CC BY
61
УДК 619:616.995.132.6:636:612.017
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ И ЭКСКРЕТОРНОСЕКРЕТОРНЫХ АНТИГЕНОВ TRICHINELLA SPP. ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ ЛАБОРАТОРНЫХ
ЖИВОТНЫХ
А.В. КЛИНКОВ аспирант И.М. ОДОЕВСКАЯ кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И. Скрябина,
11218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, e-mail: vigis@ncport.ru
Исследованы уровни протективного эффекта при иммунизации мышей биологическими препаратами на основе рекомбинантного антигена Tspl молекулярной массой 37,7 кДа и экскреторно-секреторных антигенов молекулярной массой 29-63 кДа в чистом виде и в комплексе с адъювантной композицией. Самый высокий уровень протективной защиты (91,8 %) показал препарат, состоящий из экскреторно-секреторных антигенов трихинелл и адъювантной композиции.
Ключевые слова: Trichinella spiralis, протективный эффект, рекомбинантные и экскреторно-секреторные антигены, трихинеллез, мыши.
Трихинеллез относится к антропозоонозам, т. е. к болезням, общим для человека и животных и распространен практически повсеместно. Среди паразитов трихинеллы занимают одно из первых мест по патогенности для человека, обладают иммуносупрессивным действием и вызывают серьезные иммунопатологические реакции. В настоящее время вакцинация - наиболее приемлемое средство борьбы с паразитарными болезнями домашних и сельскохозяйственных животных. Некоторые зарубежные авторы предлагали использовать в качестве вакцины замороженных, ослабленных радиацией или автоклавированием новорожденных или мышечных личинок трихинелл, а также их соматические экстракты [5-8, 10, 12, 16].
Однако сведения об успешном прохождении клинических испытаний вышеуказанными препаратами в ветеринарной практике отсутствуют, что, по-видимому, связано с трудностями получения достаточного количества биомассы гельминтов, в связи с чем вакцинация против трихинеллеза продуктивных животных не получила распространения.
Тем не менее, во многих странах мира проводятся исследования по разработке эффективных биотехнологических способов получения вакцинных препаратов для профилактики трихинеллеза.
В настоящее время перспективными направлениями с точки зрения технологии производства вакцины является получение препаратов для иммунизации животных рекомбинантными антигенами, ДНК-вакцинами, препаратами на основе экскреторно-секреторных продуктов и антигенов от моноклональных антител [7-9, 16]. Использование в производстве биологических препаратов только антигенов трихинелл не позволяет достичь достаточного уровня протективной защиты при иммунизации. Оптимизировать иммуноло-
81
гические механизмы при вакцинации животных паразитарными антигенами возможно подбором соответствующих адъювантов. В качестве последних применяют различные соединения, которые действуют неспецифическим образом, усиливая иммунный ответ на специфический антиген. Такие вакцинирующие комплексы позволяют вызывать наиболее ранние, выраженные и продолжительные иммунологические реакции, обеспечивающие высокий уровень защиты организма животного от инвазии тканевыми гельминтами.
Известно, что компоненты клеточных стенок некоторых микроорганизмов и их нуклеиновые кислоты обладают иммуноадъювантными свойствами, т. е. воспринимаются иммунной системой как неспецифический сигнал, усиливающий иммунный ответ. Наиболее известен полный адъювант Фрейнда (ПАФ), применяемый только для иммунизации лабораторных животных. Он представляет собой масляную суспензию убитых клеток Mycobacterium tuberculosis с липофильным эмульсионным агентом (10 % Арлацела А); перед введением животному этот препарат эмульгируют в водном растворе антигена. Воздействие адъюванта на иммунный ответ в основном обусловлено способностью удерживать антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитами (эффект «депо»), и способностью убитых микобактерий вызывать синтез ци-токинов, регулирующих лимфоцитарные функции. Показано, что цитокины действуют как эффективные адъюванты только в случае непосредственного связывания со специфическим антигеном. Однако существенным недостатком ПАФ является высокая вязкость препарата, его сильная реактогенность, выражающаяся в образовании абсцессов и обширных гранулем на месте введения, в связи с чем этот адъювант в практической ветеринарии не используют [4, 11, 13-15].
В настоящее время среди средств иммунокоррекции из числа природных препаратов ведущее место по широте спектра биологической активности занимают препараты нуклеиновых кислот и продукты их ферментативной деградации. Типичный представитель этой группы - натриевая соль РНК, выделяемая из простейших эукариотических организмов Saccharomycis cerevi-siae. Активным биологическим компонентом данной субстанции служат нуклеотиды. Являясь естественным компонентом организма животных, натриевая соль дрожжевой РНК не обладает видовой специфичностью, имеет широкий спектр биологической активности и лишена побочного действия. Клинические испытания показали, что этот препарат ускоряет процессы регенерации, стимулирует факторы естественной резистентности, миграцию и кооперацию Т- и В- лимфоцитов, фагоцитарную активность нейтрофилов. РНК стимулирует факторы как врожденного, так и приобретенного иммунитета, активируя пролиферацию Т- и В-лимфоцитов. Главное фармакологическое свойство нуклеиновых кислот - стимуляция лейкопоэза, процессов регенерации и репарации, функциональной активности практически всех клеток иммунной системы. Препараты этой группы стимулируют функциональную активность нейтрофилов и макрофагов, повышая их способность элиминировать чужеродные элементы (например, бактерий и паразитов), усиливают устойчивость к заражению различными патогенами, вероятно, за счет стимуляции фагоцитоза, повышения функциональной активности Т-хелперов и Т-киллеров, про-лнферацин В-клеток и синтеза антител. Установлены иммуномодулирующие свойства РНК в связи с выраженной индукцией интерферона (ИФу). Известно, что под действием интерферона повышается способность макрофагов производить высокоактивные метаболиты кислорода и оксид азота [3].
Являясь важнейшей сигнальной молекулой и внутриклеточным медиатором, оксид азота путем простой диффузии моментально переходит в соседние и удаленные клетки, осуществляя межклеточную регуляцию практически во всех тканях организма.
Показано, что эндогенный синтез оксида азота макрофагами, нейтрофи-лами и сосудистым эндотелием является одним из механизмов защиты организма хозяина от тканевых гельминтов за счет повышения цитотоксических и
82
цитостатических свойств клеточного звена иммунитета. Собственно оксид азота (NO) выполняет в макроорганизме многочисленные медиаторные и сигнальные функции, а токсическим действием на гельминтов и простейших обладают пероксинитриты, образующиеся в результате взаимодействия NO с продуктами восстановления кислорода в очагах воспаления и стимуляции фагоцитарной активности макрофагов. Для стимуляции функциональной активности макрофагов, нейтрофилов, клеток сосудистого эндотелия при синтезе оксида азота необходимо присутствие достаточного количества в организме животного аминокислоты L-аргинина.
Исходя из вышеизложенного, для приготовления биологических препаратов протективного действия нами была использована адъювантная композиция, содержащая РНК и L-аргинин [3].
Целью проводимого испытания - сравнение протективных свойств рекомбинантного Tsp1 и экскреторно-секреторных антигенов трихинелл как в чистом виде, так и в смеси с адъювантной композицией.
Материалы и методы
Животные. Мыши линии CBA - 50 гол. массой тела 18-20 г, белые беспородные крысы - 30 гол.
Материалы. Инвазионные личинки Tricinella spiralis, рекомбинантный антиген Tspl молекулярной массой 37,7 кДа, экскреторно-секреторный антиген массой 29-63 кДа, адъювантная композиция для инъекционных вакцин против тканевых гельминтов [3].
П олучение инвазионных личинок трихинелл. Для наработки биомассы трихинелл использовали два штамма T. spiralis, полученные от естественно инвазированных свиней (из Белоруссии и Северной Осетии) и пассированных на лабораторных животных (белые беспородные крысы, мыши, кролики) на базе вивария ВИГИС.
Белых беспородных крыс заражали per os личинками T. spiralis в дозе 10 л/г живой массы. Через 1,5-2 мес животных убивали методом цервикальной дислокации, снимали шкуру, удаляли внутренние органы и тушки переваривали в искусственном желудочном соке. Переваривание мышечных тканей для высвобождения личинок трихинелл проводили при 38,5-39,0 °С, поскольку это нормальная температура тела плотоядных животных - основных хозяев данного гельминта. Полученных личинок трихинелл многократно отмывали стерильным физиологическим раствором с добавлением антибиотиков, состав которых определяли таким образом, чтобы на сопутствующие микроорганизмы и плесневые грибы воздействовало сразу несколько угнетающих агентов: Р-лактамные антибиотики оказывали бактерицидное действие на микроорганизмы, находящиеся в фазе роста, ингибируя биосинтез их клеточной стенки; тетрациклинового ряда - подавляли биосинтез белка на уровне рибосом; плесневые грибы, аспергиллы, грибы рода Candida элиминировала дисперсия леворина. В связи с этим в отмывающий физиологический раствор добавляли 5 мкг/мл ампициллина, 6 мкг/мл гентамицина, 50 ЕД/мл леворина, 2 мкг/мл доксициклина и промывали им 5-7 раз инвазионные личинки трихинелл.
П олуче ние экскре тор но -се кр е тор ного антиге на трихин е л л . Личинок трихинелл помещали в чашки Петри с питательной средой ДМЕМ с добавлением L-глутамина (40 мкл/мл) и антибиотиков (гентамицина
2 мкл/мл и ампициллина 5 мкл/мл). Плотность посева 5-10 тыс. л/мл, температура инкубации - 38,5 оС. Белковые продукты отбирали один раз в сутки в течение 3-5-суток, после каждого отбора экскреторно-секреторных продуктов первоначальный объем восполняли добавлением новой порции питательной среды с L-глутамином. Жизнеспособность личинок трихинелл ежедневно оценивали под микроскопом, при обнаружении более 30 % мертвых культивирование прекращали.
Полученные экскреторно-секреторные продукты по разным срокам культивирования подвергали диализу в течение 48 ч против дистиллированной воды с добавлением физиологического раствора (1:10) при температуре 4 оС со сменой буфера каждые 6-8 ч. После диализа антиген концентрировали против ПЭГ-6000, концентрацию белка определяли по методу Лоури, после чего пропускали через бактериальную мембрану с диаметром пор 0,22-0,24 мкм. Сохраняли экскреторно-секреторный антиген при -18 оС или в кельви-наторе при -70 оС.
Получе ние р е ко мбинантно го антиге на Ts p1 трихин е л л . Рекомбинантный протеин Tsp1 получен путем клонирования участка гена, кодирующего иммунологически активный гликопротеин трихинелл (gp 53 кДа Trichinella spp.), в экспрессирующей векторной системе [2]. Очищенный методом гель-фильтрации на сефадексе G100 рекомбинантый антиген T. spiralis Tsp1 молекулярной массой 37,7 кДа предварительно оттитровали в физиологическом растворе до концентрации белка 100 мкг/мл. Содержание рекомбинантного белка в испытуемом вакцинирующем комплексе составило 25 мкг, в итоге при двукратном введении каждому животному было инъецировано по 50 мкг белка-антигена.
Активность и специфичность полученных антигенов T. spiralis проверяли в ИФА с сыворотками крови экспериментально зараженных трихинеллами и другими гельминтами лабораторных животных.
Пр ове де ние испытания протективных свойств пре пар ато в. Животных разделили на 5 равноценных групп по 10 животных в каждой. Иммунизацию проводили подкожно, двукратно, с интервалом в 21 сут. Все вещества вводили в объеме 0,5 мл. Заражение инвазионными личинками трихинелл животных всех 5 групп проводили через 21 сут после второй иммунизации.
Животным первой группы вводили рекомбинантный антиген Tsp1 без адъюванта в количестве 50 мкг/мышь (двукратно, по 25 мкг). Очищенный антиген растворяли в стерильном физиологическом растворе.
Животным второй группы в той же дозе вводили экскреторносекреторный антиген трихинелл (базовый препарат), полученный согласно патенту РФ № 22287342 от 20 ноября 2006 г. (авторы Одоевская И.М., Курносова О.П., Успенский А.В.).
Животных третьей группы иммунизировали рекомбинантным антигеном Tsp1, эмульгированным в 0,5 мл вышеуказанной адъювантной композиции.
Животные четвертой группы подверглись иммунизации экскреторносекреторным антигеном трихинелл в аналогичной дозе (25 мкг антигена, эмульгированные в 0,5 мл адъювантной композиции).
Животным пятой группы во время проведения иммунизации вводили физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Эти животные служили контролем.
Убой животных всех групп и учет результатов опыта осуществляли через 45 сут после проверочного заражения инвазионными личинками T. spiralis. Интенсивность инвазии у животных всех групп оценивали компрессорно и методом переваривания в ИЖС тушек мышей, для подсчета личинок использовали гельминтологическую камеру Мигачевой-Котельникова.
Статистическую обработку результатов опыта проводили согласно руководству Ашмарина (1975). Протективный эффект вычисляли по формуле:
Э = {(А- В) : А} х 100 %, где Э - эффективность вакцинации; А - число гельминтов у животных контрольной группы; В - число гельминтов у иммунизированных животных.
Результаты и обсуждение
В процессе производства экскреторно-секреторных антигенов нами получено 875 мл культуральной жидкости с концентрацией белка от 378 до 520 мкг/мл. После проведенной очистки и лиофильного высушивания был получен 84
антиген в количестве 393 мг. Рекомбинантного белка молекулярной массы 37,7 кДа было наработано 800 мкг. Полученные белки использовали для иммунизации как в чистом виде, так и в комплексе с адъювантной композицией.
Средняя интенсивность инвазии у мышей контрольной группы, получавших при иммунизации физиологический раствор в объеме 0,5 мл, составила 2367 л/г. Животные 3-й группы, двукратно иммунизированые рекомбинантным антигеном Tsp1, эмульгированным в 0,5 мл вышеуказанной адью-вантной композиции, были инвазированы личинками T. spiralis в значительно меньшей степени. Интенсивность инвазии в пересчете на 1 грамм костномышечного фарша у этой группы мышей составила 580 личинок. Таким образом, протективный эффект при применении биологического препарата, состоящего из рекомбинантного антигена Tsp1 молекулярной массой 37,7 кДа и адъювантной композиции, составил 75,5 %.
Интенсивность инвазии у животных 1-й группы, инъецированных антигеном Tsp1 без адъюванта в количестве 50 мкг/мышь (двукратно, по 25 мкг) составила 1655 л/г, соответственно протективный эффект равнялся 30,1 %.
Интенсивность инвазии у животных 2-й группы, инъецированных экскреторно-секреторным антигеном без адъюванта в количестве 50мкг/мышь (двукратно, по 25 мкг) составила 758 л/г, соответственно протективный эффект равнялся 68%.
Интенсивность инвазии у экспериментально зараженных трихинеллами мышей, ранее двукратно иммунизированных базовым препаратом, состоящим из экскреторно-секреторного антигена трихинелл в аналогичной дозе с адъювантной композицией, составила в среднем по группе 191 л/г. Эффективность вакцинации данным препаратом была самой высокой и составила 91,8 %.
Результаты эксперимента приведены в таблице 1.
1. Протективный эффект различных средств
№ груп- пы Иммунизи- рующее средство Иммунизация Доза зара- же- ния, лич./ гол. Сред. значение по группе, лич. Уровень про-тект. защиты, %
доза, мкг бел- ка кра тно сть интер- вал, сут
1 Рекомб. белок ТБр1 25 2 21 200 1655 30,1
2 Экскр./секр. белки 25 2 21 200 758 68,0
3 Рекомб. белок + адъювант 25 2 21 200 580 75,5
4 Экскр./секр.+ адьювант 25 2 21 200 191 91,8
5 Стерильн. физ. р-р. (контроль) - 2 21 200 2367 -
Полученные данные доказывают то, что антигены без вспомогательных веществ не способны вызывать стойкий продолжительный протективный эффект (эффективность 30,1 % против 75,5 % для рекомбинантного антигена и эффективность 68 % против 91,8 % для экскреторно-секреторных антигенов соответственно).
Как видно из таблицы 1, экскреторно-секреторный антиген обладает более выраженным протективным эффектом по сравнению с рекомбинантным белком Т8р1. Это связано с тем, что последний представляет собой часть (37,7 кДа) иммунодоминантного гликопротеина трихинелл молекулярной массы 53 кДа, в то время как используемый в данном эксперименте экскре-
торно-секреторный антиген является смесью нескольких белков в диапазоне молекулярных масс 29-63 кДа, отличающихся по изоэлектрической точке и обладающие различной иммуногенностью [1, 7].
Полученный нами результаты сопоставимы с данными зарубежных авторов [16], которые внутримышечно иммунизировали мышей рекомбинантной эукариотической плазмидой pcDNA3-TspE1, содержащей ген, кодирующий 31 кД антиген T. spiralis. Введение ДНК-вакцины вызывало селезеночный лимфоцитоз, стимулировало гуморальный и клеточный иммунные ответы.
Аналогичные результаты получены при сравнении протективного эффекта белков с молекулярными массами 37, 48 и 50/55 кДа. Наибольшей степенью защиты, сопоставимой с заражением трихинеллами, обладал белок с массой 48 кДа, чуть менее - белок с массой 50/55 кДа. Белок с молекулярной массой 37кДа был неэффективен и выявлял защиту только при дозе 50 мкг белка/мышь [12].
Marti, Murrell, Gamble проводили иммунизацию свиней новорожденными личинками T. spiralis, которые предварительно были подвержены замораживанию, в комбинации с полным адъювантом Фрейнда [10]. Протективный эффект оценивался по сравнению с иммунизацией экскреторносекреторными продуктами мышечных личинок. Таким образом, иммунизация антигенами из новорожденных личинок дала эффективность 78 %, тогда как, при использовании экскреторно-секреторных антигенов получен всего лишь 40%-ный эффект. При использовании целых личинок и нерастворимой фракции антигенов из разрушенных с помощью ультразвука новорожденных личинок трихинелл (соматический антиген) была получена протективная эффективность 88,2 и 85,5 % соответственно. Причем в обоих случаях у свиней формировался иммунитет только к новорожденным личиночным антигенам, а не к экскреторно-секреторным антигенам мышечных и взрослых личинок.
Полученные нами результаты, по-видимому, обусловлены использованием эффективной адъювантной композицией у животных 3 и 4-й групп.
Иммуногенное действие адъювантной композиции в сочетании с полученными нами антигенами трихинелл проявлялось в:
изменении состояния вводимых паразитарных антигенов (их агрегирование с компонентами адъюванта), что способствовало взаимодействию с чувствительными клетками иммунной системы животного, облегчая фагоцитоз;
депонировании антигенов трихинелл, их пролонгированной циркуляции в организме и замедлении гидролиза антигенных молекул тканевыми ферментами за счет использования мелкодисперсной масляной основы и гидрофильного эмульгатора «Твин-80»;
дополнительной стимуляции вспомогательных звеньев иммуногенеза, в том числе усилении макрофагальной реакции, синтезе оксида азота, стимуляции Т- и В-лимфоцитов, цитокинов, глобулинов, антител, связанных с введением в адъювантную композицию эукариотической рибонуклеиновой кислоты (РНК) и аминокислоты L-аргинина. Небольшие гранулемы у иммунизированных животных на месте апликации служат показателем адъювантного действия вакцинного препарата и его морфологической корреляции.
Многие иммуноадьюванты стимулируют образование антител, но лишь некоторые способны повысить их аффинность. Поскольку от этих свойств зависит напряженность гуморального и клеточного звеньев иммунитета, использование адъювантной композиции в сочетании с иммунодоминантными антигенами трихинелл позволяет получать высокий протективный эффект против заражения мышечными личинками T. spiralis.
Данная разработка может быть рекомендована для иммунизации против трихинеллеза у разных видов животных (охотничьих собак, клеточных пушных зверей, кошек).
Литература
1. Одоевская И.М., Курносова О.П. Сравнительный иммунохимический анализ полного соматического экстракта, соматического фракционированно-
86
го и экскреторно-секреторных белков и антигенов личинок T. spiralis // Мед. паразитол. - 2007. - № 3. - С. 24-29.
2. Одоевская И.М., Асеев В.В., Кушнарева Ю.В. и др. Амплификация фрагмента гена, кодирющего иммунодоминантный гликопротеин трихинелл молекулярной массой 53 кДа // Мед. паразитол. - 2009. - № 2. - С. 37-40.
3. Патент РФ № 2348427 от 10 марта 2009 г. Адъювантная композиция для инъекционных вакцин против тканевых гельминтозов (Одоевская И.М., Курносова О.П., Успенский А.В. и др.).
4. Aguilar J.C., Rodriguez E.G. Vaccine adjuvants revisited. 2007.Vaccine 25.
- P.3752-3762.
5. Ali S.M. et al. Immunization against trichinellosis using microwaved larvae of Trichinella spiralis // J. of the Egyptian Soc. of Parasitol. - 2007. - V. 37, № 1.
- P.121-33
6. Carolann McGuire, Weng C. Chan, Derek W. Nasal immunisation with ho-mogenate and peptide antigens induces protective immunity against Trichinella spiralis // Infection and Immunity. - 2002. - V. 70, № 12. - P. 7149-7152,
7. Gamble H.R. Trichinella spiralis: Immunization of Mice Using Monoclonal Antibody Affinity-Isolated Antigens // Exp. Parasitol. - 1985. - V. 59. - P. 398404.
8. Goyal P. K, Bolas-Fernandez F, Wakelin D. Immunization of mice against Trichinella spiralis and T. britovi using excretory and secretory antigens // J. Hel-minthol. - 1997. - V. 71, № 2. P. 109-112.
9. Jung Cui, Zhongquan Wang, Hongwei Zhang et al. Expression of the antigenic gene TspE1 of Trichinella spiralis in skin and muscle of BALB/c mice // Life science J. - 2005. - V. 2, № 1. - P. 35-37.
10. Marti H.P., K.D. Murrell, Gamble H.R. Trichinella spiralis: Immunization of pigs with newborn larval antigens // Exp. Parasitol. - 1987. - V. 63, № 1. - P. 68-73.
11. Schmidt C.S., Morrow W.J. W., Sheikh N.A. Smart Adjuvants // Expert Rev. Vaccines. - 2007. - V. 6, № 3. - P. 391-400.
12. Silberstein D.S., Despommier D.D. Antigens from Trichinella spiralis that induce a protective response in the mouse // J. of Immunology. - 1984. - V. 132. -P. 898-904,
13. Stills, H.F., Bailey M.Q. The use of Freund’s Complete Adjuvant // Lab. Animal. - 1991. - V. 20, № 4. - P. 25-31.
14. Stills H.F. Adjuvants and antibody production: dispelling the myths associated with Freund's complete and other adjuvants // ILAR J. - 2005. - V. 46, № 3.
- P.280-293.
15. Toth L.A., Dunlap A.W., Olson G.A. et al. An Evaluation of Distress Following Intraperitoneal Immunization with Freund’s Adjuvant in Mice // Lab. Anim. Sci. - 1989. - V. 39, № 2. - P. 122-126.
16. Wanga Z.Q., Cuia J., Weia H.Y. et al. Vaccination of mice with DNA vaccine induces the immune response and partial protection against T. spiralis infection, 2004.
The comparative analysis of preparations of protective action on a basis of recombinant and excretory-secretory antigens of Trichinella spp. at experimental trichinellosis of laboratory animals
A.V. Klinkov, I.M. Odoevskaja
Levels of protective effect are investigated at immunization of mice by biological preparations on a basis of recombinant antigens Tsp1 in molecular weight 37,7 ^а and excretory-secretory antigens in molecular weight 29-63 ^а in the pure state and in complex with adjuvant composition. The high level of protective protection (91,8 %) has shown preparation consisting from excretory-secretory antigenes from T. spiralis and adjuvant composition.
Keywords: Trichinella spiralis, protective effect, recombinant and excretory-secretory antigenes, trichinellosis, mice.
