CC BY
103
УДК575.174.015.3: 575.17: 636.082.12
ОЦЕНКА ГЕНОФОНДА КАЛМЫЦКОЙ ПОРОДЫ ОВЕЦ, В СРАВНЕНИИ С ЭДИЛЬБАЕВСКОЙ, С ПРИМЕНЕНИЕМ ISSR-PCR МАРКЕРОВ*
A.В. ФЕОФИЛОВ, зам. зав. Центром нанобиотехнологий
Ю.А. ЮЛДАШБАЕВ, доктор сельскохозяйственных наук, декан
B.И. ГЛАЗКО, доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН (иностранный член)
зав. Центром нанобиотехнологий РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева
E-mail: foton87@yahoo.com
Резюме. Для поиска генетических резервов для селекционной работы с сельскохозяйственными животными необходим соответствующий анализ доступных пород, в том числе аборигенных. Ксожалению, большое количество пород, с которыми работают в России, на сегодняшний день не изучены не только по SNP, но и в ряде случаев по более доступным молекулярно-генетическим маркерам. Это затрудняет переход к современной организации селекционных процессов с активным применением биомаркеров. В работе представлены результаты исследований генетических особенностей новой калмыцкой породы овец (n=60) с использованием ISSR-PCR маркеров. Все локусы в спектрах, получаемых с праймером (AG)9C, были полиморфными, ампликоны прочих спектров также имели высокий полиморфизм. Для сравнения использовали данные о полиморфизме ISSR-PCR маркеров у эдильбаевской породы овец (n=93). Из 29 обнаруженных ло-кусов в спектрах всех праймеров 22 были общими, 5 локусов встречались только у калмыцкой породы, и лишь 2 только у эдильбаевской породы овец. Генетическое расстояние между указанными породами, рассчитанное по методу Неи, оказалось равно 0,2028. Средний уровень гетерозиготности у калмыцкой породы (0,2955) оказался выше, чем у эдильбаевской (0,1753). При этом спектры, получаемые с использованием праймера (GAG)6C, показали наименьшую величину этого параметра. В целом, обнаруженные свойства спектров ISSR-PCR маркеров, получаемыху калмыцкой породы овец, позволяют рекомендовать ее к использованию в дальнейшей селекционной работе ввиду большего числа наблюдаемых локусов в спектрах и несколько повышенного уровня гетерозиготности.
Ключевые слова: ДНК маркеры; инвертированные повторы; ISSR-PCR; калмыцкая порода, эдильбаевская порода, овцы.
Сегодня молекулярно-генетические методы находят широкое применение в животноводстве при паспортизации, установлении родственных связей, обнаружении наследственных генетических заболеваний, в селекционных программах и др. [1, 2]. Для лучшего контроля генофондов пород и оптимизации их разведения необходим подбор молекулярно-генетических маркеров, оценка полиморфизма которых позволяет одновременно генотипировать несколько десятков локусов, выполняя, таким образом, «геномное сканирование» [3]. Сравнение распределения аллельных вариантов в генофондах различных пород по множеству локусов дает возможность выявлять внутрипородный и межпородный полиморфизм, а также молекулярно-генетические маркеры, вовлеченные в межпородную генетическую дифференциацию. Для «геномного сканирования» сегодня используется много подходов, в частности, ДНК-биочипы для выявления моно-нуклеотидных замен (БЫР). Однако эта процедура остается достаточно сложной. Накоплено большое количество данных и созданы геномные базы БЫР для ряда видов,
но до сих пор не удается на их основании разработать простые, малозатратные тест-системы для получения надежных данных о породной принадлежности животных, геномных участках, ассоциированных с формированием хозяйственно ценных признаков [4, 5].
Один из наиболее простых, дешевых и удобных методов геномного полилокусного сканирования - оценка полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, получаемых в результате полимеразной цепной реакции с использованием в качестве одного праймера участка микросателлита ОББИ-РСЯ маркеры) [6]. Многочисленные исследования, выполненные различными научными группами по всему миру, показывают высокую информативность применения этого типа маркеров при анализе [7...10]. Одно из важных направлений их использования в селекционной работе заключается в выявлении связей межгрупповых дифференциаций по таким полилокусным спектрам и по комплексам морфофизиологических характеристик. Полилокусность !ББР-РСЯ-маркеров позволяет рассчитывать на выявление их комбинаций, тесно связанных с особенностями происхождения, отбора и фенотипической дифференциацией групп животных. Использование 1ББЯ-РСЯ-маркеров дает возможность определять дифференциацию внутрипородных, межпородных и межвидовых генофондов, в частности, рода Ovis. Однако для этого требуется надежная информация о свойствах и характеристиках используемых молекулярно-генетических маркеров в исследуемых группах животных.
Калмыцкая порода овец малоизучена в этом отношении, поэтому поиск, анализ и сопоставление спектров !ББЯ-маркеров - важная задача. Калмыцкая курдючная овца относится к мясо-сальному типу и появилась на территории Калмыкии в XV!! столетии из Монголии и Западного Китая при переселении калмыков. При этом часть животных смешалась с местными курдючными овцами, образовав ряд отродий, из которых наиболее ценно эдильбаевское в Западном Казахстане.
Таблица 1. Основные параметры спектров продуктов ISSR-PCR
Прай- мер Число локусов в спектре Границы длин локусов спектра, п.о. Доля полиморфных локусов в породе, %
калмыц- эдильбаев-кая ская
(AG)9C 11 1200...280 100 54,55 (GA)9C 9 600...200 77,78 44,44 (GAG)6C 9 870...400 66,67 33,33
Калмыцких курдючных овец можно почти круглый год содержать на пастбище. Обладая крепкими ногами, они способны совершать переходы, поедая разнообразную, как полынную, так и полупустынную растительность. Животные этой породы хорошо пасутся и в жаркую погоду, лучше переносят пастьбу по ковыльным степям, чем мериносы. Зона разведения калмыцкой курдючной овцы, кроме Калмыкии, - юго-восток Ростовской области,
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12-000-1016-
008. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Таблица 2. Частоты встречаемости ампликонов у калмыцкой и эдильбаевской пород овец с использованием праймера (ОД)дО
Длина ампли- кона, п.о. По рода Уро- вень значи- мости Стан- дарт- ная ошибка
эдильбаев- ская калмыцкая
+ 1 — + —
600 10 1 0 1 0
500 0,4226 0,5774 1 0 0 0
450 01 0,3545 0,6455 0 0
400 0,0840 0,9160 0,3128 0,6872 0 0
370 01 0,3849 0,6151 0 0
350 01 0,4548 0,5452 0 0
290 0,3502 0,6498 0,3545 0,6455 1 0
230 01 0,1946 0,8054 0 0
200 0,6855 0,3145 0,2834 0,7166 0 0
северо-восток Ставрополья, Астраханская и Волгоградская области.
Для разработки генетически обоснованных программ по сохранению и оптимизации использования генетических ресурсов местных пород, которые, как правило, характеризуются высокой адаптированностью к локальным условиям разведения, необходимо выявление комплекса молекулярно-генетических маркеров «генофондного стандарта» пород, надежно различающих их между собой. В связи с изложенным, цель нашей работы - исследование генофонда калмыцкой породы овец с помощью ^БЯ-РСП маркеров, которое включало расчет и оценку частот встречаемости локусов спектров с последующим сопоставлением с имеющейся информацией по полиморфизму ^БЯ-РСЯ маркеров у эдильбаевской породы.
Условия, материалы и методы. Изучено 60 гол. (35 маток, 25 баранов) калмыцкой и 93 гол. эдильбаевской (45 маток, 48 баранов) породы овец, разводимых в Волгоградской обл. Для оценки генофонда применяли метод 1ББР-РСЯ, который позволяет получать полилокусные полиморфные спектры удобные при дифференциации животных как на породы внутри вида, так и при выявлении полиморфизма спектров внутри пород. Каждый ампликон рассматривали как отдельный локус.
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови животных по стандартной методике [11] с использованием набора для выделения ДНК из цельной крови «ДНК-Экстран». В качестве праймеров использовали ди- и тринуклеотидные коровые мотивы микросателлитов с якорными нуклеотидами [11]: (ДО)9С, (СД)9С и (САО)6С. Продукты амплификации получали по методике [6] с использованием набора ПЦР-РВ в соответствии с рекомендациями производителя. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» со следующими параметрами: первичная денатурация (1 =
94°С, 2 мин.); денатурация (1 =
94°С, 30 сек.), отжиг (1 = 55°С,
30 сек.), элонгация (1 = 72°С, 2 мин.) - 30 циклов; финальная элонгация (1=72°С, 10 мин.).
Продукты амплификации разделяли в 1,5 %-ном агарозном
геле методом горизонтального электрофореза, используя для окраски фрагментов ДНК раствор бромистого этидия. Визуализацию фрагментов ДНК проводили в УФ свете. Размеры фрагментов ДНК определяли при помощи маркера молекулярных масс 100 bp+1.5 Kb+3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 пар оснований) M27.
Математическую обработку осуществляли с использованием компьютерной программы TFPGA [12]. Расчет индекса PIC (Polymorphic Information Content) выполняли по формуле для диаллельных локусов: PIC=2f(1-f), где f - частота одного из двух аллелей. Поскольку маркеры ISSR-PCR имеют доминантный характер проявления в продуктах амплификации, f рассчитывали по формуле VR, где R - частота встречаемости животных, у которых в спектрах продуктов амплификации отсутствовал фрагмент ДНК данной длины. Значение R рассматривали как долю гомозигот по рецессивному аллелю.
Результаты и обсуждение. Наибольшее количество локусов у овец калмыцкой породы получено при использовании праймера (AG)9C, в этом же спектре ампликонов наблюдается самая высокая доля полиморфных локусов. Вне зависимости от корового мотива праймера в породе отмечено значительное количество полиморфных локусов при примерно одинаковом их общем числе (табл. 1). Наибольшее интервалы длин ампликонов были характерны для
При использовании праймера (GA)9C выявлен моно-морфный локус размером 600 п.о. (табл. 2). Это консервативный участок, по данным предыдущих исследований он стабильно встречается у овец эдильбаевской и многих других пород домашней овцы, а также у дикого близкородственного вида - снежного барана [13]. Кроме того, у овец калмыцкой породы выявлены полиморфные локусы, длиной 450, 370, 350 и 230 п.о., которые отсутствуют у животных эдильбаевской породы, то есть эти участки генома, вероятно, унаследованы от монгольской породы. По частоте встречаемости большинства полиморфных локусов, установленных при амплификации с использованием
праймера (ОД)9С, между породами выявлены значимые Таблица 4.Частоты встречаемости ампликонов у калмыцкой и эдильбаевской пород овец с использованием праймера (ОДО)6О
Длинаам-пликона, п.о. Порода Уровень значимости Стандартная ошибка
эдильбаевская калмыцкая
+ — + —
870 0 1 0,1340 0,8660 0,0000 0,0000
850 1 0 1 0 1 0
730 1 0 0,2417 0,7583 0,0000 0,0000
690 0,3008 0,6992 0,0917 0,9083 0,0003 0,0002
660 1 0 0 1 0,0000 0,0000
610 0,3675 0,6325 0,1340 0,8660 0,0003 0,0002
580 0,2968 0,7032 0,2094 0,7906 0,1705 0,0112
500 1 0 1 0 1 0
400 1 0 0,3876 0,6124 0,0000 0,0000
праймера (ДО)9С, а наименьшие - для праймера (СД)9С. Таблица 3. Частоты встречаемости ампликонов у калмыцкой и эдильба-
евской пород овец с использованием праймера (AG)9C
Длина ампли-кона, п.о. Порода Уровень значимости Стандартная ошибка
эдильбаевская калмыцкая
+ — + —
1200 0,3046 0,6954 0,0917 0,9083 0,0001 0,0001
1000 1 0 0,3292 0,6708 0,0000 0,0000
950 0,2198 0,7802 0,1229 0,8771 0,1060 0,0073
900 0,2368 0,7632 0,1340 0,8660 0,0768 0,0053
780 0,7656 0,2344 0,1633 0,8367 0,0000 0,0000
650 1 0 0,6127 0,3873 0,0011 0,0006
500 1 0 0,6127 0,3873 0,0008 0,0004
430 1 0 0,5528 0,4472 0,0000 0,0000
370 0 1 0,1377 0,8623 0,0000 0,0000
320 0,5609 0,4391 0,3292 0,6708 0,0046 0,0012
280 0,2849 0,7151 0,1056 0,8944 0,0020 0,0007
различия. Исключение составляет локус длиной 290 п.о., частота встречаемости которого у овец калмыцкой и эдильбаевской пород не отличается.
При использовании праймера (ДО)9С получены высокополиморфные спектры ампликонов (табл. 3). У овец калмыцкой породы отмечен локус длиной 370 п.о., отсутствующий в эдильбаевской породе. У животных калмыцкой породы полиморфизм по отсутствию-наличию наблюдается по значительно большему (на 5 локусов, или 54,55 %) числу локусов. Это, на наш взгляд, свидетельствует о повышенном генетическом разнообразии, и, как следствие, о большем генетическом потенциале породы.
В спектрах ампликонов, полученных при использовании праймера с тринуклеотидным мотивом (ОДО)6С, отмечено два консервативных локуса длиной 850 и 500 п.о. (табл. 4). По локусам 730, 690, 610 и 400 п.о. установлены существенно меньшая частота встречаемости у овец калмыцкой породы, в сравнении с эдильбаевской, что свидетельствует о большой разнице в действии отбора на эти участки генома. Частота встречаемости локуса длиной 580 п.о. у обеих пород овец отличается незначительно (0,297 и 0,209). Локус длиной 660 п.о., мономорфно встречающийся у овец эдильбаевской породы, не обнаружен у животных калмыцкой породы, что может служить маркером при их разделении.
Средний уровень гетерозиготности по изученному поголовью овец калмыцкой породы составил 0,2955, по овцам эдильбаевской породы - 0,1753. Генетическое расстояние, рассчитанное по методу Ые1 [14], между
овцами новой калмыцкой и эдильбаевской породы, использованной в качестве материнской основы, довольно велико - 0,2028 (табл. 5).
Таблица 5. Средний уровень гетерозиготности и генетические расстояния между породами по данным !88Я-анализа
Праймер Средний уровень гетерозиготности Генетическое расстояние
калмыцкая эдильбаевская
(AG)9C 0,3352 0,2182 0,2023 (GA)9C 0,3418 0,204 0,1664 (GAG)6C 0,1826 0,131 0,2813 В среднем 0,2955 0,1753 0,2028
Выводы. Таким образом, в большинстве случаев, частота встречаемости локусов, свойственных эдильбаевской породе овец, у калмыцких оказывается меньше. В тоже время, отмечены пять новых локусов в спектрах амплификации праймеров (ДО)9С и (ОД)9С. Только 3 из 29 локусов у калмыцкой породы оказались не полиморфными, а 22 локуса были общими.
Результаты наших исследований означают, что калмыцкая порода сложилась как отдельная, хорошо идентифицируемая группа животных. Несколько повышенный уровень гетерозиготности свидетельствует о том, что она консолидирована в небольшой степени. В связи с этим по проанализированным 1ББЯ-маркерам можно сказать, что генофонд калмыцкой породы несколько богаче и разнообразнее, по сравнению с эдильбаевской, что позволяет рекомендовать ее для использования в селекционной работе.
Литература.
1. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - с. 19-20.
2. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., Костюнина О.В., Быкова А.С., Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных // Зоотехния. -2009. - № 8. - с. 26-27.
3. Nosil, P., Funk, D. J., Ortiz-Barrientos, D. Divergent selection and heterogeneous genomic divergence//Molecular Ecology. -
2009. - Vol. 18. - P. 375-402.
4. Глазко В.И. Геномная селекция крупного рогатого скота: исследовательские и прикладные задачи// Известия ТСХА. -2011. - №5. - С. 126-135.
5. Глазко В.И., Глазко Т.Т. Современные направления «устойчивой» интенсификации сельского хозяйства // Известия ТСХА. - 2010. - №4. - С. 101-114.
6. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. - 1994. - Vol. 20. - P.176-183.
7. Денискова Т.Е., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И. Моделирование системы мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 55-56.
8. Столповский Ю.А., Лазебный О.Е., Столповский К.Ю., Сулимова Г.Е. Применение метода ISSR-PCR для оценки популяционной структуры, идентификации и сходства генофондов пород и видов доместицированных животных// Генетика. -
2010. - Т. 46. - № 6. - С.825-833.
9. Gui F.R., Guo J.Y., Wan F.H. Application of ISSR molecular marker in invasive plant species study// Ying Yong Sheng Tai Xue Bao. - 2007 - Apr. 18(4). - P. 919-927.
10. Soliani C., Rondan-Duenas J., Chiappero M.B., Martinez M. et al. Genetic relationships among populations of Aedes aegypti from Uruguay and northeastern Argentina inferred from ISSR-PCR data // Med Vet Entomol. - 2010. - Sep.24(3). - P. 316-323.
11. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии. - М.: Воскресенье, 2006. - 480 с.
12. Miller M. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. - 1997.
13. Ельсукова И.А., ФеофиловА.В., Глазко В.И., Юлдашбаев Ю.А. Генетическая дифференциациясуюндукского и бирлик-ского внутрипородных типов эдильбаевской породы овец//Известия ТСХА. - 2010. - № 6. - С. 84-89.
14. Nei M. Genetic distance between populations//American Naturalist. - 1972. - Vol. 106. - No. 949. - P. 283-292.
ESTIMATION OF KALMYK SHEEP BREED GENE POOL COMPARED TO EDILBAY BREED
BY MEANS OF ISSR-PCR MARKERS A.V. Pheophilov, J.A. Juldashbaev, V.I. Glazko
Summary. Search of genetic reserves for breeding requires analyses of available breeds including local ones. Unfortunately, a lot of breeds used in Russia are investigated neither by using SNP markers nor by even more accessible molecular markers. It complicates the shift of Russian breeding to modern workflow with wide application of various biomarkers. In this paper survey of genetic properties of new Kalmyk sheep breed (n=60) was carried out by using ISSR-PCR markers for the first time. All loci of (AG)9C spectra were polymorphic, amplicons of other primers also had high polymorphism. We used data about ISSR-PCR markers’ polymorphism for Edilbay sheep breed (n=93) for comparison. Among total 29 observed loci 22 were common, 5 loci were found only in Kalmyk breed and 2 were found only in Edilbay breed. Based on amplicon frequency we counted genetic distance between these two breeds according to M. Nei (1972) and it was 0.2028. Relatively high average level of heterozygosity was found in Kalmyk breed (0.2955) according to Edilbay breed (0.1753). Spectra of primer (GAG)6C had the lowest values of this parameter. In conclusion, properties of spectra of ISSR-PCR markers found in Kalmyk sheep breed allows recommendation to use this breed in breeding because of higher loci number in spectra and higher level of heterozygosity. Keywords: DNA markers, inverted repeats, ISSR-PCR, Kalmyk breed, Edilbay breed, sheep.
