CC BY
53
УДК 636.3:636.082.12
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ СУЮНДУКСКОГО И БИРЛИКСКОГО ВНУТРИПОРОДНЫХ ТИПОВ ЭДИЛЬБАЕВСКОЙ ПОРОДЫ ОВЕЦ
И.А. ЕЛЬСУКОВА1, А.В. ФЕОФИЛОВ2, Ю.А. ЮЛДАШБАЕВ1, В.И. ГЛАЗКО2
(1 Кафедра овцеводства и козоводства, 2 центр нанобиотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
Проанализированы спектры продуктов амплификации фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов, с использованием ди- и тринуклеотидных праймеров у представителей бир-ликского и суюндукского внутрипородных типов эдильбаевской породы овец. У животных обнаружены выраженные отличия генетических структур между внутрипородными типами, а также дифференциация по полу.
Ключевые слова: ISSR-PCR, инвертированные повторы, эдильбаевская порода овец, внутрипородные типы.
Информация по генетическому разнообразию животных существенна для разработки стратегий по оптимизации сохранения и использования генетических ресурсов животных, а также разработке методов, позволя ю-щих контролировать и корректировать динамику генетической структуры групп животных в процессе селекционной работы. В этих целях используется широкий арсенал молекулярногенетических маркеров, к которым, в частности, относятся полилокусные спектры фрагментов ДНК, получаемых в полимеразной цепной реакции (Polymerase Cycle Reaction — PCR) с использованием в качестве праймеров коротких участков микросателлитов (Inter — Simple Sequence Repeats — ISSR-PCR). Полилокусные геномные ISSR-PCR-спектры позволяют вы-полн ть сравнени генофондов разных групп организмов и надежно выявлять межгрупповые генетические дифференциации одновременно по многим геномным участкам. Одно из важных направлений их использова-ни в селекционной работе заключа-
ется в выя влении свя зей межгруппо-вых дифференциаций по таким поли-локусным спектрам и по комплексам морфофизиологических характеристик. Полилокусность ISSR-PCR-
маркеров позвол ет рассчитывать на возможность выявления комбинаций таких маркеров, тесно свя занных с особенностя ми происхождения, отбора и фенотипической дифференциацией групп животных. Использование ISSR-PCR-маркеров позволяет выявлять дифференциацию внутрипородных, межпородных и межвидовых генофондов, в частности, рода Ovis [1, 2, 4].
Ранее проведенные нами исследования овец эдильбаевской породы бирликского и суюндукского внутри-породного типа позволили вы вить дифференциацию между этими типами по комплексу морфофизиологических характеристик, таких как уровень м сной продуктивности, морфологический состав шерсти,
ультраструктура кутикул рного сло [3, 5]. В настоя щей работе выполнен сравнительный анализ генетических
структур этих двух групп овец с использованием ISSR-PCR-маркеров с целью оценки генетической дифференциации между ними по различным геномным участкам.
Материалы и методы
Исследовани выполн ли на двух группах овец эдильбаевской породы, разводимых в ОАО «Эдильбай-Волгоград», в анализ включены представители бирликского (50 гол.) и су-юндукского (50 гол.) внутрипородных типов.
В качестве маркеров полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными по-
вторами микросателлитных локусов (ISSR-PCR-маркеры), использовали стандартный метод, разработанный Зиеткевичем и др. [6]. Для проведе-ни полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) из образцов крови овец выделяли геномную ДНК, в качестве праймеров в реакционную смесь до-бавл ли фрагменты ди- и тринуклео-тидных микросателлитных локусов (AG)9C, (GA)9C, (CTC)6C, (GAG)6C. PCR проводили на амплификаторе «Терцик, ДНК Технология» (Россия) с применением набора сухих реагентов для PCR-амплификации ДНК GenePak™ PCR Core (Изоген, Москва). Дл всех образцов собирали смеси PCR-амплификации, отдельно для каждого из указанных праймеров. Условия PCR: первоначальная дена-
турация 2 мин при 95°С; денатурация при 95°С — 30 с, отжиг при 55°С — 30 с, синтез при 72°С — 2 мин (37 циклов); завершающий синтез при 72°С — 7 мин. Фракционирование продуктов амплификации проводили в 2%-м агарозном геле с применением в качестве ДНК-маркера GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas, USA) для оценки длины продуктов PCR-амплификации. Визуализацию продуктов PCR-амплификации проводили под ультрафиолетовым излучением на трансиллюминаторе после окрашивания гелей бромистым эти-дием. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью стандартных компьютерных программ «Genepop».
Результаты и их обсуждение
Выполнен сравнительный анализ генофондов двух групп овец эдель-баевской породы бирликского и су-юндукского внутрипородных типов с использованием ISSR-PCR-маркеров. В таблице 1 представлены общие характеристики полученных спектров продуктов амплификации фрагментов ДНК (ампликонов). Каждый ампликон рассматривали как отдельный локус генома, фланкированный инвертированными повторами микросателлит-ных участков, применя емых в качестве праймеров в PCR.
У исследованных групп животных в спектрах, полученных с ис-
Т а б л и ц а 1
Основные параметры спектров продуктов амплификации 18вР-РСР овец эдильбаевской породы
Праймер Количество ампликонов в спектре Границы длин локусов спектра, п.о. Количество внутрипородных полиморфных локусов
в абсолютном выражении % от общего числа ампликонов
(AG)9C 10 1200-280 7 70
(GA)9C 5 600-200 4 80
(GAG)6C 8 850-400 3 37,5
(CTC)6C 17 1700-280 17 100
пользованием в PCR динуклеотид-ных праймеров, суммарно получено меньше ампликонов, чем при применении тринуклеотидных: в спектрах (AG)9C — 10 локусов, (GA)9C — 5, (GAG)6C — 8; наибольшее количество ампликонов получено с праймером (CTC)6C — 17.
Распределение частоты встречаемости аллелей у овец бирликского и суюндукского внутрипородного типа при анализе геномов методом ISSR-PCR с использованием праймера (AG)9C представлено в таблице 2. В полученных спектрах полиморфизм по наличию / отсутствию амплико-на спектра вы влен по 6 из 10 ло-кусов (60%) у суюндукского внутрипородного типа и по 5 (50%) у овец бирликского внутрипородного типа. Ампликоны длиной 1000, 650, 500 и 430 пар оснований (п.о.) мономорфны и встречаютс у всех изученных нами животных. По полученным нами ранее данным, присутствие ампликонов размером 1000 и 650 п.о. характерно дл спектров праймера (AG)9C овец породы асканийский многоплодный каракуль и таких аборигенных, выведенных народной селекцией, пород, как сокольская, кулундинская, романовская [2, 4]. Кроме того, ампликон длиной 1000 п.о. стабильно встречает-
ся в спектре этого праймера у серой украинской породы крупного рогатого скота [1], что говорит о консервативности данного локуса.
У обоих внутрипородных типов овец эдильбаевской породы, несмотря на внутригрупповой полиморфизм, с одинаковой частотой встречаются у бир-ликских и суюндукских овец ампли-кон длиной 500 п.о. и ампликон длиной 1200 п.о. Их присутствие может рас-сматриватьс как породоспецифична характеристика в связи с тем, что ампликоны подобной длины не были описаны ни у одной из пород овец в предыдущих исследованиях.
Интересно отметить, что ампликон размером 900 п.о., выявленный нами в 22-25% случаев у животных обоих внутрипородных типов эдильбаевской породы овец, в предыдущих исследованиях был обнаружен только у снежного барана и не наблюдалс в генофондах ни у одной из описанных ранее по ІББИ-полиморфизму пород домашних овец.
По локусу размером 780 п.о. был обнаружен не только внутрипород-ный полиморфизм, но и различная частота встречаемости этого фрагмента ДНК у изучаемых внутрипородных типов эдильбаевской овцы. Различие составляет 32%, что свидетельствует
Т а б л и ц а 2
Распределение частоты встречаемости аллелей у овец эдильбаевской породы с использованием праймера (ДО)9С
Длина ампликона, п.о. Внутрипородный тип Уровень значимости Стандартная ошибка
бирликский суюндукский
+ -- + --
1200 0,300 0,700 0,311 0,689 1 0
1000 1 0 1 0 1 0
950 0,233 0,767 0,204 0,796 0,6696 0,0046
900 0,220 0,780 0,258 0,742 0,6695 0,0054
780 1 0 0,776 0,224 0,1942 0,0041
650 1 0 1 0 1 0
500 1 0 1 0 1 0
430 1 0 1 0 1 0
320 0,539 0,461 0,592 0,408 0,7762 0,0023
280 0,250 0,750 0,329 0,671 0,3874 0,0057
о дифференциации этих типов по частоте встречаемости соответствующих аллельных вариантов. Локусы длиной 950 и 280 п.о. полиморфны, но частота присутстви ампликона не зависела от принадлежности животных к разным внутрипородным типам эдильбаевской овцы, однако их присутствие статистически достоверно (Р<0,01) у обоих типов отличалось у рок и баранов. По частотам встречаемости остальных ам-пликонов дифференциации между полами вы влено не была.
Данные о распределении частоты встречаемости аллелей у овец бирлик-ского и суюндукского внутрипород-ного типа при анализе генетических структур по ІЗБИ-РСИ-спектров, полученных с использованием праймера (СЛ)9С, представлены в таблице 3.
Присутствие в спектрах продуктов амплификации этого праймера фрагмента ДНК длиной 600 п.о., стабильно встречающегос у овец эдильбаевской породы обоих внутрипородных типов, характерно не только дл изучаемой породы, но ранее было выявлено у таких пород, как асканийский многоплодный каракуль, сокольская, ку-лундинская, романовская породы, а также у дикого близкородственного вида овец — снежного барана [2, 4]. Кроме того у обоих внутрипород-ных типов овец эдильбаевской породы встречаетс ампликон длиной 480-500 п.о., который в проанализированных нами исследовани х наблю-
дался только у снежного барана [2]. По фрагменту ДНК длиной 200 п.о. полиморфизм выя влен только у овец бирликского внутрипородного типа. Этот вариант обнаруживается у всех суюндукских овец, различия в частотах встречаемости аллелей между внутрипородными типами достигает 32% и статистически достоверны (Р<0,05).
Фрагмент ДНК длиной 290 п.о. у исследованных типов эдельбаев-ской овцы полиморфен по своему наличию / отсутствию. По ранее полученным нами данным, этот фрагмент полиморфен и в генофонде романовской породы овец. Однако романовские овцы из разных хоз йств [4] практически не отличались по частотам встречаемости этого фрагмента в отличие от внутрипородных типов эдильбаевских овец (см. табл. 3). Можно ожидать, что фрагмент ДНК длиной 290 п.о. ассоциирован с морфофункциональными отличи ми этих двух внутрипородных типов.
По праймеру (САС)6С полиморфизм вы влен только по трем локу-сам из восьми, что составля ет 37,5%, однако ни по одному из них не обнаруживается достоверных отличий по частоте встречаемости аллелей между внутрипородными типами.
В спектре продуктов амплификации при применении праймера
(СТС)6С выявлено 17 фрагментов ДНК. Все 17 фрагментов ДНК, фланкиро-
Т а б л и ц а 3
Распределение частоты встречаемости аллелей у овец эдильбаевской породы с использованием праймера (ОД)9С
Длина ампликона, п.о. Внутрипородный тип Уровень значимости Стандартная ошибка
бирликский суюндукский
+ -- + --
600 1 0 1 0 1 0
500 0,454 0,546 0,437 0,563 0,8218 0,0034
400 0,134 0,866 0,082 0,918 0,4207 0,0068
290 0,315 0,685 0,452 0,548 0,1374 0,0049
200 0,681 0,319 1 0 0,0503 0,0017
ванных инвертированным повтором этого микросателлита, оказались полиморфными у эдильбаевской породы, но ни по одному из них не наблю-даетс зависимость частоты встречаемости аллеля от принадлежности животных к определенному внитрипородному типу. В присутствии фрагментов ДНК длиной 740 и 680 п.о. с достоверностью Р<0,05 и
0,001 соответственно обнаруживали отличи по частотам встречаемости у разных полов и чаще всего наблюдались в геномах рок.
Данные о среднем уровне гетеро-зиготности и генетических рассто -ниях, рассчитанные по N61, 1978 для бирликского и суюндукского внутри-породных типов, представлены в таблице 4.
Т а б л и ц а 4
Данные о среднем уровне гетерозиготности и генетических расстояниях для изучаемых внутрипородных типов эдильбаевской породы овец
Праймер Средний уровень гетерозиготности по внутрипородному типу Генетическое расстояние между внутрипородными типами
бирликский суюндукский
(А0)9О 0,200 0,285 0,0173
(0А)9О 0,435 0,228 0,0056
(0А0)6О 0,168 0,158 0,0009
(ОТО)6О 0,384 0,385 0,0047
Средний уровень гетерозиготности изучаемых внутрипородных типов по спектрам праймеров (СТС)6С и (СЛС)6С практически одинаков. Спектр ампликонов праймера (СТС)6С, несмо-тр на высокий уровень полиморфизма всех выя вленных фрагментов ДНК, не отличалс по распределению частот между внутрипородными типами. По двум другим праймерам наблюдаетс преобладание частот встречаемости ампликонов одного внутрипородного типа над другим: в спектре (ЛС)9С — суюндукского, в спектре (СЛ)9С — бирликского. По частотам встречаемости продуктов амплификации, полученных с праймерами (ЛС)9С и (СЛС)6С, животные бирликского внутрипородного типа более выравнены. Можно ожидать, что более выраженная консолидированность этого типа по данным маркерам обусловлена тем, что бирликский генофонд представл ет меньшую часть биораз-нообрази эдильбаевской породы по сравнению с суюндукским типом, который остаетс более широким пред-
ставителем генофонда эдильбаевской породы. Средняя гетерозиготность спектра ампликонов, полученного с праймером (СА)9С у овец бирликского внутрипородного типа, больше, чем у суюндукских.
Можно ожидать, что выявленные нами фрагменты ДНК, по частотам встречаемости которых обнаруживается дифференциация между двумя внутрипородными типами эдильба-евской овцы, в наибольшей степени подвергались селекционному давлению в процессе селекционной работы по их совершенствованию.
Заключение
Бирликский и суюндукский внутри-породные типы овец эдильбаевской породы отличаются не только по уровню шерстной и мя сной продуктивности, но и по спектрам продуктов амплификации 18БК-РСК, в частности, частотой встречаемости фрагментов ДНК длиной 780 п.о. в спектре продуктов амплификации 18БК-РСК, полученному с праймером (АС)9С, и фрагментам длиной
200 и 290 п.о. в спектрах праймера (GA)9C. Oбнapyжены статистически достоверные половые отличи по частотам встречаемости отдельных фрагментов ДHK в ISSR-PCR-спектрах, полученных с праймерами (AG)9C и (CTC)6C.
Уникальные особенности эдильбаев-ской породы овец подтверждаются вы-
раженными генофондными отличиями по ISSR-PCR-маркерам между эдиль-баевской овцой и группой ранее исследованных пород овец по присутствию фрагментов ДHK, типичных для снежного барана, длиной 900 п.о. в спектре праймера (AG)9C и длиной 480-500 п.о. в спектре праймера (GA)9C.
Библиографический список
1. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Феофилов А.В., Кол Н.В. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого украинского скота // Известия ТСХА, 2009. № 1. С. 155-162.
2. Дымань Т.Н., Городная А.В., Тарасюк С.И., Сипко Т.П., Кушнир А.В., Глазко В.И. Участие маркеров структурных генов и анонимных последовательностей ДНК в генетической дифференциации у видов рода Ovis aries hivicola borealis // Цитология и генетика, 2000. № 6. С. 49-59.
3. Ельсукова И.А., Юлдашбаев Ю.А., Сычева И.Н. Сравнительная характеристика мясной продуктивности баранчиков бирликского и суюндукского внутри-породных типов эдильбаевской породы овец // Овцы, козы, шерстное дело, 2010. № 4. С. 44-51.
4. Столповский Ю.А., Кол Н.В., Лапшин А.В., Сулимова Г.Е., Глазко В.И. Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у овец романовской породы // Известия ТСХА, 2008. № 2. С. 48-54.
5. Юлдашбаев Ю.А., Магомадов Т.А., Двалишвили В.Г., Гишларкаев Е.И., Ельсукова И.А. Продуктивность эдильбаевских овец в условиях Нижнего Поволжья // Доклады ТСХА, 2010. Вып. 282. С. 919-922.
6. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics, 1994. 20. P. 176-183.
Рецензент — д. б. н. А.Г. Маннапов
SUMMARY
In this article amplification products’ spectra of DNA fragments flanked by inverted microsatellite repeats by using of di- and trinucleotide primers were analysed. Data was obtained for birlik and suinduk intrabreed types of edilbay sheep. We found differences between genetic structures of two intrabreed types and also sex differences were revealed.
Key words: ISSR-PCR, inverted repeats, edilbay sheep, intrabreed types.
Ельсукова Ирина Александровна — аспирант кафедры овцеводства и козоводства РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Эл. почта: irina-6ls@rambler.ru.
Феофилов Антон Владимирович — аспирант центра нанобиотехнологий РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева. Эл. почта: foton87@yahoo.com.
Юлдашбаев Юсуп Артыкович — д. с.-х. н. Эл. почта: zoo@timacad.ru.
Глазко Валерий Иванович — д. с.-х. н. Эл. почта: vglazko@yahoo.com.
