Таким образом, тромбин, продукт каскада свертывания ингибирует свое собственное производство.

Путь протеина С регулируется несколькими важными кофакторами, в их числе протеин S, эндотелиальный рецептор протеина С и тромбомодулин. Протеин S является кофактором активированного протеина С в инактивации факторов Va и VIIIa. Два других белка являются важными мембранными белками, в большом количестве экспрессируемыми в эндотелии. Они связывают протеин С и тромбин, соответственно, увеличивая протекание активации протеина С тромбином на поверхности эндотелия с большой скоростью.

Контактная активация свертывания

До сих пор мы говорили только об одном способе активации свертывания — пути тканевого фактора. Однако, исторически первым был обнаружен другой, так называемый контактный путь свертывания.33 Благодаря ему, свертывание может активироваться при контакте с любой чужеродной поверхностью. Этот путь не показан на рис. 1. Основные белки этого пути — фактор XII, калликреин и высокомолекулярный кининоген. Фактор XII является очень необычной сериновой протеиназой: он способен активировать сам себя при контакте с отрицательно заряженными поверхностями. Затем, его производство усиливается благодаря сложным петлям положительной обратной связи с участием двух других белков контактной системы.34 Наработанный фактор XIIa активирует фактор XI, тем самым подсоединяясь к самой верхушке каскада свертывания.

Интересно то, что вся контактная система не имеет выраженного физиологического значения. Люди с дефицитами факторов контактной активации не имеют ни малейшей тенденции к кровоточивости; фактически, тот человек, в крови которого был впервые найден дефицит фактора XII и в честь которого он был назван фактором Хагемана, умер от тромбоэмболии. Факторы контактного пути участвуют во множестве процессов, включая воспалительные, фибринолиз и другие, но их физиологическое значение не очень ясно.33 В последнее время есть тенденция вообще не упоминать об этой системе в обзорах по свертыванию, как о не имеющей к нему отношения. Однако, это не совсем справедливо, так как этот путь может иметь большое значение в патологических

www.medprint.ru

55

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

ситациях, а также активировать свертывание при использовании различных имплантируемых приборов или приборов экстракорпореального кровообращения (аппарат искусственной почки).

Тромбоциты и их роль в свертывании

Как было упомянуто выше, ключевые реакции свертывания протекают на поверхности мембран активированных тромбоцитов. Эта не единственная форма участия тромбоцитов в плазменном свертывании, и потому на этих клетках стоит остановиться подробнее.

Тромбоциты представляют собой маленькие безъядерные клеточные фрагменты, циркулирующие в кровотоке и чутко реагирующие на повреждения сосуда. Иногда, особенно в старой литературе, их называют клетками, но в последнее время выяснение деталей их формирования привело к отходу от этой тенденции. Это именно фрагменты, большие и сложно структурированные везикулы, генерируемые мегакариоцитами в костном мозге. У них есть две известных функции: формирование тромбоцитарного агрегата и участие в формировании фибринового сгустка. На второй мы и сосредоточимся.

Особенностью тромбоцита является его способность к активации — быстрому и (как правило) необратимому переходу в новое состояние. Стимулом активации может служить практически любое возмущение окружающей среды, вплоть до простого механического напряжения. Однако, основными физиологическими активаторами считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса, он выполняет в плазменной системе задачу, очень похожую на задачу тканевого фактора), тромбин (уже знакомый нам белок плазменной системы свертывания), АДФ (аденозиндифосфат появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самими тромбоцитами) и тромбоксан А2 (вторичный активатор, секретируемый тромбоцитами; его дополнительная функция заключается в стимуляции вазоконстрикции).21

Будучи активированы, тромбоциты становятся способными прикрепляться к поврежденной сосудистой стенке (т. н. процесс адгезии) и друг к друг (т. н. процесс агрегации), формируя пробку, перекрывающую повреждение. Кроме того, они участвуют в плазменном свертывании двумя основными способами — экспонирование прокоагулянт-ной мембраны и секреция а-гранул.

Экспонирование прокоагулянтной мембраны. В нормальном состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свертывания. Отрицательно заряженные фосфолипиды, в первую очередь фосфатидилсерин, сосредоточены на внутреннем слое мембраны, а фосфатидилхо-лин внешнего слоя связывает факторы свертывания гораздо хуже. Несмотря на то что некоторые факторы свертывания могут связываться хорошо и с неактивированными тромбоцитами, это все равно не приводит к формированию активных ферментативных комплексов.35

Активация тромбоцита приводит к активации фермента скрамблазы, который начинает быстро, специфично, двусторонне и АДФ-независимо перебрасывать отрицательно заряженные фосфолипиды из одного слоя в другой.36 В результате происходит установление термодинамического равновесия, где концентрация фосфатидилсерина в обоих слоях выравнивается. Кроме того, при активации имеет место экспрессия и/ или стимуляция многих трансмембранных белков внешнего слоя, и они приобретают способность специфически связывать факторы свертывания, ускоряя реакции с их участием.

Точная природа мест связывания для факторов свертывания пока не установлена, но можно предположить, что они представляют собой сложные комплексы фосфолипидов

и белков.37 Для некоторых белков свертывания, в т. ч. протромбина, эти белки обнаружены и охарактеризованы, но таких белков немного.38

Активация тромбоцитов имеет несколько градаций, и экспрессия прокоагулянтной поверхности является одной из высших.21,23 Только тромбин или коллаген могут вызывать такой сильный ответ. Более слабые активаторы, особенно АДФ, могут участвовать в работе сильных активаторов, но самостоятельно не способны вызвать появление фосфа-тидилсерина. Эти сведения пока остаются феноменологическими — конкретные пути реакций, ведущих к ответу тромбоцитов, пока неясны.

В последние годы в прокоагулянтном ответе тромбоцитов была обнаружена необычная неоднородность.39 С точки зрения адгезии и агрегации, все активированные тромбоциты, по-видимому, равноправны. Однако по экспрессии фосфати-дилсерина тромбоциты делятся на две субпопуляции, различающиеся по этому показателю на несколько порядков. Таким образом, реально в свертывании участвует лишь несколько процентов активированных тромбоцитов, остальные же по своим прокоагулянтным качествам не отличаются от неактивированных.40 Механизмы формирования такой гетерогенности и ее физиологическое значение пока неясны. Предположительно, именно с тромбоцитами этой субпопуляции может связываться фактор VIIa, чтобы активировать фактор X, и поэтому именно она может быть ответственна за фармецевтиче-скую эффективность рекомбинантного фактора VIIa.41

Секреция а-гранул. Тромбоциты содержат несколько типов гранул, содержимое которых секретируется в процессе активации. Главными для свертывания являются а-гранулы, содержащие высокомолекулярные белки, такие как фактор V, фибриноген и другие. Значимость этой секреции для большинства белков до сих пор не вполне понятна, за исключением фактора V Он содержится в а-гранулах в относительно большом количестве (около 20% от плазменного пула), и при агрегации тромбоцитов его концентрация может очень сильно возрастать.42 Что еще более существенно, этот кофактор в тромбоцитах уже находится в частично активированной форме, которая может сразу ускорять скорость работы фактора Xa, без дополнительной активации тромбином.43 Есть клинические данные, что люди с дефицитом плазменного фактора V, но с нормальным тромбоцитарным фактором V не имеют склонности к кровоточивости. Напротив, люди могут проявлять тендецию к геморрагии, имея нормальный плазменный уровень фактора V если их тромбоцитарный фактор V дефектен.44

Недавно было показано, что по концентрации а-гранулярных белков после активации тромбоциты также неодинаковы. Можно выделить субпопуляцию (ту же самую, с повышенным фосфатидилсерином), на поверхности мембран тромбоцитов которой появляется плотный слой а-гранулярных белков. Эти тромбоциты получили название «укутанных».39

Тромбоциты также секретируют или экспрессируют другие белки, например, фактор XI. Однако, их содержание там невелико и локализация неясна.44

Отступление: тромбин - переключаемый фермент

Настало время для второго обещанного отступления — знакомства со структурой тромбина. Несмотря на то, что тромбин был самым первым ферментом свертывания, который мы рассмотрели, говорить сразу же о его структуре было неуместно без предварительного изучения многочисленных и разнообразных реакций, где он участвует. Теперь же, полностью погрузившись в устройство свертывания, мы можем поближе взглянуть на этот удивительный фермент.

56

Клиническая онкогематология

Биохимия свертывания крови

Как мы видели, на него замкнуты практически все петли обратной связи в системе, как положительные, так и отрицательные. При этом интересно отметить, что активность тромбина по отношению к своим субстратам непостоянна. Она может переключаться с помощью кофакторов, таких, как тромбомодулин. В отсутствие кофакторов тромбин прокоагулянтен: он расщепляет фибриноген, факторы XI, V, VIII, активирует тромбоциты. Активация протеина С идет очень медленно. Однако, при связывании тромбомоду-лина кинетика реакций драматически изменяется — расщепление фибриногена и других факторов во много раз замедляется, а протеина С — ускоряется на несколько порядков. Можно сказать, что тромбин существует в двух формах — про- и антикоагулянтной.

Подобное «переключение» достаточно распространено в системе свертывания. Правда, для большинства факторов оно имеет характер скорее «включения-выключения». Именно оно лежит в основе механизма запуска свертывания: фактор VIIa, «испорченный» фермент, включается при связывании тканевого фактора. Точно так же, факторы IXa и Xa, хоть и не полностью «испорченные», все же способны на много порядков увеличивать свою эффективность при связывании кофакторов факторов VIIIa и Va. Поскольку тромбин является самым важным и хорошо изученным ферментом свертывания, попробуем немного поближе взглянуть на него и на устройство таких переключений.

На рис. 4 показана трехмерная структура тромбина. Характерной чертой всех сериновых протеиназ является присутствие остатка аминокислоты серина в активном центре, играющей принципиальную роль в атаке расщепляемой пептидной связи. Кроме того, в структуре тромбина есть дополнительные детали, обеспечивающие его специфичность и позволяющие ему, в отличие от его родственника химотрип-сина, резать не все подряд, а только нужные белки в нужном месте. Вокруг активного сайта над поверхностью глобулы выдаются экзосайты — петли и участки аминокислотной цепочки. Гидрофобные петля-60 и у-петля способны взаимодействовать с гидрофобными остатками молекулы субстрата. Тромбин также имеет два анионсвязывающих экзосайта, называемых экзосайтами I и II. Эти заряженные участки мо-

Рис. 4. Структура тромбина. Показаны активный сайт и экзосайты, ответственные за связывание тромбина с субстратами и кофакторами: экзосайты I и II, петля-60, у-петля. Воспроизведено из.45

гут связываться с отрицательно заряженными участками на молекулах субстратов и кофакторов тромбина.

Основные прокоагулянтные реакции с участием тромбина (расщепление фибриногена, факторов V и VIII) протекают без кофакторов. Любопытно, что во всех этих реакциях активно задействованы экзосайты I и II. Тромбомодулин связывает тромбин через экзосайт I, а некоторые его формы могут также взаимодействовать с экзосайтом II. В результате прокоагулянтные реакции оказываются просто-напросто невозможными по причине блокирования сайта. Фибриноген и факторы свертывания не могут протиснуться к активному сайту, вход в который перегорожен тромбомодулином.

Итак, прокоагулянтные функции тромбина заблокированы. Как теперь усилить антикоагулянтные?

Первый из механизмов заключается в простом физическом приближении. Тромбин связывается с тромбомодулином, а протеин С — с эндотелиальным рецептором протеина С. В результате, два белка, ранее вынужденные искать друг друга в трехмерном пространстве, оказываются рядом и с большой вероятностью могут прореагировать. Второй механизм заключается в том, что связанные белки располагаются относительно друг друга правильным образом, способствующим увеличению скорости реакции. Наконец, третьим и самым важным механизмом является так называемая аллостерическая регуляция — так называется механизм регуляции активности фермента через изменение конформации его молекулы, которое индуцируется связыванием молекулы вещества-регулятора в т. н. аллостерическом центре, пространственно удаленном от активного центра. Так связывание тромбомодулина приводит к конформационным изменениям в молекуле тромбина, которые увеличивают эффективность расщепления протеина С. Взятые вместе, эти механизмы и дают наблюдаемое увеличение скорости реакции в 10 000 раз.

Существование тромбина в двух формах, про- и антикоагулянтной, есть лишь самый знаменитый пример его переключения. Подход, разобранный на примере тромбомодулина, активно используется для переключения тромбина на разные задачи. Используемый в антикоагулянтной терапии гепарин и его физиологический аналог гепаран сульфат работают точно так же, связывая экзосайт II (блокада прокоагулянтных реакций) и аллостерически меняя структуру тромбина (повышение эффективности связывания антитромбина III). Фибрин связывает тромбин через экзосайт I (блокада прокоагулянтных реакций, в свое время именно этот эффект привел к тому, что фибрин назвали антитромбином I) и стимулирует активацию фактора XIII. Тромбоци-тарный гликопротеин Iba связывает тромбин через экзосайт I и располагает оптимальным образом для расщепления рецептора PAR-1 (и активации тромбоцита), а также для активации фактора XI.

Таким образом, тромбин выглядит не просто переключаемым белком, а белком, переключаемым во множество режимов. В зависимости от концентраций разных кофакторов и от эффективности связывания он будет преимущественно находиться в одном из режимов. В настоящий момент, теория конкуренции кофакторов как одного из ключевых элементов в регуляции свертывания в целом, является популярной и активно развиваемой.45

Взаимодействие свертывания с другими системами

Система свертывания активно взаимодействует со многими системами организма и играет жизненно важную роль в ряде процессов, имеющих как прямое, так и достаточно отдаленное отношение к вопросу остановки кровотечения. Ввиду ограниченности объема, в данном разделе мы дадим лишь

www.medprint.ru

57

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

самые общие сведения и ссылки на обзоры, где эти вопросы рассмотрены более подробно.

Самой тесной и прямой является связь системы свертывания с фибринолизом. Фактически, фибринолиз — разрушение фибринового сгустка по мере восстановления поврежденной ткани — часто рассматривают как еще одно звено гемостаза, неразрывно связанное с сосудистым, тромбоцитарным и плазменным. Основной белок системы фибринолиза, плазмин, выполняет собственно расщепление фибриновой сети. Будучи сериновой протеиназой, родственной протеиназам свертывания, плазмин формируется из неактивного предшественника плазминогена под действием одного из двух активаторов плазминогена, тканевого или урокиназного. В норме эти реакции идут очень медленно, но они многократно ускоряются под воздействием фибрина. Таким образом, конечный этап функционирования системы свертывания является запускающим сигналом для системы фибринолиза. Рассматривать систему фибринолиза с ее многочисленными реакциями и плохо пока изученной регуляцией здесь невозможно, но необходимо отметить, что эта система пересекается с системой свертывания еще как минимум в двух существенных местах. Во-первых, плазминоген может активироваться факторами контактной активации.33 Во-вторых, тромбин способен активировать белок, называемый тромбинактивируемый ингибитор фибринолиза. Этот белок затем начинает модифицировать фибрин, делая ускорение реакций фибринолиза менее эффективным. Более подробно ознакомиться с системой фибринолиза можно в работах.46,47

Как отмечалось в самом начале, система свертывания имеет также многочисленные и древние родственные связи с иммунитетом. По-видимому, обе эти системы развились из защитной системы ранних многоклеточных организмов, и до сих пор их активация и функционирование тесно связаны. Связи между этими системами проходят на нескольких уровнях: эндотелий, тромбоциты, сериновые протеиназы.48 Так, воспалительные процессы ведут к активации клеток эндотелия и моноцитов, вызывая появление на них тканевого фактора и активацию свертывания.49 Тромбоциты секретируют многочисленные провоспалительные вещества, помимо про-коагулянтных. Тромбоциты могут активироваться системой комплемента; они также могут вызывать ее активацию.33 Сериновые протеиназы свертывания, в первую очередь тромбин и фактор Xa, связываются с протеиназо-активируемыми рецепторами на эндотелии и клетках иммунной системы, вызывая в них воспалительные ответы.48,50

Особое место в связи с иммунитетом занимает контактная система свертывания, роль которой в гемостазе непонятна. Зато было обнаружено, что активация контактной системы играет большую роль в иммунитете. Активация ки-ниногена ведет не только к появлению белка, улучшающего активацию фактора XII, но и отщеплению от кининоге-на пептида брадикинина, являющегося важным регулятором воспаления. У людей с отсутствием факторов контактной активации обнаружены нарушения в движении клеток иммунной системы к очагу воспаления.33

Помимо приведенных выше ссылок, свежие данные о проблеме связи свертывания и иммунитета можно найти в обзорах.3,51-53

В самое последнее время было сделано несколько ключевых открытий, выявивших роль свертывания в ангиогенезе. Важнейшую роль в этом сыграли исследования на мышах, у которых были модифицированы гены, ответственные за факторы свертывания. Оказалось, что ряд факторов свертывания (тканевый фактор, фактор Va, тромбин) играют ключевую роль в развитии сосудистой системы на эмбрио-

нальной стадии; помимо того, система фибринолиза регулирует ангиогенез во взрослом состоянии, управляя разрушением межклеточного матрикса и миграцией гладкомышечных и эндотелиальных клеток.54,55

Эта сигнализация свертывания в ангиогенезе имеет колоссальное значение для практических приложений, в первую очередь, для лечения раковых заболеваний. Хорошо известно, что раковые заболевания почти всегда ведут к патологической гиперкоагуляции, усиливаемой почти всеми видами противоопухолевой терапии. Эта гиперкоагуляция является второй по значимости среди причин смертности при раке. Тромбоз, наблюдаемый при опухолевых заболеваниях, получил название синдрома Труссо. Однако, верно и обратное: свертывание играет центральную роль в развитии опухоли и метастазов.56 Тканевый фактор запускает несколько путей, которые могут как включать в себя активацию собственно свертывания, так и не включать. Механизмы регуляции опухоли процессами свертывания и возможное терапевтическое воздействие на опухоль через антисвертывающую терапию обсуждаются в работах.57-59

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свертывание крови является жизненно важным механизмом, обеспечивающим целостность сосудистой системы в случае повреждения, а также выполняющим ряд иных функций. Оно играет ключевую роль в физиологических и патологических условиях, и нарушения свертывания являются одной из лидирующих причин смертности в мире.

В настоящей части нашего обзора мы сосредоточились на самой первой и основополагающей задаче — биохимическом устройстве каскада свертывания. Система плазменного свертывания на настоящий момент изучена очень хорошо. В ней уже лет пятнадцать не открывали новых белков, что для современной биохимии составляет целую вечность. Можно сказать, с точки зрения открытия новых участников процесса это истоптанное поле: измерены концентрации всех участников, померены константы реакций. Конечно, нельзя исключить вероятность открытия чего-то нового, но нет ни одного явления, которое мы не могли бы объяснить при помощи имеющихся сведений о системе. Скорее уж, наоборот, система выглядит гораздо сложнее, чем нужно!

Почему система свертывания построена в виде каскада? Зачем нужны петли положительной обратной связи — активации факторов V, VII, VIII, XI, XIII, тромбоцитов? Ведь по существу это означает, что реакция, которую можно было бы сразу сделать быстрой (никаких физикохимических запретов на это нет), сначала «портится», а потом «исправляется» путем добавления кофакторов. Фактор VII, который мог бы сразу присутствовать в 100% активной форме, циркулирует в кровотоке активным лишь на 1% и только при запуске свертывания начинает активироваться дальше. Зачем нужен большой и сложный путь протеина С, когда ингибирование факторов Va и VIIIa можно было бы осуществить гораздо более простым способом (например, спонтанной потерей активности, как это реализовано на самом деле для фактора VIIIa)? Если уж делать путь протеина С, то зачем делать активацию протеина С тромбином безумно медленной, а потом использовать тромбомодулин, чтобы ее ускорить?

Сложность и запутанность каскада свертывания с бесчисленными положительными и отрицательными обратными связями делает понимание его функционирования крайне сложной задачей. А без понимания не может быть ни осмысленной диагностики, ни систематически успешного лечения. Самый простой и жизненно важный вопрос — как подавить

58

Клиническая онкогематология

Биохимия свертывания крови

острое патологическое свертывание, не нарушая нормального гемостаза, пока остается без ответа.

Именно поэтому сейчас исследователи от вопроса «Как устроено свертывание?» постепенно переходят к вопросам «Почему свертывание устроено именно так?», «Как оно ра-

ботает?», «Какую функцию выполняет этот элемент каскада?», и, наконец, к самому главному вопросу «Как нам нужно воздействовать на свертывание, чтобы добиться желаемого эффекта?» Этим задачам и будут посвящены вторая и третья части нашего обзора.

Благодарности

Мы глубоко признательны А.Н. Баландиной, М.А. Волковой, А.С. Горбатенко, Я.Н. Котовой, Е.И. Синауридзе и А.М. Шибеко за чтение рукописи и ценную критику. Работа была поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 07-04-00146 и № 06-04-48426, а также грантом Федерального агенства по науке и инновациям

МК-7062.2006.4.

Приложение: компоненты свертывания крови

Таблица 1. Белки-факторы свертывания крови

Название Описание0

Фибриноген (фактор I)12-60-61 Плазменный гликопротеин (мол. масса 340 кД), представляющий собой сложный гексамер из трех парных полипептидных цепей. Это ключевой компонент гемостаза, непосредственно реализующий свертывание. В реакции, катализируемой тромбином, фибриноген превращается в фибрин, который полимеризуется и тем самым желирует плазму. Фибриноген также выполняет функцию "мостика" при агрегации тромбоцитов, связывая их через поверхностные белки, гликопротеины IIb/IIIa. Средняя плазменная концентрация 9 мкМ (~3 мг/мл). Секретируется из а-гранул тромбоцитов в количестве 140 мкг/109 тромбоцитов. Синтезируется преимущественно в печени. Недостаточность функции фибриногена обозначается терминами а-, гипо, дис-, или гиподисфибриногенемия, а также фибриногенопения, имеющими несколько разный смысл. Она может быть наследственной (редкое аутосомно-рецессивное или аутосомно-доминантное заболевание) или приобретенной (коагулопатия потребления при ДВС-синдроме, поражение печени, аутоантитела). Полный дефицит ведет к тяжелым кровотечениям. Повышенный фибриноген является фактором риска для тромбоза и разнообразных сердечно-сосудистых патологий. Термин "фибриноген" был введен Вирховым (Пруссия, 1856) для гипотетического предшественника нерастворимой субстанции сгустка, незадолго до того названной "фибрином" (Мюллер, 1832). Белок фибриноген был впервые выделен Хаммарстеном (Уппсала, 1880)

Протромбин (фактор II)2062 Плазменный а1-глобулин (мол. масса 72 кД), предшественник сериновой протеиназы. Под действием ферментативного комплекса протромбиназы, состоящего из факторов Xa и Va, связанных с фосфолипидной поверхностью в присутствии кальция, превращается в активную сериновую протеиназу тромбин. Тромбин является основным регулятором свертывания, расщепляющим фибриноген, активирующим факторы V, VIII, XI, XIII и тромбоциты, активирующим в комплексе с тромбомодулином протеин С и выполняющим еще ряд физиологических функций. Тромбин теряет активность при связывании с антитромбином III и другими ингибиторами в плазме. Средняя плазменная концентрация протромбина 1400 нМ. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. Недостаточность функции протромбина может называться гипо- или диспротромбинемией, в современной литературе есть также тенденция называть ее просто дефицитом протромбина или дефицитом фактора II. Гипопротромбинемия может быть наследственной (редкое аутосомно-рецессивное заболевание) или приобретенной (коагулопатия, поражение печени, дефицит витамина К, редко аутоантитела). Частичный дефицит ведет к тяжелым кровотечениям, полный дефицит у человека не наблюдался. У мышей нокаут гена протромбина ведет к нарушению ангиогенеза и частичной летальности на эмбриональной стадии. Повышенная функция протромбина (мутация, беременность) увеличивает риск тромбоэмболии. Существование тромбина было впервые предсказано Бухананом (Шотландия, 1836). Впоследствии тромбин был переоткрыт Шмидтом (Эстония, 1861), предсказавшим его ферментативную природу. Наличие протромбина в плазме было впервые экспериментально доказано Пекельхарингом (Утрехт, 1891). Высокоочищенный протромбин был впервые получен Сигерсом (США, 1938)

Тканевый фактор (тромбопластин, фактор III)15,57 Трансмембранный гликопротеин (мол. масса 44 кД). Представляет собой кофактор, связывающий фактор VIIa из плазмы, формируя комплекс внешней теназы и активируя факторы IX и X. Комплекс внешней теназы ингибируется ингибитором пути тканевого фактора в сложной фактор Xa-зависимой реакции. В норме тканевый фактор присутствует во всех тканях, кроме эндотелия и клеток крови. Таким образом, он изолируется от крови, а его экспонирование или экспрессирование является ключевым механизмом запуска свертывания. Оно может быть результатом физического повреждения, воспалительного процесса или химического воздействия. Наличие и значимость тканевого фактора в клетках крови и плазме до сих пор являются спорными. Тканевый фактор также играет жизненно важную роль в процессах ангиогенеза. Синтезируется в клетках тканей. Ни частичный, ни полный дефицит тканевого фактора у человека не описаны. У мышей нокаут гена тканевого фактора ведет к нарушению ангиогенеза и летальности на эмбриональной стадии. Ускорение свертывание крови поврежденной тканью было известно с древних времен. Идея о существовании конкретного вещества, ответственного за это, была предложена Раушенбахом (1883), и развита Моравицем (1905). Термин "тромбопластин" был введен Хоуэллом (1912), который правильно предположил, что стимулятор свертывания представляет собой смесь белка и фосфолипида. Термин "тканевый фактор" для белковой части активатора свертывания был предложен Немерсоном (США, 1968), который впоследствии открыл фактор VII-зависимый механизм активации свертывания (1976) и выделил тканевый фактор (1982).

Фактор IV63 Кальций. Термин "фактор IV" вышел из употребления.

Фактор V (проакцелерин, АК-глобулин)20,25,43 Плазменный в-глобулин (мол. масса 330 кД), прокофактор, гомолог фактора VIII. Активируется тромбином и, в меньшей степени, фактором Xa. Фактор Va способен связываться с фактором Xa на фосфолипидных мембранах в присутствии ионов кальция, формируя комплекс протромбиназы, который активирует протромбин в тромбин. Фактор Va теряет активность в результате протеолитического расщепления активированным протеином С. Средняя плазменная концентрация 20 нМ. Секретируется в частично активной форме из а-гранул тромбоцитов при их активации в количестве 4.4 мкг/109 тромбоцитов. Синтезируется в печени. Дефицит фактора V называют парагемофилией (гипопроакцелеринемия, болезнь Оурена), это редкое аутосомно-доминантное заболевание. Приобретенный дефицит наблюдается при поражениях печени, может возникать в результате выработки аутоантител. Сопровождается умеренными кровотечениями. Полный дефицит у человека не наблюдался. У мышей нокаут гена фактора V ведет к нарушению ангиогенеза и частичной летальности на эмбриональной стадии. Открыт Оуреном (Норвегия, 1944). Выделен и охарактеризован Нешеймом (США, 1979).

Фактор VI63 Активированный фактор V, т.е. фактор Va. Термин вышел из употребления. Термин "фактор VI" был введен Оуреном, открывателем фактора V, но не был поддержан международным стандартизационным комитетом, который взамен рекомендовал обозначать активированные факторы тем же номером, что и неактивированные, но с добавлением буква "a". Несмотря на то, что термин "фактор VI" давно не употребляется, этот номер не был позднее использован для другого фактора.

Фактор VII (проконвертин)1531 Плазменный а-глобулин (мол. масса 63 кД), предшественник сериновой протеиназы. Под действием факторов IXa, Xa, IIa превращается в активную форму, фактор VIIa. Однако, этот активный фермент способен расщеплять свои субстраты, факторы IX и X, только в присутствии кофактора, тканевого фактора или фосфолипидных мембран. "Псевдоактивный" фактор VIIa почти не ингибируется плазменными ингибиторами, и является единственным ферментом свертывания, циркулирующим в кровотоке в активной форме в значительном количестве. В нормальном состоянии, концентрации факторов VIIa и VII в неактивированной плазме составляют 0.1 и 10 нМ, соответственно. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. Фактор VII может также активироваться фактором XIIa и калликреином. Вероятно, эти реакции не имеют физиологического значения. Однако, они являются важными при проведении экспериментов in vitro, так как охлаждение плазмы подавляет активность ингибиторов контактной системы. В результате активируются факторы контактной фазы и фактор VII. Именно из-за этого феномена холодовой активации плазму, предназначенную для исследований свертывания, категорически запрещено хранить в холодильнике. Дефицит фактора VIIa, гипопроконвертинемия, может быть наследственной (редкое аутосомно-рецессивное заболевание) или приобретенной (поражение печени, дефицит витамина К, аутоантитела). Степень тяжести кровотечений варьирует. Открыт Оуэном (США, 1947).

www .medprint.ru 59

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

Название Описание0

Фактор VIII (антигемофильный глобулин)26-27 Плазменный /32-глобулин (мол. масса 293 кД). прокофактор- гомолог фактора V. Активируется тромбином и. в меньшей степени- фактором Xa. Фактор VIIIa способен связываться с фактором IXa на фосфолипидных мембранах в присутствии кальция- формируя комплекс внутренней теназы-который активирует фактор X в Xa. Фактор VIIIa нестабилен и спонтанно теряет активность в результате диссоциации на субъединицы- а также протеолитического расщепления активированным протеином С- факторами IXa и Xa. Средняя плазменная концентрация 0.7 нМ- циркулирует в комплексе с фактором фон Виллебрандта- который диссоциирует при активации. Синтезируется в печени. Наследственный дефицит функции фактора VIII- гемофилия А (классическая гемофилия)- является одним из самых распространенных наследственных заболеваний свертывания. Сопровождается тяжелыми кровотечениями и спонтанными кровоизлияниями в суставах. Наследуется рецессивно- сцеплена с Х-хромосомой. Гемофилия также может быть приобретенной (развитие аутоантител к фактор VIII наиболее часто среди факторов свертывания). Открыт Патеком (1936-37). В 30-е и 40-е годы были получены грубо очищенные препараты фактора VIII- но его существование и сама природа гемофилии были предметом ожесточенных дебатов еще несколько десятилетий. Возможно- эти разногласия являются причиной того- что фактору был присвоен достаточно "поздний" номер- несмотря на то- что гемофилия была известна гораздо раньше- чем редкие заболевания- позволившие обнаружить фактор V или VII.

Фактор IX (фактор Кристмаса)26-27 Плазменный а1-глобулин (мол. масса 57 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Превращается в активную сериновую протеиназу под действием фактора XIa или внешней теназы. Фактор IXa активирует фактор X. Он также может формировать с фактором VIIIa мембранно-связанный комплекс внутренней теназы- в котором скорость активации фактора X увеличивается на порядки. Фактор IXa ингибируется антитромбином III. Средняя плазменная концентрация фактора IX — 90 нМ. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. Наследственный дефицит функции фактора IX- гемофилия B- является вторым по распространенности среди гемофилий. Сопровождается тяжелыми кровотечениями и спонтанными кровоизлияниями в суставах. Наследуется рецессивно- сцеплена с Х-хромосомой. Гемофилия также может быть приобретенной (аутоантитела). Существование второго вида гемофилии было впервые обнаружено Павловски (Буэнос-Айрес- 1947)- но окончательно доказано и изучено тремя независимыми группами исследователей в 1952. Дефицит фактора был назван "болезнью Кристмаса" по имени первого пациента одной из этих групп.

Фактор X (фактор Стюарта-Прауэра)20-26 Плазменный а1-глобулин (мол. масса 60 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Превращается в активную сериновую протеиназу под действием внутренней или внешней теназ. Фактор Xa активирует протромбин- а также может формировать с фактором Va мембранно-связанный комплекс протромбиназы- в котором скорость активации протромбина увеличивается на порядки. Фактор Xa ингибируется антитромбином III и другими ингибиторами плазмы. Средняя плазменная концентрация фактора X — 200 нМ. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. Дефицит фактора X может быть наследственным (редкое аутосомно-рецессивное заболевание) или приобретенным (поражение печени- дефицит витамина К). Степень тяжести кровотечений варьирует. Фактор X был обнаружен Дюкертом (Швейцария- 1955)- спустя два года Худжи и соавторы (США- 1957) подтвердили- что это новый фактор-отличный от фактора VII.

Фактор XI (плазменный предшественник тромбопластина)29-30 Плазменный у-глобулин (мол. масса 160 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Превращается в активную сериновую протеиназу под действием фактора XIIa или тромбина. Фактор XIa активирует фактор IX. Ингибируется антитромбином III и другими ингибиторами плазмы. Средняя плазменная концентрация фактора XI — 30 нМ. Также содержится в тромбоцитах. Синтезируется в печени. Наследственный дефицит фактора XI- гемофилия C- является третьей по распространенности среди гемофилий. Сопровождается умеренными кровотечениями. Наследуется аутосомно-рецессивно- также может быть приобретенной (коагулопатия- аутоантитела в редких случаях). Открыт Розенталем (США- 1953).

Фактор XII (фактор Хагемана)33-34 Плазменный в-глобулин (мол. масса 80 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Превращается в активную сериновую протеиназу аутокаталитическим образом при контакте с отрицательно заряженной поверхностью- а также под действием калликреина. Фактор XIIa активирует фактор XI- а также ряд факторов контактного пути и фибринолиза. Средняя плазменная концентрация фактора XII — 450 нМ. Синтезируется в печени. Дефицит фактора XII- синдром Хагемана- — редкое аутосомно-рецессивное наследственное заболевание- не проявляется клинически. Фактор XII был открыт Раттноффом и Колопи (США- 1955).

Фактор XIII (фибрин- стабилизирующий фактор)64-65 Плазменный в-глобулин (мол. масса 320 кД)- предшественник фермента трансамидазы (трансглютаминазы). Активируется тромбином- и в активной форме образует поперечные сшивки между молекулами фибрина- укрепляя сгусток. Плазменная концентрация 100 нМ- синтезируется в мегакариоцитах. Дефицит наследуется аутосомно-рецессивно- сопровождается кровотечениями- медленным и нарушенным заживлением ран (остаются шрамы). Приобретенный дефицит наблюдался редко. Появление аутоантител наблюдалось при лечении изониазидом- пенициллином- фенитоином-массивных трансфузиях. Фактор XIII был открыт Роббинсом (1944). Через четыре года было показано- что он является белком (Лаки и Лоранд- 1948)- и еще через тринадцать лет он был очищен (Лоуи- 1961).

Прекалликреин (фактор Флетчера)33-34 Плазменный в-глобулин (мол. масса 90 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Активируется фактором XIIa- в активной форме активирует фактор XII- отщепляет брадикинин от высокомолекулярного кининогена- активирует плазминоген и компонент C1 комплемента. Плазменная концентрация 340 нМ- синтезируется в печени. Дефицит не проявляется клинически. Существование нового фактора в системе контактной активации было обнаружено Хатауэем (1965). Вюэппер (1973) показал идентичность этого фактора прекалликреину. Ввиду того- что это вещество не имело явной физиологической роли в свертывании и было известно раньше- римская цифра ему присвоена не была.

Высокомолекулярный кининоген (фактор Фитцджеральда)33-34 Плазменный а-глобулин (мол. масса 160 кД)- предшественник кофактора. Активируется калликреином- в активной форме является кофактором активации фактора XII калликреином. Активация также отщепляет от высокомолекулярного кининогена сигнальный пептид брадикинин. Плазменная концентрация 500 нМ. Секретируется из ?-гранул тромбоцитов при их активации в количестве 0.6 мкг/109 тромбоцитов. Синтезируется в печени. Дефицит не проявляется клинически. Существование "кофактора контактной активации" было обнаружено Шиффманом (1960)- но его работы были проигнорированы из-за отсутствия пациентов с дефицитом этого кофактора. Семьи с дефицитом были независимо обнаружены несколькими группами в 1975-76 гг. Вюэппер (1975) показал- что это вещество идентично высокомолекулярному кининогену.

Фактор фон Виллебранда66 Плазменный гликопротеин. Циркулирует в кровотоке в виде мультимерных комплексов- для одной субединицы мол. масса 260 кД. Фактор фон Виллебранда выполняет две важные роли в двух разных звеньях гемостаза- являясь носителем для фактора VIII и посредником при адгезии тромбоцитов к коллагену в месте повреждения. Плазменная концентрация 10 мкг/мл. Секретируется из а-гранул тромбоцитов при их активации в количестве 0.34 мкг/109 тромбоцитов. Синтезируется эндотелием и некоторыми другими тканями. Болезнь фон Виллебранда- наследственный или приобретенный дефицит фактора- является самым распространенным нарушением свертывания у людей. Наследственные нарушения- не обязательно ведущие к клиническим проявлениям- обнаруживаются у 1-3% населения. Ведет к кровоточивости разной степени тяжести. Приобретенный дефицит фактора фон Виллебранда (аутоантитела) также встречается довольно часто по сравнению с другими факторами свертывания. Болезнь фон Виллебранда получила свое название в честь финского исследователя- обнаружившего это наследственное заболевание у одной семьи с Аландских островов (1926) и посвятившего много лет ее изучению. Впоследствии было выяснено- что эта болезнь наблюдалась неоднократно до него- но ее путали с обычной гемофилией. Когда в 70-х годах XX века химическая природа недостающего фактора прояснилась- он был также назван в честь первооткрывателя заболевания.

Антитромбин I63 Фибрин. Термин вышел из употребления. В 1962 Сигерс классифицировал все виды антитромбиновой активности в плазме- включив туда фибрин под названием "антитромбин I"- так как фибрин способен связывать тромбин. Из этой классификации в современной литературе сохранился только антитромбин III.

Антитромбин III17-18 Ингибитор сериновых протеиназ (мол. масса 160 кД). Антитромбин III необратимо связывает и ингибирует тромбин- а также прочие сериновые протеиназы свертывания- за исключением VIIa. Наряду с ингибитором пути тканевого фактора- является важнейшим и жизненно необходимым регулятором системы свертывания. Плазменная концентрация 3400 нМ. Синтезируется в печени. Недостаточность функции антитромбина III (встречается редко) ведет к тромбозу- полный дефицит у человека неизвестен. У мышей нокаут гена ведет к летальности на эмбриональной стадии. Первым- кто заметил антисвертывающую активность сыворотки- был Буханан (1845). На протяжении более чем ста лет после него существование и природа этой активности были предметом дискуссий- пока Брамбел (1957) не выделил белок-антитромбин из плазмы. Современное название "антитромбин III" было дано Сигерсом (1962)- который классифицировал антитромбиновую активность плазмы- выделив шесть типов "антитромбинов". Из них в современной классификации сохранился только антитромбин III.

60

Клиническая онкогематология

Биохимия свертывания крови

Название Описание0

Ингибитор пути тканевого фактора (tissue factor pathway inhibitor или TFPI)19 Ингибитор сериновых протеиназ (мол. масса 40 кД). Необратимо ингибирует комплекс фактора Vila и тканевого фактора в сложной Xa-зависимой реакции. Синтезируется эндотелием. Нормальная плазменная концентрация 2-5 нМ. Распределен в сосуде следующим образом: 80-85% связано с эндотелием- 10% циркулирует в плазме и связано с липопротеинами- около 3% обнаружено в тромбоцитах. Частичный и полный дефицит TFPI в клинике не обнаружен. Диагностика затруднена тем. что плазменный TFPI составляет лишь малую и нерепрезентативную часть полного пула ингибитора. Концентрация TFPI снижается на 25% при приеме оральных контрацептивов- незначительно снижена у новорожденных. Повышается при беременности- может повышаться в преклонном возрасте- предположительно- в результате повреждения эндотелия. Может повышаться до 5 и более раз при длительной гепаринотерапии. Как минимум одна группа сообщала- что пониженные концентрации и некоторые мутации TFPI связаны с повышенным риском тромбоза- но эти данные не подтверждались другими группами. У мышей нокаут гена TFPI ведет к летальности на эмбриональной стадии. Вплоть до 1983 года- было известно два механизма ингибирования свертывания — ингибирование сериновых протеиназ тромбином и разрушение факторов V и VIII активированным протеином С. Третьим и последним жизненно важным механизмом стал TFPI. Принципиальное деказательство существования такого ингибитора было получено группой Рапапорта (США- 1983). Выяснение роли различных доменов ингибитора и механизма его действия было осуществлено группой Броуза (1989). Общепринятого русскоязычного сокращения не существуй в равной степени используются термины TFPI и ИПТФ.

Прочие прямые ингибиторы сериновых протеиназ17-18 Помимо антитромбина III и TFPI- плазма крови содержит ряд ингибиторов- способных подавлять активность сериновых протеиназ крови - как-то: а2-макроглобулин- а2-антиплазмин- а1-антитрипсин- C1 ингибитор- кофактор гепарина II- ингибитор протеина C. Их плазменные концентрации составляют 3000- 1100- 40000- 1700-1400- 90 нМ- соответственно. Кроме того- а2-макроглобулин- а2-антиплазмин- агантитрипсин- C1 ингибитор секретируются из а-гранул тромбоцитов при их активации в количестве 2.0- 0.06- 0.4 и 0.6 мкг/109 тромбоцитов- соответственно. Каждый из этих ингибиторов поодиночке обладает невысокой эффективностью по сравнению с антитромбином- но их суммарный вклад весьма значителен. Для тромбина он может достигать 40-50%- а для фактора XIa — 60-70%.

Протеин С32-67 Плазменный белок (мол. масса 62 кД)- предшественник сериновой протеиназы. Активируется тромбином- реакция на четрые порядка ускоряется тромбомодулином. После активации может расщеплять и инактивировать факторы Va и VIIIa- эта реакция ускоряется протеином S. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. Наследственный дефицит протеина С ведет к повышенному риску тромбоэмболии. Гомозиготный дефицит ведет к ДВС у новорожденных. У мышей нокаут гена ведет к развитию ДВС после 12 дней эмбрионального развития и смерти не позднее 24 часов после рождения. Наличие некоего ингибитора- появляющегося при добавлении тромбина к протромбиновому комплексу- было обнаружено в группе Сигерса (США-1960). Он был назван аутопротромбин II-A. Протеин С был открыт Стенфло (США- 1976) в хроматографической фракции С- от которой происходит его название. Он оказался предшественником аутопротромбина II-A (Сигерс- США- 1976).

Тромбомодулин32-67 Интегральный мембранный белок- экспрессированный на поверхности эндотелия (мол. масса 74 кД). Является кофактором тромбина при активации протеина С. Недостаточная экспрессия тромбомодулина ведет к тромбозу- полный дефицит у человека не описан. У мышей нокаут гена ведет к летальности на 10 день эмбрионального развития. Открыт Эсмоном (США- 1981).

Протеин S32 Плазменный гликопротеин (мол. масса 70 кД). Действует как кофактор активированного протеина С при инактивации факторов Va и VIIIa. По некоторым сведениям- обладает самостоятельным ингибирующим действием по отношению к внутренней теназе и протромбиназе. Плазменная концентрация 350 нМ- но значительная часть находится в комплексе с белком комплемента C4b и не обладает кофакторной активностью. Синтезируется в печени витамин К-зависимым образом. По своей химической природе протеин S является родственником зимогенов сериновых протеаз (факторы II- X- VII- протеин С и других)- в ходе эволюции потерявшим активный сайт. Предположительно- именно это родство позволяет ему самостоятельно ингибировать протромбиназу и теназу: будучи похож на фактор IXa и Xa- он может вытеснять их из комплексов. Дефицит протеина S — редкое наследственное заболевание- ведущее к тромбозу. Как и с прочими витамин К-зависимыми белками- дефицит протеина S наблюдается при поражениях печени- дефиците витамина К- терапии варфарином и т.п. Однако- в этих случаях наблюдаются обычно анти-коагулянтные нарушения из-за сопутствующих дефицитов прокоагулянтных факторов. Открыт ДиСципио (США- 1977)- назван по месту открытия (город Сиэттл- Seattle).

■ В большинстве случаев концентрации факторов свертывания приведены по.7-11 Количество факторов, содержащихся в тромбоцитах, приведены по.44 Дефициты факторов свертывания описаны преимущественно по.7-63-68 Сведения об открытии и первом выделении факторов взяты из.63

Таблица 2. Небелковые компоненты системы свертывания

Название Описание0

Тромбоциты21-23-36-39 Небольшие (2-4 мкм диаметром) дискообразные клеточные фрагменты- играющие критически важную роль в гемостазе и тромбозе. Тромбоциты выполняют две функции: 1) формирование тромбоцитарного агрегата- первичной пробки- закрывающей место повреждения сосуда; 2) ускорение плазменного свертывания путем секреции факторов свертывания и экспресии прокоагулянтной мембраны для сборки ферментативных комплексов. Нормальная плазменная концентрация 150 000-300 000 в 1 мкл. Уменьшение количества тромбоцитов ведет к желудочно-кишечным кровотечениям- увеличению времени первичного гемостаза и появлению характерных подкожных кровоизлияний — пурпуре. Тромбоцитопения имеет чаще всего иммунологические причины. Разнообразные наследственные и приобретенные нарушения функции тромбоцита также могут приводить к кровоточивости. Повышенное производство тромбоцитов ведет к увеличению их нормальной концентрации- тромбоцитозу. В связи с неточностью описаний- отсутствием фотографической техники и запутанностью терминологии ранней микроскопии- время первого наблюдения тромбоцитов неизвестно. Чаще всего- их открытие приписывается Донне (Париж- 1842)- однако есть данные- что их наблюдал еще сам создатель микроскопа- ван Левенгук (Нидерланды- 1677). Термин "кровяные пластинки"- который до сих пор является предпочтительным в англоязычной литературе ("blood platelets")- был введен Биццоцеро (Турин- 1881)- который также сыграл ведущую роль в выявлении их связи с гемостазом. Это впоследствии привело к появлению термина "тромбоцит" (Декхюйзен- 1901)- который в русском языке стал основным- а в англоязычной литературе используется исключительно для ядерных клеток-тромбоцитов у не-млекопитающих ("thrombocytes"). Кроме того- в русской литературе для тромбоцитов может употребляться термин "бляшка Биццоцеро".

Кальций- фактор IV63-69 Двухвалентный катион (атомная масса 40.078)- участвующий в связывании витамин К-зависимых факторов свертывания с фосфолипидами. Является абсолютно необходимым для протекания ключевых реакций свертывания. Хелатирующие вещества (связывающие кальций — такие как цитрат натрия и этилендиаминтетрауксусная кислота) широко используются в качестве антикоагулянтов при взятии крови. Нормальная плазменная концентрация кальция 2-0-2-5 мМ. Кальций играет жизненно важную роль в многочисленных процессах- и его концентрация в плазме поддерживается организмом постоянной с высокой точностью. Временное падение плазменной концентрации кальция может возникать при массивных переливаниях препаратов крови-содержащих хелатирующие агенты в качестве антикоагулянтов. Связь свертывания крови и кальция впервые заметил Хаммарстен (Уппсала- 1875)- но долгое время его необходимость была неясна и даже оспаривалось- в том числе самим "отцом свертывания крови" Шмидтом. Она была убедительно показана Артусом (Франция- 1890). Механизм участия кальция в свертывании был выяснен только много позже в связи с прояснением устройства витамин К-зависимых белков в 1974 г.

Витамин К63 Жирорастворимый витамин- участвующий в посттрансляционной модификации факторов свертывания II- VII- IX- X- XI- а также протеинов C и S. Является кофактором фермента витамин К-зависимой карбоксилазы- который превращает остатки глутаминовой кислоты в свежесинтезированных молекулах зимогенов в остатки у-карбоксиглутаминовой. Через эти остатки факторы свертывания могут взаимодействовать с кальцием и связываться с фосфолипидами через кальциевые мостики. Всего известны три формы витамина К. Его важность в свертывании была использована при создании оральных антикоагулянтов (таких- как дикумарол и варфарин)- подавляющих синтез работоспособных факторов свертывания. Присутствует в многочисленных продуктах питания- а также синтезируется кишечными бактериями- поэтому его недостаток встречается крайне редко- например- при экзотических диетах. Был открыт Дамом (Дания- 1934)- который обнаружил- что цыплята при определенной диете страдают от кровотечения. Свое название получил от датского "витамин свертывания" — Koagulations-Vitamin. Химическая природа витамина была выявлена Дойзи (США- 1940)- который разделил с Дамом Нобелевкую премию в 1943. Механизм действия витамина К на свертывание крови был выяснен Стенфло и соавторами (США- 1974).

а Сведения об открытии компонентов приведены преимущественно по.63.

www.medprint.ru 61

М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов

ЛИТЕРАТУРА

1. Bishopric NH. Evolution of the heart from bacteria to man. Ann N Y Acad Sci 2005; 1047:13-29.

2. Iwanaga S, Kawabata S. Evolution and phy-logeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Front Biosci. 1998; 3:D973-D984.

3. Opal SM, Esmon CT. Bench-to-bedside review: functional relationships between coagulation and the innate immune response and their respective roles in the pathogenesis of sepsis. Crit Care 2003; 7(1):23-38.

4. Davidson CJ, Tuddenham EG, McVey JH. 450 million years of hemostasis. J Thromb Haemost. 2003; 1(7):1487-94.

5. Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Mathematical modeling and computer simulation in blood coagulation. Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34(2-3):60-70.

6. Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am. 2007; 21(1):1-11.

7. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). М., Мир; 1996.

8. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, et al. Realtime in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med. 2002; 8(10):1175-81.

9. Beltrami E, Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math Biosci. 2001; 172(1):1-13.

10. Lowe GD. Virchow’s triad revisited: abnormal flow. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003; 33(5-6):455-457.

11. Бутенас С, Манн КГ. Свертывание крови. Биохимия 2002; 67(1):5-15.

12. Blomback B. Fibrinogen and fibrin - proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res. 1996; 83(1):1-75.

13. Marx G, Blankenfeld A. Kinetic and mechanical parameters of pure and cryoprecipitate fibrin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4(1):73-8.

14. Lawson JH, Kalafatis M, Stram S, Mann KG. A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study. J Biol Chem. 1994; 269(37):23357-66.

15. Monroe DM, Key NS. The tissue factor-factor Vila complex: procoagulant activity, regulation, and multitasking. J Thromb Haemost. 2007; 5(6):1097-105.

16. Семенов ВВ, Ханин МА. Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика 1990; 35(1):139-41.

17. Ellis V, Scully M, MacGregor I, Kakkar V. Inhibition of human factor Xa by various plasma protease inhibitors. Biochim Biophys Acta 1982; 701(1):24-31.

18. Ellis V, Scully MF, Kakkar VV. Inhibition of prothrombinase complex by plasma proteinase inhibitors. Biochemistry 1984; 23(24):5882-7.

19. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost. 2001; 86:959-72.

20. Rosing J, Tans G, Govers-Riemslag JW, et al. The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J Biol Chem. 1980; 255(1):274-83.

21. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost. 2002; 88(2):186-93.

22. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation. J Biol Chem. 1976; 251(17):5233-6.

23. Sims PJ, Wiedmer T, Esmon CT, et al. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. J Biol Chem. 1989; 264(29):17049-57.

24. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY, et al. Platelet microparticle membranes have 5062

to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 2007; 97(3):425-34.

25. Monkovic DD, Tracy PB. Activation of human factor V by factor Xa and thrombin. Biochemistry 1990; 29(5):1118-28.

26. van Dieijen G, Tans G, Rosing J, Hemk-er HC. The role of phospholipid and factor VIIIa in the activation of bovine factor X. J Biol Chem. 1981; 256(7):3433-42.

27. Fay PJ. Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action. Blood Rev. 2004; 18(1):1-15.

28. Ingerslev J, Jankowski MA, Weston SB, Charles LA. Collaborative field study on the utility of a BDD factor VIII concentrate standard in the estimation of BDDr Factor VIII:C activity in hemophilic plasma using one-stage clotting assays. J Thromb Haemost. 2004; 2(4):623-8.

29. Gailani D, Ho D, Sun MF, Cheng Q, Walsh PN. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential. Blood 2001; 97(10):3117-22.

30. Gailani D, Broze GJ, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253(5022):909-12.

31. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35(6):1904-10.

32. Walker FJ, Fay PJ. Regulation of blood coagulation by the protein C system. FASEB J. 1992; 6(8):2561-7.

33. Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90:3819-43.

34. Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. Contact activation of blood coagulation: trigger properties and hysteresis. Kinetic recognition of foreign surfaces upon contact activation of blood coagulation: a hypothesis. J Theor Biol. 1998; 191(2):213-9.

35. Tracy PB, Nesheim ME, Mann KG. Coordinate binding of factor Va and factor Xa to the unstimulated platelet. J Biol Chem. 1981; 256(2):743-51.

36. Sahu SK, Gummadi SN, Manoj N, Aradhyam GK. Phospholipid scramblases: an overview. Arch Biochem Biophys. 2007; 462(1):103-14.

37. Nesheim ME, Furmaniak-Kazmierczak E, Henin C, Cote G. On the existence of platelet receptors for factor V(a) and factor VIII(a). Thromb Haemost. 1993; 70(1):80-6.

38. Byzova TV, Plow EF. Networking in the hemostatic system. Integrin alphaiibbeta3 binds prothrombin and influences its activation. J Biol Chem. 1997; 272(43):27183-8.

39. Dale GL. Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost. 2005; 3(10):2185-92.

40. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, et al. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. J Thromb Hae-most. 2005; 3(11):2545-53.

41. Kjalke M, Kjellev S, Rojkjaer R. Preferential localization of recombinant factor VIIa to platelets activated with a combination of thrombin and a glycoprotein VI receptor agonist. J Thromb Haemost. 2007; 5(4):774-80.

42. Chesney CM, Pifer D, Colman RW. Subcellular localization and secretion of factor V from human platelets. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78(8):5180-4.

43. Monkovic DD, Tracy PB. Functional characterization of human platelet-released factor V and its activation by factor Xa and thrombin. J Biol Chem. 1990; 265(28):17132-40.

44. Colman RW. Hemostasis and thrombosis basic principles and clinical practice. 3rd ed. Philadelphia, Lippincott; 1993.

45. Crawley JT, Zanardelli S, Chion CK, Lane DA. The central role of thrombin in hemostasis. J Thromb Haemost. 2007; 5(Suppl 1):95-101.

46. Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br J Haematol. 2005; 129(3):307-21.

47. Nesheim M. Thrombin and fibrinolysis. Chest 2003; 124(3 Suppl):33S-39S.

48. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis. Front Bio-sci. 2006; 11:59-80.

49. Ryan J, Geczy C. Coagulation and the expression of cell-mediated immunity. Immunol Cell Biol. 1987; 65( Pt 2):127-39.

50. Cirino G, Vergnolle N. Proteinase-activated receptors (PARs): crossroads between innate immunity and coagulation. Curr Opin Pharmacol. 2006; 6(4):428-34.

51. Shrivastava S, McVey JH, Dorling A. The interface between coagulation and immunity. Am J Transplant. 2007; 7(3):499-506.

52. Esmon CT. Coagulation and inflammation. J Endotoxin Res. 2003; 9(3):192-8.

53. Esmon CT. The impact of the inflammatory response on coagulation. Thromb Res. 2004; 114(5-6):321-7.

54. Brodsky SV. Coagulation, fibrinolysis and angiogenesis: new insights from knockout mice. Exp Nephrol. 2002; 10(5-6):299-306.

55. Moser M, Patterson C. Thrombin and vascular development: a sticky subject. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 23(6):922-30.

56. Mousa SA. Role of current and emerging antithrombotics in thrombosis and cancer. Drugs Today (Barc) 2006; 42(5):331-50.

57. Belting M, Ahamed J, Ruf W. Signaling of the tissue factor coagulation pathway in angiogenesis and cancer. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25(8):1545-50.

58. Rak J, Klement P, Yu J. Genetic determinants of cancer coagulopathy, angiogenesis and disease progression. Vnitr Lek. 2006; 52(Suppl 1):135-8.

59. Korte W. Changes of the coagulation and fibrinolysis system in malignancy: their possible impact on future diagnostic and therapeutic procedures. Clin Chem Lab Med. 2000; 38(8):679-92.

60. Mosesson MW. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost 2005; 3(8):1894-1904.

61. Asselta R, Duga S, Tenchini ML. The molecular basis of quantitative fibrinogen disorders. J Thromb Haemost. 2006; 4(10):2115-29.

62. Hemker HC, Al Dieri R, De Smedt E, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost. 2006; 96(5):553-61.

63. Owen CA. A History of Blood Coagulation. Rochester: Mayo Foundation, 2001.

64. Lorand L. Factor XIII and the clotting of fibrinogen: from basic research to medicine. J Thromb Haemost. 2005; 3(7):1337-48.

65. Ichinose A. Extracellular transglutaminase: factor XIII. Prog Exp Tumor Res 2005; 38:192-208.

66. Ruggeri ZM. Von Willebrand factor: looking back and looking forward. Thromb Haemost. 2007; 98(1):55-62.

67. Esmon NL, DeBault LE, Esmon CT. Proteolytic formation and properties of gamma-carbox-yglutamic acid-domainless protein C. J Biol Chem. 1983; 258:5548-53.

68. Hogan KA, Weiler H, Lord ST. Mouse models in coagulation. Thromb Haemost. 2002; 87(4):563-74.

69. Friedman Z, Hanley WB, Radde IC. Ionized calcium in exchange transfusion with THAM-buffered ACD blood. Can Med Assoc J. 1972; 107(8):742-5.

70. Fuss C, Palmaz JC, Sprague EA. Fibrinogen: structure, function, and surface interactions. J Vasc Interv Radiol. 2001; 12(6):677-82.

71. Pratt KP, Cote HC, Chung DW, Stenkamp RE, Davie EW. The primary fibrin polymerization pocket: three-dimensional structure of a 30-kDa C-terminal gamma chain fragment complexed with the peptide Gly-Pro-Arg-Pro. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94(14):7176-81.

72. Mills JD, Ariens RA, Mansfield MW, Grant PJ. Altered fibrin clot structure in the healthy relatives of patients with premature coronary artery disease. Circulation 2002; 106(15):1938-42.

Клиническая онкогематология