CC BY
21
УДК 575.17
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ПОЛИМОРФИЗМ АС, СА ПОВТОРОВ (ІвБЕ-РСИ) В ГЕНОМЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
А.В. ФЕОФИЛОВ, В.И. ГЛАЗКО
(Центр нанобиотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
Выполнен сравнительный анализ полиморфизма ДНК-фрагментов у ряда пород крупного рогатого скота и яков, выявляемых в полимеразной цепной реакции, при использовании в качестве праймеров микросателлитных повторов. Получены данные о выраженных отличиях в полиморфизме спектров продуктов амплификации в зависимости от праймера. Поиск в секвенированных пос-ледовательност х генома крупного рогатого скота позвол ет предполагать, что относительно повышенный полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами АО, обусловлен представленностью этих последовательностей в генах II класса главного комплеса гистосовместимости в отли-
чие от повторов ОА, локализованных в упаковки хроматина.
Ключевые слова: микросателлитные лилокусные спектры.
В последнее время микросателлитные последовательности ДНК широко используются для генотипирова-ния особей, исследования генофондов растений и животных, описания их изменений под влиянием факторов естественного и искусственного отборов, установления происхождения, поисков связей с фенотипическими признаками, картирования главных генов количественных признаков.
Предполагается, что уровень полиморфизма микросателлитных локу-сов хотя и выше, чем кодирующих аминокислотные последовательности структурных генов, но все же приблизительно одинакова, независимо от нуклеотидной последовательности микросателлита. Успешность решения задач общей и частной популя цион-
сайтах св зывани белков-регул торов
локусы, инвертированные повторы, по-
ной генетики сельскохозяйственных видов зависит от изученности размаха и особенностей полиморфизма молекул рно-генетических маркеров отдельных генетических элементов геномов. В то же время накапливаются данные, свидетельствующие о неслучайном распределении микроса-теллитных локусов по геномам, однако функциональное значение, генетические и эволюционные механизмы формировани их полиморфизма до сих пор остаются невыя сненными [3].
Одним из вариантов применени микросателлитных последовательностей в генетических исследовани х вл етс их использование в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР), этот тип молекулярногенетических маркеров получил на-
звание ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat — Polymerase Chain Reaction). К достоинствам этого типа маркеров относится возможность оценивать полиморфизм одновременно по ряду локусов, составля ющих спектр продуктов амплификации, полученных на геномной ДНК одной особи с использованием одного праймера. В наших исследованиях ранее было показано, что спектр продуктов амплификации (ампликонов) может существенно различаться в зависимости как от корового мотива микросателлита, фланкирующего
амплифицируемый участок ДНК, так и от якорного нуклеотида, определяющего места отжига праймеров [1]. Для выя снения причин наблюдаемых отличий нами были сопоставлены фактические результаты амплификации ДНК крупного рогатого скота, полученные с использованием в качестве праймеров в ПЦР микро-сателлитных локусов с близкими по нуклеотидным последовательност м коровыми мотивами, с результатами наших исследований их локализации в секвенированных последовательностях крупного рогатого скота, представленных в ГенБанке.
В анализ были включены 11 образцов крови животных я кутской породы крупного рогатого скота, 23 образца крови животных красной эстонской породы крупного рогатого скота и 10 образцов крови животных чернопестрой голштинизированной породы, содержащихся в виварии РГАУ -МСХА имени К.А. Тимиря зева, а также образцы крови 19 я ков. Для оценки полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локу-сов, в качестве праймеров использовали фрагменты микросателлитных локусов — (GAG)6C, (GA)9C. Геномную ДНК выдел ли из лимфоцитов периферической крови животных по стандартной методике [4]. Продукты амплификации получали по методи-
ке, разработанной Зиеткевичем и др. [4]. Раздел ли ампликоны по молекулярной массе в 1,5%-м агарозном геле методом горизонтального электрофореза, используя для окраски фрагментов ДНК раствор бромистого этиди . Визуализацию фрагментов ДНК проводили в УФ свете. Размеры фрагментов ДНК определ ли при помощи маркера молекул рных масс 100 bp+1.5 Kb+3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 bp) М27 (СибЭнзим, Росси ).
Якутский скот сохранился и содержится в чистоте в Верхоянском районе республики Саха (Якутия ). Он отличается высокой жирномолочностью, устойчивостью к экстремальным природным факторам и различным болезня м, неприхотлив к кормам. Характеризуетс небольшим ростом, бочкообразной формой туловища, короткими крепкими ногами, обросло-стью туловища и вымени. Масть разнообразна . Среднегодовой удой коров составляет 1200-1600 кг при высокой жирности молока — 4,75%. Отдельные особи могут раздаиватьс до 3000 кг молока за лактацию. Обладает уникальным долголетием. Черно-пестрые голштинизированные животные относ тс к молочному направлению продуктивности.
При использовании в ISSR-PCR в качестве праймера последовательности (GAG)6C в спектрах продуктов амплификации стабильно наблюдалось 8 продуктов амплификации (ам-пликонов) длинами около 820, 750, 650, 540, 480, 400, 320 и 280 пар нуклеотидов (п.н.). Фрагменты длинами около 820, 540 и 320 п.н. наблюдались у всех исследованных особей. Полиморфными оказались следующие фрагменты: длиной 750 п.н. — выя в-лен у всех якутских животных и у 9 из 23 коров из Псковской обл.; фрагмент 650 п.н.: присутствовал у 5 из 10 представителей черно-пестрого скота вивария, у 12 из 19 я ков и у 22 из 23 коров из Псковской обл.
и у 14 я ков. Фрагмент длиной 280 п.н. был обнаружен только у якутских коров.
По праймеру (ОЛ)9С нами были выя влены 3 ампликона длинами около 590, 510 и 260 п.н., причем полиморфизм в спектрах отсутствовал. С учетом полученных нами ранее данных об отсутствии полиморфизма по данному праймеру, а также о повышенном полиморфизме спектров ампликонов, полученных с помощью праймеров (ЛО)9С и (ОЛО)6С, принадлежащих к пурин-пиримидиновым трекам, нами была предприн та попытка вы снить возможные причины наблюдаемых отличий. Мы использовали алгоритмы семейства ББЛБТп для поиска гомологии в уже известных секвениро-ванных последовательност х генома крупного рогатого скота, опубликованные в международном банке данных ОепБапк (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/), содержащем более 100 млн записей (более 100 млн нуклеотидных пар).
Для (ЛО)9 выя влено 19 участков гомологии, в основном в комплексе генов II класса комплекса гистосовместимости, для (СТ)9 — 3, для пары (ОЛ)9 — (ТС)9 участков гомологии не выя влено. Так, большинство совпадений для последовательности (ЛО)9С обнаружены в разных, частично перекрывающихся, последователь-
ностях одной цепи генов БИВ главного комплекса гистосовместимости, в районе домена св зывани антигена бета-цепи. Локализация повтора (ЛО)9С обнаруживается в последова-тельностя х интронов генов БИВ.
По праймеру (ОЛ)9С 10 полных совпадений обнаруживаются в комплексе генов гистосовместимости, в группе генов БИВ, причем в области экзона 2 гена БИВ. По-видимому, именно экзонная локализация этого повтора может объя снять его консерватизм, несмотря на принадлежность к генам иммунной системы.
Видимо, относительно повышенный уровень полиморфизма участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами (ЛО)9С по сравнению с (ОЛ)9С, выявленный у исследованных животных, обусловлен локализацией повтора ЛО в наиболее полиморфной системе генов млекопитающих, свя занных с функцией иммунной системы — в генах главного комплекса гистосовместимости, интерлейкинов.
Главный комплекс гистосовместимости (МНС) — это группа генов, продукты которых играют важнейшую роль в иммунном ответе. Функция генов МНС класса II — обеспечение гуморального иммунного ответа путем коммитировани Т-лимфоцитов презентацией чужеродного антигена в комплексе с продуктом одного из этих генов на плазматической мембране макрофага.
Молекулы продуктов генов МНС класса II построены из тяжелой альфа- и легкой бета-цепей. Ря д фактов указывает на близкое сходство альфа- и бета-цепей по общему строению. Внеклеточная часть каждой из цепей свернута в два домена и соединена коротким пептидом с трансмембранным сегментом. Трансмембранный сегмент переходит в цитоплазматический домен, содержащий примерно 10~15 остатков аминокислот. Аллельные варианты этих белков могут отличать-с друг от друга по 20 аминокислотным остаткам. Большинство из аминокислотных замен локализовано в И-концевой части молекул и главным образом в доменах, формирующих антигенсвя зывающий участок. Именно в этой изменчивости аминокислотной последовательности антигенс-в зывающего участка заключена потенциальная возможность взаимодей-стви с широким спектром антигенов. В наших исследованиях обнаружено, что микросателлитные повторы ЛО располагаются между областя ми, ко-
диpyющими пеpвый и втopoй дoмены беладв. Пo-видимoмy, именнo лoкa-лиз=ция микpocaтеллитныx пoвтopoв AG в генax иммyннoй cиcтемы, толи-мopфизм кoтopыx нaпpaвленнo тод-деpживaетcя еcтеcтвенным oтбopoм, и мoжет oбъя cнять oтнocительнo то-вышенный пoлимopфизм ISSR-PCR-мapкеpoв, пoлyченныx пpи ^толь-зoвaнии в тачестве пpaймеpa этoгo микpocaтеллитa.
В томеднее вpемя н=6люд=єт-cя pocт чиcлa иccледoвaний беладв-yчacтникoв тpеxмеpнoй opгaнизaции генетичеcкoй инфopмaции, нaпpимеp, GAF и CTCF. Фaктop GAF (GAGA protein) я вля ется пpедcтaвителем cе-мейcтвa xpoмaтинaccoцииpoвaнныx белкoв. Былo ycтaнoвленo, чтo on игpaет cyщеcтвеннyю poль в yпaкoвке xpoмaтинa выcoкoгo пopядкa [2]. ^-cледoвaтельнocть aминoкиcлoт д=н-нoгo белта пoдpaзделяютcя н= тpи oблacти — BTB/POZ, oтветcтвеннyю з= белoк-белкoвые взaимoдейcтвия, oблacть ДHK cвязывaния и Q-кoнец, для кoтopoгo были oбнapyжены 3 paзныx функции: дефopмaция пpo-мoтopa, cвязывaние oднoцепoчечнoй ДHK и мyльтимеpизaция. Ок=зыв=-ется, чтo для зoны ДHK-cвя зыв=ния кoнcенcycнoй я вляетcя именнo пocле-дoвaтельнocть GAGAG.
Kpoме тош, GA пoвтopы явля ют-cя мишенью cвя зыв=ния белта CTCF (CCCTC cвязывaющегo фaктopa).
CCCTC cвя зыв=ющий фaктop — мнo-гoфyнкциoнaльный белoк цинкoвыx п=льцєв c paзнooбpaзными pегyля TOp-ными функция ми. ^вые дaнные ук=-зыв=ют н= yчacтие CTCF в внyтpи-, и в межxpoмocoмныx дaльниx взaимo-дейcтвияx, чтo дєл=єт CTCF в=жным фaктopoм в oпpеделении тpеxмеpнoй opгaнизaции генoмa [2]. Taк, oбнapy-жєн= нoвaя мoдель pегyля ции генoв Macca II глaвнoгo кoмплекca гиcтo-coвмеcтимocти, в кoтopoй yчacтвyют CTCF-зaвиcимые д=льниє внyтpиxpo-мocoмные взaимoдейcтвия. Haйдены дoкaзaтельcтвa н=личия дaльниx xpo-
матиновых петель между промоторами генов ИЬА-БКЫ и HLA-DQA1 и межгенным энхансером XL9. Эти вза-имодействи зависели от комплекса, состоящего из СТСЕ, фактора транскрипции ИЕХ и трансактиватора СІІТА. Нокаутирование СТСЕ путем использовани РНК-интерференции
ослабл ло дальние взаимодействи между энхансером XL9 и генами класса II МНС и снижало экспрессию HLA-DRB1 и HLA-DQA1. Эти факты позволя ют предложить новую модель экспрессии генов класса II МНС, а также позволяют выяснить некоторые особенности функции СТСЕ, его участи в таких дальних взаимо-действи х.
Таким образом, наблюдаемые отличи в полиморфизме и вы вленный нами повышенный консерватизм профилей ДНК-фрагментов, фланкированных инвертированным повтором динуклеотидного микросателлита
GA, могут быть обусловлены тем, что GA микросателлиты явля ются мишенью связывания белков, участвующих в регул ции программ генной транскрипции, в частности, путем вли ни на изменени упаковки (фол-динга) хроматина. Существуют также данные об участии подобных последовательностей в формировании нукле-осомного уровн упаковки ДНК [2].
Полученные данные свидетельствуют о том, что распределение и полиморфизм полилокусных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов с разными коровыми мотивами, отражают их участие в ф ормировании различных структурно-функциональных элементов генома. Такое выраженное разнообразие по полиморфизму, структурно-функциональной организации микросателлитных локусов необходимо учитывать при их использовании в качестве маркеров дл решения задач общей и частной генетики сельскохоз йственных видов животных.
1. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Феофилов А.В., Кол Н.В. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и трину-клеотидных микросателлитнов в геномах серого украинского скота // Известия ТСХА, 2009. Вып. 1. С. 155-162.
2. Cuddapah S., Jothi R., Schones D. E. et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains// Genome Research, 2009. Vol. 19. P. 24-32.
3. You-Chun Li, Abraham B.Korol, Tzion Fahima, Avigdor Beiles and Eviatar Nevo. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutation al mechanisms: a review // Molecular Ecology, 2002. P. 2453-2465].
4. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics, 1994. 20. P. 176-183.
SUMMARY
The comparative an alysis of polymorphism of DNA fragments in some cattle breeds and yaks revealed in polymerase chain reaction by using of microsatellite repeats as primers was carried out. The data about the expressed differences in
polymorphism of amplification product spectra in relation with primer using was obtained. Search in GenBank of cattle genome sequences allowed to assume that rather high polymorphism of DNA fragments, flanked by inverted repeats AG, was caused by localization of these sequences in Main Histocompatibility Complex genes, unlike repeat GA, localized in DNA sites of factor linkage partici pated in chromatin folding regulation.
Key words: microsatellite loci, inverted repeats, polyloci spectra.
Феофилов Антон Владимирович — асп. центра нанотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Эл. почта: afeofilov@timacad.ru
Глазко Валерий Иванович — д. с.-х. н. Эл. почта: vglazko@yahoo.com
10В
