CC BY
210
Взаимоотношения в системе «паразит-хозяин»
УДК 619:616.995.132.6
ОСОБЕННОСТИ ПАРАЗИТО-ХОЗЯИННЫХ ОТНОШЕНИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЗАРАЖЕНИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ АРКТИЧЕСКИМИ ИЗОЛЯТАМИ TRICHINELLA NATIVA
И.М. ОДОЕВСКАЯ кандидат биологических наук
А.В. ХРУСТАЛЕВ старший научный сотрудник
А.В. КЛИНКОВ аспирант
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, тел./факс 8-499-124-56-55, e-mailrvigis@ncport.ru Ю.А. РУДЕНСКАЯ кандидат биологических наук И.Ю. ФИЛИППОВА доктор химических наук
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова
А.Д. РЕШЕТНИКОВ доктор ветеринарных наук
Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства
Изучены биологические свойства арктических изолятов Trichinella nativa, выделенных из мышц белого медведя и росомахи, обитавших в разных зоогеографических биоценозах Якутии. Изучены адаптивные реакции, иммуногенные свойства и штаммовые различия этих трихинелл при пассировании на лабораторных грызунах. Проведен сравнительный анализ результативности пассирования и скрининга протеолитических свойств по отношению к 16 синтетическим субстратам исследуемых арктических изолятов трихинелл. Показано, что при замораживании при - 18 °С личинок трихинелл, находящихся в мышцах белого медведя и росомахи в течение 26 мес., значительная часть гельминтов осталась жизнеспособной. В мышцах белых крыс резистентность трихинелл к замораживанию резко снижается, к 5 суткам сохраняют жизнеспособность менее 10 % паразитов, к 7 суткам все личинки погибают. Резистентность T. nativa к резкому понижению температуры является генетически обусловленным признаком, который зависит от степени адаптации к конкретному организму жи-вотного-хозяина.
Ключевые слова: Trichinella nativa, белые крысы, протеиназа, адаптация, устойчивость.
Трихинеллез является природно-очаговой инвазией и зарегистрирован практически во всех странах мира. Трихинеллы выявлены более чем у ста
31
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
видов млекопитающих, рептилий и птиц в различных зоогеографических зонах. В настоящее время во многих странах проводятся фундаментальные исследования биологических и молекулярных основ паразито-хозяинных отношений при различных гельминтозах человека и животных с целью создания эффективных лечебных и профилактических препаратов.
Основной задачей наших исследований явилось изучение у арктических изолятов трихинелл генетической обусловленности адаптивных реакций и штаммовых различий, связанных с приспособлением этих гельминтов к природным особенностям биоценозов и гостальной специфичностью Trichinella nativa к лабораторным грызунам.
Вид Trichinella nativa достаточно широко распространен среди дикой природы арктических и субарктических областей Голарктики. На территории Якутии (Республики Саха) зарегистрирован только один вид капсулообразующих трихинелл - T. nativa Britov, Boev, 1972 (генотип Т2). Данный вид характеризуется низким потенциалом воспроизводства, связанным с короткой длиной матки, плохой адаптацией к крысам, диким кабанам и домашним свиньям и высокой резистентностью к замораживанию [3, 8, 9, 17]. Поскольку для трихинелл средой обитания является организм хозяина, фенотипическая изменчивость паразитов наиболее ярко проявляется при заражении животного, не входящего в трофическую схему циркуляции трихинеллеза в данном биоценозе. Часто смена фенотипических параметров выражается не только морфологически, но и в изменении вирулентности, плодовитости, резистентности к неблагоприятным условиям, продолжительности паразитирования в новом для них организме хозяина. Проявление вышеуказанных биологических особенностей и широкого разнообразия адаптивных реакций паразита по отношению к организму хозяина в значительной степени обеспечивается протеолитическими ферментами.
Протеолитические ферменты являются ключевыми в обмене веществ у всех прокариотических и эукариотических организмов. Наиболее изученная функция протеиназ - участие в пищеварении. Заслуживают внимания и другие, не менее важные их функции, - посттрансляционная модификация белков, элиминирование мутантных и поврежденных полипептидов, процессинг белков, пептидных гормонов и других физиологически важных пептидов. Протеиназы участвуют в процессах секреции, репарации, морфогенезе и дифференцировке, развитии иммунного ответа при воздействии патогенов. Доказано, что иммуносупрессивное действие паразитов на организм хозяина во многом зависит от активности протеолитических ферментов, способных гидролизовать шарнирную область IgG и тяжелые цепи иммуноглобулинов всех классов, а также расщеплять интерлейкин 1р. В свою очередь, ферменты, принадлежащие к семейству катепсинов, являются главными компонентами лизосомальной системы и играют важную роль в белковом обмене клетки. Известно, что наличие цистеиновых протеиназ характерно для патогенных простейших и микроорганизмов, причем в большинстве случаев эти ферменты - важные факторы патогенности. Наиболее сильное различие между патогенными и непатогенными близкородственными видами наблюдают в экспрессии цистеиновых протеиназ [6, 7, 10, 13, 18, 19].
Для изучения протеолитических ферментов трихинелл, как правило, используют их экскреторно-секреторные продукты и соматические экстракты. Определена протеолитическая активность экскреторно-секреторных белков трихинелл молекулярной массой 230, 150, 98, 62, 58, 48, 42, 33 кДа, принадлежащих к различным семействам экзо- и эндопептидаз (таким, как сериновые, аспарагиновые, цистеиновые, цинковые металлопротеиназы). Показано, что при смене экологических условий обитания личинки трихинелл могут существенно изменять качественный и количественный состав синтезируемых ими протеолитических ферментов, участвующих в переваривании пище-
32
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
вых субстратов, гидролизе внеклеточных матричных компонентов, деградации эпителиальных тканей кишечника, расплавлении мышечных волокон, регуляции транскрипции генов в миоцитах хозяина, создании условий при миграции личинок с целью защиты от иммунной системы макроорганизма [6, 7, 21, 22].
При анализе на молекулярном уровне взаимодействий инвазионных личинок трихинелл и клеток мышечной ткани (миоцитов) хозяина показано, что при заражении трихинеллезом в миоцитах хозяина снижается экспрессия структурных и регуляторных генов. В зараженных клетках обнаруживают многочисленные белки, отсутствующие в свободных от инвазии миоцитах, их наличие обеспечивает инкапсуляцию личинок коллагеноподобными волокнами. Механизм реорганизации клеток хозяина на генном уровне, по-видимому, запускается экскреторно-секреторными продуктами трихинелл, индуцирующими не только разрушение мышечных волокон, но и активно взаимодействующих с ядерным аппаратом миоцитов хозяина за счет наличия в них специальных ДНК-связывающих белков. Таким образом, молекулы трихинелл взаимодействуют с миоцитами на уровне ядра, принимая участие в регуляции транскрипции и трансляции в клетках хозяина. Воздействие подобных молекул вызывает цепь репрограммирующих реакций, таких как расщепление ДНК хозяина, гибель некоторых его генов, задержку клеточного цикла, изменение экспрессии генов, позволяющих подстраивать «под себя» транскрипционный процесс хозяина. Для трихинелл результатом вышеуказанных процессов является реорганизация клеток макроорганизма, создание подходящей среды обитания, обеспечивающей длительное сосуществование системы паразит-хозяин.
В течение многих лет для пополнения коллекции природных изолятов трихинелл в институте проводили пассирование трихинелл на лабораторных животных. При этом неоднократно отмечали существенные различия адаптационных свойств этих тканевых гельминтов по отношению к млекопитающим разных видов [16]. Не вызывает сомнения актуальность более детального изучения механизмов паразито-хозяинных взаимоотношений при экспериментальном трихинеллезе в плане выявления генетической обусловленности проявлений фенотипа гельминта в различных условиях внешней среды.
Работа посвящена сравнительному анализу адаптационных свойств, биологических особенностей арктических изолятов T. nativa из Якутии и протеолитической активности продуцируемых ими ферментов при пассажах на лабораторных грызунах.
Материалы и методы
В эксперименте использовали инвазионные личинки трихинелл (T. nativa), выделенные из мышечной ткани белого медведя (Ursus maritimus), отстреленного в связи с неоднократными случаями его нападения на домашних животных и жителей в поселке, расположенном на Арктическом побережье Восточно-Сибирского моря (северо-восток Якутии). Росомаху (Gulo gulo) поймали охотники в горно-таежной зоне Нерюнгринского района (юг Республики Саха).
Использовали также белых беспородных мышей массой 18-20 г (40 гол.) и белых беспородных крыс массой 120-130 г (18 гол.). Дозы заражения животных составляли: для крыс - 2 лич./г, для мышей - 5 лич./г массы тела животного.
Для обнаружения капсул трихинелл использовали метод компрессорной трихинеллоскопии. Морфометрию капсул определяли по результатам измерения не менее 25 экз. от каждого вида зараженных животных. Индекс формы вычисляли отношением диаметра капсулы к ее длине (V=D/L). Статистическую обработку результатов морфометрии капсул проводили с использованием критерия достоверности Стьюдента-Фишера, вероятность различий
33
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
считали существенной при Р<0,05. Мышечные ткани диких млекопитающих переваривали в искусственном желудочном соке (ИЖС) и проводили подсчет количества личинок. Среднюю интенсивность инвазии (ИИ) и потенциал плодовитости природных арктических изолятов трихинелл в каждом пассаже определяли методом переваривания в ИЖС костно-мышечного фарша тушек мелких лабораторных грызунов.
Изучение резистентности арктических изолятов трихинелл из мышц белого медведя и росомахи к замораживанию проводили в лаборатории паразитологии Якутского НИИСХ. Продолжительность эксперимента составляла 36 мес., аликвоты мышечной ткани вышеуказанных животных постоянно находились по при -18 °С в морозильной камере холодильника. Для удобства проведения наблюдений за жизнеспособностью личинок трихинелл мышечную ткань животного-хозяина или тушки экспериментально зараженных крыс разделяли на части, каждую измельчали и помещали в пластиковую чашку Петри. На этикетке указывали, когда и от какого вида диких животных получен биологический материал, какова средняя ИИ (лич./г), имеются ли морфологические изменения капсул и личинок трихинелл. Плотно закрытую чашку Петри дополнительно заворачивали в полиэтиленовый пакет (с целью предотвращения вымораживания образцов) и помещали в морозильную камеру бытового холодильника с температурой -18 °С. Через определенное количество времени проводили протеолиз мышечной ткани в ИЖС, выделение личинок трихинелл, изучали морфологические изменения, проводили оценку их жизнеспособности.
Определение жизнеспособности и реакции трихинелл проводили следующим образом. Полученных после протеолиза в ИЖС личинок многократно отмывали холодной водопроводной водой и стерильным физиологическим раствором. Под бинокулярным микроскопом оценивали соотношение скрученных в спираль и имеющих форму запятой личинок. Для объективной оценки количественного соотношения живых и мертвых личинок в пробах мы разработали следующую методику. Из числа скрученных в спираль личинок пипеткой отбирали не менее 100 экз. и помещали их в питательную среду ДМЕМ с глутамином на 10-12 ч в термостат при температуре 39 °С. Затем подсчитывали количество подвижных личинок (живые трихинеллы извиваются всем телом и совершают активные колебательные движения головным и хвостовым концом) и оставшихся в форме плотной спирали или диска (это мертвые личинки). Для определения поведенческой реакции личинок T. nativa отбирали пипеткой теплую среду ДМЕМ и добавляли охлажденную до 4 °С, время свертывания в тугую спираль фиксировали по секундомеру. При необходимости инвазионность трихинелл после замораживания проверяли биопробой на белых беспородных мышах.
Потенциал воспроизводства (ПВ) трихинелл определяли как отношение общего числа извлеченных из тушек паразитов к числу введенных при заражении.
Морфологию мышечных личинок арктических изолятов трихинелл изучали под световым микроскопом Zeiss AxioImager.Zl, оснащенным фотокамерой Zeiss AxioCam HR. Цифровую фотосъемку и обработку снимков осуществляли в программе Zeiss Axio Vision. Использовали методы проходящей микроскопии в светлом поле и дифференциального интерференционного контраста. Образцы мышечной ткани для исследований готовили с помощью компрессория, затем монтировали на предметных стеклах. Полученные препараты микроскопировали в нативном виде, либо просветляли смесью из равных объемов глицерина, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды. Применение просветляющей среды кардинально улучшало визуализацию структур, но, вместе с тем, вызывало некоторое набухание коллагена стенки капсул. Наличие данного явления учитывали при оценке микроскопи-
34
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
ческой картины. При проведении морфометрии капсул трихинелл использовали только нативные непросветленные препараты.
ИФА ставили в непрямом варианте. Для сенсибилизации твердой фазы использовали экскреторно-секреторные антигены трихинелл молекулярной массой 29-63 кДа [14, 15]. Положительной считали пробу, оптическая плотность (ОП) которой более чем в два раза превышала показатели отрицательного контроля. Результаты ИФА оценивали на спектрофотометре 340/АТС фирмы STL-Labsistems (Австрия) с автоматическим ридером и вертикальным лучом света при длине волны 450 нм (ОП 450).
В качестве доноров положительных сывороток крови использовали экспериментально зараженных T.nativa (в дозе 10 личинок на 1 г массы тела) белых беспородных крыс (массой 160-180 г) и мышей (18-20 г). Отрицательные сыворотки крови получали от выбракованных по возрасту животных из числа маточного поголовья в виварии ВИГИС. Убой животных (в количестве 3-х голов на каждый срок) и получение сывороток крови проводили на 30, 60 и 90-е сутки после заражения. В ИФР исследовали сыворотки крови мышей (1-4-й пассаж) и крыс (3-5-й пассаж).
Определение субстратной специфичности и степени протеолитической активности в экскреторно-секреторных продуктах арктических изолятов трихинелл проводили с использованием 16 субстратов.
Аминокислотную последовательность субстратов выбирали после тщательного анализа частоты встречаемости той или иной аминокислоты в каждом из положений, участвующих во взаимодействии с областью активного центра каждого из исследуемых ферментов. В качестве субстратов использовали короткие синтетические пептиды с С-концевой хромогенной п-нитроанилидной группой. При отщеплении от исходного субстрата n-нитроанилина спектр поглощения изменялся, что определяли спектрофотометрически.
Детекцию проводили при 410 нм, т. к. при этой длине волны поглощение n-нитроанилида практически отсутствует.
Субстрат Тестируемый фермент
Арг-НА Arg*-pNA (I) Аминопептидаза
Ала-НА Ala*-pNA (II) Аминопептидаза
Лей-НА Leu*-pNA (Ш) Аминопептидаза
Вал-НА Val*-pNA (IV) Аминопептидаза
Про-НА Pro*-pNA (V) Аминопептидаза
Кбз-Глу-НА Z-Glu*-pNA (VI) Глутамилэндопептидаза
Ац-Фен-НА Ac-Phe*-pNA (VII) Химотрипсин
ПироГ лу-Фен-НА Glp-Phe*-pNA (VIII) Химотрипсин
БАПА Bz-Arg*-pNA (IX) Трипсин, цистеиновые катепсины
Кбз-Фен-Арг-НА Z-Phe-Arg*-pNA (X) Трипсин, цистеиновые катепсины
Кбз-Ала-Фен-Арг-НА Z-Ala-Phe-Arg*-pNA (XI) Трипсин, катепсин
ПироГлу-Фен-Ала-НА Glp-Phe-Ala*-pNA (XII) Цистеиновые катепсины
Кбз-Ала-Ала-Лей-НА Z-Ala-Ala-Leu*-pNA (XIII) Субтилизин
ПироГлу-Ала-Ала-Лей-НА Glp-Ala-Ala-Leu*-pNA (XIV) Субтилизин
Кбз-Ала-Ала-Про-НА Z-Ala-Ala-Pro *-pNA (XV) Пролилэндопептидаза
Кбз-Гли-Гли-Про-НА Z-Gly-Gly-Pro*-pNA (XVI) Пролилэндопептидаза
* место расщепления субстрата ферментом.
Соединения (I)-(V), (IX), (X) являются коммерческими продуктами (фирма БАХЕМ, Швейцария). Остальные субстраты были синтезированы в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Для тестирования ферментативной активности аминопептидаз в соответствии с их специфичностью была использована группа п-нитроанилидов раз-
35
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
личных аминокислот общей формулы АК-НА, где АК - аргинин, аланин, лейцин, валин, пролин (I-V); НА - «-нитроанилин.
Для идентификации глутамилэндопептидазы, расщепляющей в пептидах и белках пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты, был использован «-нитроанилид бензилоксикарбонил-глутаминовой кислоты Кбз-Глу-НА (Z-Glu-pNA) (VI).
Активность химотрипсина, специфичного в отношении ароматических аминокислот, определяли с помощью «-нитроанилида ацетил- и пироглута-милфенилаланина - Ац-Фен-НА (Ac-Phe-pNA) (VII) и (VIII) соответственно.
Для тестирования трипсинов, строго ограниченных в своей специфичности остатками основных аминокислот, были использованы аргининсодержащие субстраты бензоиларгинин «-нитроанилид (БАПА) (Bz-Arg-pNA) (IX), бензилоксикарбонил-фенилаланил-аргинин «-нитроанилид (Кбз-Фен-Арг-НА) (Z-Phe-Arg-pNA) (X) и бензилоксикарбонил-аланил-фенилаланил-аргинин «-нитроанилид (Кбз-Ала-Фен-Арг-НА) (Z-Ala-Phe-Arg-pNA) (XI).
Следует отметить, что субстраты (IX)-(XI) могут также расщепляться цистеиновыми катепсиноподобными протеазами. Для более надежной идентификации этой группы ферментов был использован высокоспецифичный субстрат цистеиновых протеиназ пироглутамил-фенилаланил-аланин «нитроанилид- ПироГлу-Фен-Ала-НА (Glp-Phe-Ala-pNA) (XII).
Активность субтилизинов, обладающих широкой субстратной специфичностью, и гидролизующих преимущественно связи, образованные остатками гидрофобных аминокислот, тестировали с помощью «-нитроанилидов бензилоксикарбонил- и пироглутамил-аланил-аланил-лейцина - Кбз-Ала-Ала-Лей-НА (Z-Ala-Ala-Leu-pNA) (XIII) и ПироГлу-Ала-Ала-Лей-НА (Glp-Ala-Ala-Leu-pNA) (XIV) соответственно.
Для идентификации пролилэндопептидаз, гидролизующих пептидные связи после остатка пролина, были использованы «-нитроанилиды бензилок-сикарбонил-аланил-аланил-пролина - Кбз-Ала-Ала-Про-НА (Z-Ala-Ala-Pro-pNA) (XV) и бензилоксикарбонил-глицил-глицил-пролина - Кбз-Гли-Гли-Про-НА (Z-Gly-Gly-Pro-pNA (XVI).
В эксперименте использовали мышечные личинки арктических изолятов трихинелл 3-го пассажа на белых беспородных крысах. Тщательно отмытых стерильным физиологическим раствором гельминтов в течение суток инкубировали в ИПС ДМЕМ с глутамином, затем измеряли концентрации белка по методу Бредфорд, гомогенизат личинок готовили согласно рекомендациям [14]. Активность протеаз исследовали в экскреторно-секреторных продуктах и гомогенизате личинок трихинелл.
Для проведения реакции (конечный объем 800 мкл доводили 0,01М трис-HCl, рН 8,0) все субстраты вносили в количестве 10 мкл. Исследуемые образцы, предварительно оттитрованные (до концентрации белка 3 мг/мл), использовали в объеме 500 мкл. Для субстрата GlpPheAlapNA предварительно инкубировали образцы для активации фермента при 20 оС в течение 40 мин в присутствии в реакционной смеси 10 мМ дитиотрейтола (ДДТ) и 0,1М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), после этого добавляли вышеуказанный субстрат. Реакция проходила при 37 оС в течение 18 ч, останавливали ее добавлением 100 мкл 50%-ной уксусной кислоты, затем исследуемые образцы центрифугировали при 14000 об/мин. Оптическую плотность измеряли фотоколориметрически при длине волны 410 нм против соответствующих контролей.
Результаты и обсуждение
Морфометрические измерения капсул и размера трихинелл, выделенных из мышц хищников, проведенные в лаборатории паразитологии Якутского НИИСХ, показали, что длина капсул в мышцах белого медведя составила
36
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
486-573, росомахи - 479-598 мкм, а ширина 312-384 и 298-372 мкм соответственно. Для капсул трихинелл из мышц белого медведя форминдекс составляет 0,79, а для капсул из мышц росомахи - 0,71. Средняя интенсивность инвазии в мышечной ткани росомахи составила 2,28, а белого медведя - 3,57 личинок на 1 г.
Арктические изоляты трихинелл сохраняли свою жизнеспособность в течение всего срока наблюдения (3 года) и вызывали заражение белых беспородных мышей трихинеллами при скармливании им кусочков зараженных мышц белого медведя и росомахи.
Дальнейшие исследования личинок T. nativa, сохранившихся в мышечной ткани полярных хищников после 3-летнего замораживания, проводили в лаборатории биотехнологии ВИГИС. После протеолиза в ИЖС мышечной ткани нами было выделено всего 169 живых личинок от белого медведя и 114 - от росомахи. Установлено, что количество мертвых личинок в исследуемых пробах превышало количество подвижных в 2,5-3 раза. Инвазионными личинками трихинелл в количестве 18-20 экз. были заражены белые беспородные мыши. Через 60 сут провели учет результатов первого пассажа на мышах арктических изолятов трихинелл. В среднем ИИ в 1 г костно-мышечного фарша изолята от медведя составила 2,63, от росомахи - 0,94 личинок на 1 г. Потенциал воспроизводства изолята от белого медведя составил 1,87, от росомахи - 0,59. Отмечено некоторое изменение морфометрических показателей капсул у арктических трихинелл (1 пассаж на мышах), форминдекс составил для изолята от белого медведя 0,71, и 0,68 у мышей 1-го пассажа от росомахи.
После протеолиза в ИЖС и последующего отмывания холодной водопроводной водой личинки якутских изолятов трихинелл сворачивались в очень тугую спираль из 5 оборотов бочкообразной формы, в вертикальной проекции напоминающую диск. Размер спирали трихинелл, выделенных из мышц белого медведя, составил в длину 0,153-0,158 и в ширину - 0,1120,117 мм; у росомахи соответственно 0,146-0,155 и 0,105-0,109 мм.
Полученными после протеолиза в ИЖС личинками в количестве 100 экз. вышеуказанных изолятов были заражены по 3 белых беспородных крысы массой 120-130 г. Через 45 сут животных убили и провели морфометрические измерения капсул, протеолиз средней пробы костно-мышечного фарша в ИЖС. Форминдекс капсул существенно не изменился и составил 0,72 (2-й пассаж от белого медведя) и 0,67 (2-й пассаж от росомахи). Интенсивность инвазии трихинеллами, полученными от белого медведя, составила 656,08 лич./г, от росомахи - 23,75лич./г. Таким образом, потенциал воспроизводства у арктических трихинелл во втором пассаже на лабораторных грызунах составил 6,56 и 2,4 соответственно.
Личинок 2-го пассажа использовали для определения чувствительности их реакции к холодной (4-6 °С) и теплой среде (37-39 °С). Для этого декапсулированных личинок трихинелл, инкубированных в теплой среде ДМЕМ, отбирали пипеткой и помещали на часовое стекло с той же средой, но охлажденной до 4 °С. Контролем служили эталонные виды T. spiralis и T. nelsoni, также пассированные на лабораторных грызунах. Результаты опыта показали различную чувствительность личинок 3-х видов трихинелл к холодной и теплой среде. На воздействие холодом быстрее всех реагировали личинки арктических изолятов. Личинки T. nativa при резком понижении температуры до 24 °С мгновенно образуют тугую спираль из 5 оборотов, по форме напоминающую диск. T. spiralis и T. nelsoni при тех же условиях в течение более длительного времени образуют спираль из 4-х оборотов в форме «бочонка». Морфология кутикулы у арктических изолятов T. nativa визуально отличалась от строения поверхности тела других видов трихинелл наличием более объемных выпячиваний стихохосомных клеток.
37
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
У арктических изолятов трихинелл сильно развита пластина аморфного слоя и гиподермальные мышечные бугорки, что выделяет их из числа других видов капсулообразующих трихинелл [20] (рис. 1-5). Вероятно, подобная особенность бугорчатого строения кутикулы дает возможность T. nativa осуществлять столь выраженную защитную реакцию на критическое понижение температуры.
А Б
Рис. 1. Декапсулированные личинки T. native после протеолиза в ИЖС: А - изолят от белого медведя; Б - изолят от росомахи
А Б
Рис. 2. Капсулы T. nativa в мышцах белого медведя:
А - в проходящем свете; Б - дифференциальный интерференционный
контраст (ДИК)
38
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
Рис. 3. Капсулы T. nativa (изолят от белого медведя) в мышцах лабораторных
грызунов*
Vi-i mic- Х> 2>ЛЛ
Рис. 4. Капсулы T. nativa в мышцах росомахи*
А Б
Рис. 5. Капсулы T. nativa (изолят от росомахи) в мышцах лабораторных
грызунов*
Примечание. * А - в проходящем свете; Б - дифференциальный интерференционный контраст (ДИК)
39
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
Однако личинки, первоначально выделенные из географически удаленных регионов и помещенные в термостат в питательной среде, начинают «оживать» и двигаться в различные сроки инкубации. Восстановительный период у декапсулированных личинок T. spiralis и T. nelsoni (также выделенных из мышц экспериментально зараженных крыс), составляет от 30 до 45 мин, в то время как северные изоляты (T. nativa) положительно реагируют на постепенное повышение температуры в течение 1,5-2-х и более часов). Некоторые авторы считают, что особенности адаптационного поведения личинок создают предпосылку ориентировочному определению трихинелл по форме спирали и характеру проявления активности при воздействии разной температуры [20].
Устойчивость трихинелл к экологическим факторам является одним из стабильных фенотипических признаков, характеризующих разные зоогегра-фические популяции. Критической температурой, влияющей отрицательно на жизнеспособность всех видов трихинелл, кроме T. nativa, является температура ниже -10 °С, вызывающая у неадаптированных трихинелл необратимые процессы в тканях. Имеются разноречивые сведения о резистентности трихинелл вышеуказанных изолятов к низким температурам. Эксперименты Бритова [3] доказывают, что T. nativa сохраняет высокую резистентность к отрицательным температурам в течение длительного времени не только в мышцах диких плотоядных животных, но и в мышцах экспериментально зараженных белых мышей. Зарубежные авторы [8, 9, 12, 17, 20], напротив, приводят данные о полной или частичной утрате устойчивости к замораживанию мышечных личинок трихинелл после заражения лабораторных мышей и крыс. Для прояснения данного вопроса нами определена фенотипическая изменчивость исследуемых трихинелл при их пассаже на лабораторных крысах и мышах.
Для этого изучали воздействие низкой температуры (-18 °С) на жизнеспособность 60-дневных личинок трихинелл арктических изолятов, находящихся в мышцах белых крыс (второй пассаж от мышей). Через 48 ч погибло 95 (изолят от росомахи) и 40 % (изолят от белого медведя) паразитов, через 5 сут сохраняли подвижность и поведенческую реакцию только 10 % трихинелл, первоначально выделенных от белого медведя, через 7 сут все трихинеллы в замороженных мышцах крыс были мертвы. Различные результаты по резистентности к замораживанию личинок трихинелл одного вида - T. nativa, одного срока заражения (60 сут) и находящихся в мышцах одного и того же вида животных (белых беспородных крыс одинакового возраста) свидетельствуют о штаммовых различиях трихинелл, о различной степени их адаптации к организму хозяина. Изолят трихинелл от росомахи из Нерюнгринского района Якутии менее приспособлен к организму лабораторных грызунов, о чем свидетельствует низкий потенциал воспроизводства, наличие вокруг абсолютного большинства капсул клеточно-ферментативной резорбции и отсутствие характерной для данного вида (T. nativa) резистентности к замораживанию в мышцах неспецифического хозяина (крысы). Результаты проведенных экспериментов сопоставимы с данными других авторов, показавшими, что резистентность вида T. nativa к резкому понижению температуры является генетически обусловленным признаком, но в значительной степени зависит от степени адаптации к конкретному организму животного-хозяина.
Исследованиями резистентности трихинелл к замораживанию занимались многие авторы. Пенькова, Владимирова [5] доказали, что в мышцах белого медведя личинки трихинелл остаются жизнеспособными и вызывают заражение домашних свиней и белых мышей даже через 8-11 мес их выдерживания при -20 °С. Однако замораживание при аналогичном температурном режиме тушек мышей, инвазированных этим же видом трихинелл (второй пассаж), вызывало 100%-ную гибель паразитов в мышцах уже через 72 ч инкубации. T. nativa в замороженных мышцах плотоядных животных сохраня-
40
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
ют жизнеспособность до 5 лет [12]. Однако такая биологическая особенность этого вида паразитов утрачивается при замораживании личинок трихинелл, находящихся в мышцах свиней и лабораторных грызунов [5, 8, 12, 17]. Таким образом, полученные нами данные сопоставимы с исследованиями отечественных и зарубежных авторов.
Причина высокой морозостойкости личинок T. nativa до конца не выяснена. Известно, что в механизмах температурной адаптации живых организмов на клеточном и субклеточном уровнях важная роль принадлежит липидам и, в первую очередь, входящим в их состав жирным кислотам. Исследования показали, что у морозоустойчивого вида трихинелл содержание ненасыщенных жирных кислот значительно больше за счет более высокого содержания длинноцепочечных полиеновых кислот, обладающих низкими коэффициентами теплового расширения [4]. Вероятно, это свойство может понижать чувствительность биологических мембран к замораживанию, что в свою очередь способствует сохранению активности ключевых ферментов, связанных с мембранами клеток и часто теряющими свою активность после делипидизации. Вероятно, эти ферменты окружены в биомембранах полиненасыщенными липидами, а подобная термостабилизация обеспечивает высокую устойчивость вида T. nativa к длительному замораживанию. Отсутствие подобного механизма защиты у других видов трихинелл приводит к температурной инактивации мембранных энзимов при замораживании и последующем оттаивании, и, в конечном счете, к гибели паразита. Определенное значение в высокой резистентности к отрицательным температурам T. nativa несомненно имеет своеобразное строение кутикулы, более совершенная ферментативная адаптация к организму плотоядных животных и быстрая поведенческая реакция на воздействие холодом.
Динамику титров специфических антител в ИФР у экспериментально зараженных арктическими изолятами T. nativa лабораторных животных изучали в течение 150 сут. При исследовании сывороток крови от животных, зараженных изолятом трихинелл от росомахи, специфические антитела обнаруживали в минимальном диагностическом титре (1 : 20; 1 : 40) у мышей 3-го и последующих пассажей, причем преимущественно к 60-90-м суткам инвазии. У животных 4 и 5-го пассажей наблюдали рост специфических антител в диагностическом титре с 30-х суток инвазии, достигая максимума (титры 1 : 80; 1 : 160) к 90-120-м суткам инвазии. По-видимому, это связано с чрезвычайно низким потенциалом воспроизводства, и, следовательно, малой интенсивностью инвазии в мышцах ввиду слабой адаптации к лабораторным грызунам данного изолята трихинелл. ИФА сывороток крови от лабораторных грызунов, использованных для пассирования изолята трихинелл от белого медведя, показал следующие результаты. Специфические антитела в минимальном диагностическом титре (1 : 40) выявляли на 30-е сутки инвазии у крыс и мышей, достигали они максимума к 90-м (ОП= 0,995-1,117) суткам, и сохранялись в кровотоке на высоком уровне, вплоть до окончания эксперимента (120-150 сут) в титрах 1 : 320, 1 : 640.
Сравнительный анализ спектра протеолитической активности инвазионных личинок арктических изолятов трихинелл показал их некоторые различия и сходства. При проведении исследований строго соблюдали однофак-торность эксперимента: трихинеллы, выделенные из мышечной ткани белого медведя и росомахи, принадлежали к одному и тому же виду T. nativa; прошли 4 пассажа на лабораторных грызунах, доза заражения в обоих случаях составила 10лич./г массы тела, возраст мышечных личинок, используемых для получения экскреторно-секреторных продуктов - 90 сут, сроки инкубирования (24 ч) и плотность трихинелл в ИПС ДМЕМ (10 тыс. лич./мл) также были одинаковыми. Для исследований использовали экскреторносекреторные продукты трихинелл и экстракт гомогената личинок, при расче-
41
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
те удельной активности протеолитических ферментов учитывали суммарное содержание белка в препарате. Результаты представлены в таблице.
Таблица
Субстратная специфичность экскреторно-секреторных протеинов арктических изолятов T. nativa
Субстрат Фермент Удельная активность х10-6
белый медведь росомаха
AlapNA Аминопептидаза 0,2 39,2
ArgpNA Аминопептидаза 7,9 40,7
LeupNA Аминопептидаза 1,3 0
ValpNA Аминопептидаза 1,2 18,9
PropNA аминопептидаза 11,7 24,0
AcPhepNA Химотрипсин 1,7 0
GlpPhepNA Химотрипсин 5,1 118,4
BzArgpNA Трипсин 27,0 0
ZPheArgpNA Трипсин 0,2 29,1
ZGlupNA Глутаминэндопептидаза 1,1 0
GlpPheAlapNA Папаин 0 0
ZAlaPheArgpNA Катепсин 7,6 43,6
ZGlyGlyPropNA Пролилэндопептидаза 11,8 25,4
ZAlaAlaPropNA Пролилэндопептидаза 9,6 25,4
ZAlaAlaLeupNA Субтилизин 11,5 30,5
GlpAlaAlaLeupNA Субтилизин, коллагеназа 14,1 83,6
Приведенные в таблице данные показывают, что в целом спектр гидролизуемых протеолитическими ферментами обоих изолятов T. nativa субстратов достаточно близок. Однако, экскреторно-секреторные продукты трихинелл изолята от росомахи содержат протеиназы, гидролизующие субстраты аланинаминопептидазы, валинаминопептидазы и трипсина (ZPheArgpNA), тогда как ферменты, выделенные из личинок трихинелл другого изолята (от белого медведя) способности к гидролизу этих субстратов не показали. Напротив, другой субстрат трипсина (BzArgpNA) гидролизуется только протеазами трихинелл от белого медведя, но не гидролизуется таковыми от росомахи. Интерес представляет также принципиальное отличие в способности гидролизовать различные субстраты химотрипсина. Так, на субстрат Ac-PhepNA исследуемые экскреторно-секреторные протеины не действуют, а субстрат GlpPhepNA гидролизуют, хотя и в различной степени. Активность протеолитических ферментов у личинок изолята трихинелл от росомахи по этому субстрату в 24 раза выше, чем у изолята от белого медведя. Принципиальное сходство спектра протеолитических ферментов обоих изолятов трихинелл обусловлено принадлежностью к одному генотипу - T. nativa. Различие в количестве протеаз в экскреторно-секреторных продуктах, по-видимому, связано с различной степенью адаптации исследуемых изолятов трихинелл к неспецифическим хозяевам (лабораторным грызунам).
Трихинеллы, имея достаточно примитивное строение, обладают уникальной способностью приспосабливать собственный обмен веществ на биохимическом уровне к обмену таких сложных организмов, какими являются их хозяева. Во многом степень адаптации гельминта к хозяину выражается в приспособленности к определенной группе питательных субстратов, интенсивности обмена хозяина и его гомеостазу, во взаимодействии на уровне клеточных систем, включая ферментативные и элементарные химические процессы. Одной из форм ферментативной адаптации к различным факторам
42
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
среды является регулируемое изменение скорости образования и концентраций ферментов в соответствии с потребляемыми субстратами пищи. Во многом процесс биохимической адаптации тканевого гельминта к паразитированию зависит от структуры питания хозяина и метаболизма белков в его организме. Известно, что трихинеллы преимущественно потребляют белки, предварительно подвергнутые денатурации в пищеварительной системе хозяина и фактически превращенные в продукты гидролитического расщепления протеинов - аминокислоты, что свидетельствует о совершенной биохимической адаптации к среде обитания этих тканевых гельминтов. Рацион животного-хозяина трихинелл, богатый белками высокой биологической ценности (имеющий в составе незаменимые аминокислоты), способствует индуцируемому биосинтезу белков и различных ферментов у гельминта. От рациона хозяина зависит степень ферментативной адаптации трихинелл, изменение скорости образования и концентрации ферментов и других необходимых веществ, так как все биохимические процессы в организме гельминта зависят от поступающих пищевых субстратов. По-видимому, именно наличие оптимальных для трихинелл питательных веществ в организме плотоядных животных, корреляции химического состава биологических жидкостей и тканей гельминта и хозяина, высокая степень взаимной ферментативной адаптации на уровне клеточных систем обеспечивают длительное выживание всех видов трихинелл в организме хищников. Накопленный трихинеллами запас питательных веществ за длительный период существования в организме специфического хозяина в дальнейшем обеспечивает повышенную устойчивость трихинелл к неблагоприятным условиям внешней среды после гибели хозяина, что показали эксперименты по определению резистентности к низким температурам.
Доказано, что важным критерием степени адаптации личинок трихинелл к организму хозяина является процесс капсулообразования [2, 3, 8, 13]. При инвазии мышечные клетки хозяина базофильно изменяются и трансформируются в питательную клетку. Важнейшей структурой капсулы является коллаген, образующийся под действием экскреторно-секреторных продуктов стихоцитов трихинелл. Фибробласты мышечных волокон, инвазированных личинками трихинелл, через 7-8 сут после заражения начинают вырабатывать значительное количество коллагена IV и VI типов. При высокой степени взаимной адаптации паразита и хозяина формирование капсулы заканчивается к 18-20-м суткам, при этом тканевая реакция затрагивала только миоцит, в котором была локализована личинка. Данный процесс наблюдали при пассажах на лабораторных грызунах T. nativa, первоначально выделенных из мышц белого медведя. В случае попадания личинок трихинелл в организм неадаптированного хозяина локальные изменения в мышечной ткани развиваются вокруг капсулы и, особенно сильно, по ее полюсам, формирование полноценной капсулы существенно задерживается или вовсе не происходит. Данное явление зарегистрировано при пассировании на лабораторных грызунах арктического изолята T. nativa, выделенного из мышц росомахи. Полученные данные сопоставимы с исследованиями других авторов [1-3]. Затухание воспалительных и морфологических реакций в мышцах хозяина при трихинеллезе к моменту завершения формирования капсулы свидетельствуют о том, что процесс капсулообразования является благоприятным для обоих членов системы паразит-хозяин, которая возникла в результате их длительной взаимной адаптации [1]. Капсулообразование вокруг личинок трихинелл целиком и полностью зависит от гостальной специфичности личинки, причем форма и величина капсулы различаются не только у разных видов трихинелл, но и у генетически однородных видов, выделенных из географически удаленных популяций [2, 3]. Доказательства этому мы также получили в ходе исследований биологических свойств вышеуказанных арктических изолятов трихинелл.
43
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
По-видимому, в процессах биохимической адаптации к организму хозяина и капсулообразования ключевую роль играют протеолитические ферменты, обеспечивающие обмен веществ у всех живых организмов. В ходе исследований субстратной специфичности протеаз из экскреторно-секреторных продуктов трихинелл двух арктических изолятов T. nativa было зарегистрировано существенное увеличение удельной активности вышеуказанных ферментов у гельминтов, первоначально выделенных из мышц росомахи. При пассажах на белых беспородных крысах и мышах этот изолят трихинелл характеризовался низким потенциалом воспроизводства, слабой иммуногенно-стью по отношению к гуморальной иммунной системе хозяина, затрудненным капсулообразованием вокруг личинок трихинелл и локальными изменениями мышечной ткани хозяина. Слабая адаптация вышеуказанных тканевых гельминтов к лабораторным крысам и мышам активизирует синтез ими протеолитических ферментов (химотрипсина, аминопептидаз, катепсина, субти-лизина и коллагеназы), что было показано в ходе эксперимента. Иммуноген-ность по отношению к трихинеллам наиболее полно проявляется у тех животных, к которым адаптирован тот или иной изолят трихинелл. Высокий уровень протеолитических ферментов у трихинелл, попавших в новую для них среду обитания, обеспечивает мощное иммуносупрессивное действие гельминтов на организм неспецифического хозяина, что подтверждается зарегистрированными в ходе эксперимента низкими титрами специфических антител в ИФА. Наиболее совершенная адаптация изолята трихинелл, первоначально выделенных из мышц белого медведя, к организму белых беспородных крыс и мышей, благоприятствует формированию иммунитета высокой напряженности, что подтверждается результатами исследований.
Таким образом, анализ фенотипической изменчивости арктических трихинелл, принадлежащих к виду T. nativa, но выделенных из мышц плотоядных животных разных видов (белого медведя и росомахи), обитающих в географически удаленных биоценозах и существующих за счет своеобразных трофических связей, показал значительные различия исследуемых изолятов в степени адаптации к лабораторным грызунам, проявляющиеся в интенсивности заселения мышц подопытных животных личинками трихинелл, потенциале воспроизводства гельминтов, их устойчивости к замораживанию, реакции организма хозяина на процесс капсулообразования трихинелл, количестве протеолитических ферментов. Функциональная роль протеиназ включает целый ряд процессов - от гидролиза макромолекулярных субстратов до поддержания патогенеза инвазии. Одним из главных и наиболее древних в эволюционном отношении механизмов регуляции активности протеиназ является взаимодействие с их ингибиторами. Изучение протеиназ гельминтов, а также их ингибиторов в организме хозяина, имеет исключительно важное значение для выяснения роли вышеуказанных ферментов в развитии парази-то-хозяинных отношений, создании эффективных биологических и фармакологических препаратов, прогнозировании клинических проявлений инвазионного процесса.
Скрининг препаратов возможен лишь при наличии удобной модели три-хинеллезной инвазии с использованием лабораторных грызунов. Полученные данные могут быть использованы при выборе экспериментальной модели природного трихинеллеза.
Литература
1. Бекеш О.-Я.Л. Биохимические аспекты адаптации паразита и хозяина при трихинеллезе: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 1973.
2. Березанцев Ю.А. Трихинеллез. - Л.: «Медицина», 1974. - 160 с.
3. Бритов В.А. Возбудители трихинеллеза. - М.: Наука. - 1982. - 272 с.
44
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
4. Рипатти П.О., Бритов В.А. // Матер. докл. к 4-й Всес. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. - Ереван, 1985. - С. 34-36.
5. Пенькова Р.А., Владимирова П.А., Халина Р.Р. // Матер. докл. к 4-й Всес. конф.по пробл. трихинеллеза человека и животных. - Ереван, 1985. - С. 32-34.
6. Barbara G., De Giorgio R., Stanghellini V. et al. // Intern. J. of Gastroenterology and Hepatology. - 2003. - V. 52, N 10. - Р. 1457-1464.
7. Cwiklinski K., Meskill D., Robinson M.W. et al. // Vet. Parasitol. - 2009. -V. 159, N 3-4. - Р. 268-271.
8. Kapel C.M. // Vet. Parasitol. - 2000. - V. 93. - P. 263-278.
9. Kumar V., Pozio E. // Ann. de la Soc. Belge de Med. Trop. - 1990. - V. 70. -P.131-135.
10. Lun H.M., Mak C.H., Ko R.C. // Parasitol. Res. - 2003. - V. 90, N 1. - Р. 27 -37.
11. Mak C.H., Ko R.C. // Parasitology. - 2001. - V. 123. - P. 301-308.
12. Malakauskas A., Kapel C.M. // J. of Parasitol. - 2003. - V. 89. - P. 744748.
13. Nagano I., Wu Z., Nakada T. et al. // Parasitology. - 2001. - V. 123, Pt 1.
- Р.77-83.
14. Odoevskaya I.M., Kurnosova O.P., Movsessyan S.O., Bankov I. // Exp. Pathology and Parasitology. - 2007. - V. 10, N 1. - C. 43-50.
15. Odoevskaya I., Novik T., Kurnosova O. et al. // Comptes rendus de I’ Academie bulgare des Sciences. - 2008. - V. 61, N 4. - C. 469-474.
16. Odoevskaya I., Kurnosova O., Movsesyan S. et al. // Comptes rendus de I’ Academie bulgare des Sciences. - 2008. - V. 61, N 10. - C. 1285-1292.
17. Pozio E., La Rosa G., Rossi P., Murrell K.D. // J. of Parasitology. - 1992.
- V. 78. - P. 647-653.
18. Robinson M.W., Massie D.H., Connolly B. // Mol. Biochem. Parasitol. -2007. - V. 151, N 1. - P. 9-17.
19. Romaris F., North S.J., Gagliardo L.F. et al. // Mol. Biochem. Parasitol. -2002. - V. 122, N 2. - P. 149-60.
20. Shaikenov B. // Wiad. Parazytol. - 1992. - V. 38. - P. 85-91.
21. Todorova V.K., Stoyanov D.I. // Parasitol. Res. - 2000. - V. 86, N 8. - P. 684-687.
22. Trap C., Fu B., Le Guerhier F. et al. // Parasitol. Res. - 2006. - V. 98, N
4. - Р.288-294.
Features of relations parasite-host at experimental infection of laboratory rodents by arctic isolate Trichinella nativa
I.M. Odoevskaja, A.V. Hrustalev, A.V. Klinkov, J.A. Rudenskaja,
I.J. Filippova, A.D. Reshetnikov
Biological properties of arctic isolates Trichinella nativa allocated of muscles of polar bear and glutton lived in different zoogeographical biocenosis of Yakutia are investigated. Adaptive reactions, immunifacient properties and strain distinctions of T. nativa are investigated at passaging on laboratory rodents. The comparative analysis of productivity passaging and screening of proteolytic properties in relation to 16 synthetic substrata researched arctic isolates of T. nativa is carried. It is shown that at freezing at - 18 °C larva taking place in muscles of polar bear and glutton during 26 months, the significant part of helminths has remained viable. In muscles of white rats resistance of T. nativa to freezing is sharply reduced, by 5 day keep viability less than 10 % of parasites, by 7 day all личинки perish. Resistance of T. nativa to sharp downturn of temperature is genetically caused attribute which depends on degree of adaptation to concrete organism of the animal-host. Keywords: Trichinella nativa, white rats, adaptation, resistance.
45
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
