CC BY
71
2011
Известия ТИНРО
Том 165
УДК 591.111.2:595.384.8+639.28
С.И. Моисеев1, С.В. Горянина1, С.А. Моисеева2 *
1 Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, 107140, г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, 17;
2 Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3
СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕМОЦИАНИНА В ГЕМОЛИМФЕ КАМЧАТСКОГО КРАБА (PARALITHODES CAMTSCHATICUS) ИЗ БАРЕНЦЕВА И ОХОТСКОГО МОРЕЙ
Исследованы изменения концентрации и структуры дыхательного белка — гемоцианина — в гемолимфе камчатского краба из Баренцева и Охотского морей в течение межлиночного периода. Проанализирована взаимосвязь между концентрацией гемоцианина в крови Paralithodes camtschaticus и уровнем наполнения конечностей мышечной тканью. Для камчатского краба из прибрежных районов Баренцева моря на примере Варангер-фиорда показано, что в первой половине осени у постлиночных особей наряду с плохим наполнением конечностей мышечной тканью наблюдается низкое содержание гемоцианина в гемолимфе, а также изменения молекулярной структуры данного белка. Результаты исследований свидетельствуют об особенностях условий существования камчатского краба в прибрежных зонах Баренцева моря по сравнению с его открытой частью, а также по сравнению с условиями существования P. camtschaticus в Охотском море.
Ключевые слова: камчатский краб, гемоцианин, молекулярная структура, наполнение конечностей мышечной тканью, Баренцево море, Охотское море.
Moiseev S.I., Goryanina S.V., Moiseeva S.A. Comparative study of hemocy-anin structure and concentration in the hemolymph of red king crab Paralithodes camtschaticus in the Barents Sea and the Okhotsk Sea // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 165. — P. 216-230.
Features of red king crab life cycle should be accounted for its fishery organizing in the areas of introduction. These features in environments of the Barents Sea are significantly other than in the areas of its natural habitat in the Far-Eastern Seas. The species got adaptive changes in behaviour and physiology for its successful acclimatization in the new habitats. Modulation of hemolymph gas transport function is one of well-known mechanisms of physiological adaptation for crustaceans. Hemocyanin is an extracellular copper-containing protein, the major one servicing the function of oxygen transport. Its concentration in the hemolymph of crustaceans, including crabs, as well as its structure and functional properties vary depending on their habitat. Therefore, the data on the hemocyanin biochemistry could be useful to assess biological status for different populations of crabs. Specific changes in structure and/or
* Моисеев Сергей Иванович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, e-mail: moiseev@vniro.ru; Горянина Светлана Васильевна, ведущий инженер, e-mail: goryanina@vniro.ru; Моисеева Светлана Анатольевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, e-mail: svmois.icb@rambler.ru.
concentration of hemocyanin in hemolymph of red king crab Paralithodes camtschaticus caused by environmental influence are investigated by SDS-PAGE and dissociating but non-denaturing PAGE in EDTA, with comparing the structure and concentration of hemocyanin in hemolymph of crabs from the Barents and Okhotsk Seas during their molt cycle. The concentration of hemocyanin in blood of crabs has statistically significant correlation with their limbs filling with muscular tissue. The hemocyanin quaternary structure does not depend on the intermolt stage, filling the limbs, or concentration of hemocyanin in hemolymph for the crabs from the Okhotsk Sea and open waters of the Barents Sea. However, the crabs from coastal areas of the Barents Sea (samples from the Varanger Fjord) are distinguished by low concentration of hemocyanin in hemolymph and modified molecular structure of this protein for post-molt animals (in early autumn), as well as lowered filling of their limbs. Obviously, the environments of red king crab habitat in this area in this season differ from those ones in the open Barents Sea and in the Far-Eastern Seas.
Key words: red king crab, hemocyanin, molecular structure, crab limb filling, Barents Sea, Okhotsk Sea.
Введение
В Баренцево море в период с 1961 по 1969 г. из зал. Петра Великого Японского моря был вселен камчатский краб Paralithodes camtschaticus Tilesius, 1815. К началу 1990-х гг. в Баренцевом море акклиматизированный краб образовал самовоспроизводящуюся популяцию, которая является одним из наиболее удачных примеров трансокеанических переселений промысловых видов ракообразных. В настоящее время баренцевоморская популяция представляет собой большую экономическую ценность. При организации промысла камчатского краба в Баренцевом море необходимо учитывать особенности жизненного цикла данного вида в условиях среды, значительно отличающихся от условий его обитания в морях Дальнего Востока. Успешной акклимации камчатского краба в новых местах обитания способствуют адаптивные изменения в его поведении и физиологии (Камчатский краб ..., 2003). Данные изменения неизбежно должны приводить к изменениям биохимических параметров крови (гемолимфы) краба, поскольку именно через кровь осуществляется взаимосвязь многочисленных метаболических процессов, протекающих в организме животных.
Основным белком гемолимфы у ракообразных является внеклеточный медьсодержащий белок — гемоцианин, выполняющий функцию переноса кислорода (Truchot, 1992; van Holde, Miller, 1995). Гемоцианин — функционально пластичный белок. Его концентрация в гемолимфе ракообразных, в том числе и крабов, а также структура и функциональные свойства изменяются в зависимости от условий существования животных (Engel et al., 2001; Mattiello et al., 2004). Поэтому данные по биохимии гемоцианина могут быть полезными при оценке биологического состояния популяций различных промысловых видов крабов.
Нами были проведены сравнительные исследования структуры и концентрации гемоцианина в гемолимфе камчатского краба из Баренцева и Охотского морей с целью выявить специфические различия данных параметров у крабов из разных популяций. Исследования проводились на промысловых самцах, которые подвергались стандартному биологическому анализу. Наблюдаемые модификации структуры гемоцианина и вариации его концентрации рассматривались в соответствии с межлиночной стадией краба и наполнением конечностей мышечной тканью. Вариации биохимических параметров гемолимфы могут трактоваться как адаптивный ответ на воздействие факторов окружающей среды при наличии однозначной связи между наблюдаемыми изменениями и биологическим состоянием животных. По нашим данным, вариации структуры гемоцианина наблюдались только у крабов баренцевоморской популяции из района Варангер-фиорда, что позволяет говорить об отличительных особенностях существования камчатского краба в этом регионе.
Материалы и методы
Сбор данных по биологическому состоянию Р. camtschaticus в Баренцевом море проводился с 2001 по 2009 г., отбор проб гемолимфы — в 2004-2006 гг. и 2008-2009 гг. (рис. 1, табл. 1). В районе Охотского моря (на шельфе западной Камчатки и за пределами 12-мильной зоны зал. Бабушкина) сбор биологических данных и отбор проб гемолимфы проводился в 2006 и в 2008 гг. (рис. 2, табл. 2). Пойманные крабы подвергались стандартному биологическому анализу, принятому в отечественной гидробиологии (Руководство ..., 1979; Иванов, 2001; Лысенко, 2001; Моисеев, 2003; Промысловые беспозвоночные ..., 2003), затем у них отбирались пробы гемолимфы (Павлов, 2003), которые обрабатывались в лабораторных условиях по методике, описанной ранее (Моисеев, Моисеева, 2006а; Моисеева, Моисеев, 2008а).
Рис. 1. Карта-схема районов сбора материалов в Баренцевом море: I — прибрежная зона территориальных вод России; II — исключительная экономическая зона России
Fig. 1. Scheme of samples collection in the Barents Sea: I — coastal zone (territorial waters of Russia); II — open waters (exclusive economic zone of Russia)
Таблица 1
Районы и периоды сбора проб гемолимфы у промысловых самцов камчатского краба
баренцевоморской популяции
Table 1
Areas and dates of hemolymph probes collecting from the red king crab males of commercial size in the Barents Sea
Район исследований Год Период
Варангер-фиорд 2004 Октябрь-декабрь
Варангер-фиорд 2005 Ноябрь-декабрь
ИЭЗ, восточная часть 2006 Февраль
Прибрежная зона, восточный Мурман 2006 Февраль
Варангер-фиорд 2008 Май
Варангер-фиорд 2009 Май
Рис. 2. Карта-схема районов сбора материалов в Охотском море: I — исключительная экономическая зона России (траверз зал. Бабушкина); II — исключительная экономическая зона России — шельф западной Камчатки
Fig. 2. Scheme of samples collection in the Okhotsk Sea: I — the area at the Babush-kin Bay; II — shelf of the West Kamchatka
Таблица 2
Районы и периоды сбора проб гемолимфы у промысловых самцов камчатского краба
западнокамчатской популяции
Table 2
Areas and dates of hemolymph probes collecting from the red king crab males of commercial size at West Kamchatka
Район исследований Год Период
ИЭЗ, зал. Бабушкина (Магаданская область) 2006 Июнь-июль
Камчатско-Курильская подзона (ИЭЗ) 2006 Ноябрь
Западно-Камчатская подзона (ИЭЗ) 2006 Ноябрь-декабрь
Камчатско-Курильская подзона (ИЭЗ) 2008 Сентябрь-октябрь
Западно-Камчатская подзона (ИЭЗ) 2008 Сентябрь-октябрь
ИЭЗ, зал. Бабушкина (Магаданская область) 2008 Ноябрь
Исследования биохимических свойств гемолимфы проводились на самцах камчатского краба промыслового размера. Взятые из сердца образцы гемолимфы замораживались и хранились при минус 20 °С. Перед использованием образцы размораживались на льду. Кровяные сгустки, образовавшиеся при свертывании гемолимфы, гомогенизировались с помощью тканевого гомогенизатора. Затем в течение 15 минут образцы центрифугировались при 15000 оборотах в минуту и при температуре 4 °С. В полученном супернатанте основную массу белка составлял гемоцианин. Аликвота сыворотки гемолимфы разводилась в соотношении 1 : 39 буфером следующего состава: 0,05 моль/л трис-НС1 (трис-гидрокси-метил-аминометан), 0,01 моль/л ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и рН 8,9. При разведении происходит диссоциация нативных олигомеров гемоци-
анина на мономеры, что устраняет эффект светорассеяния, производимого крупными олигомерами гемоцианина.
Концентрация гемоцианина определялась спектрофотометрически на полосе 336 нм (DeFur et al., 1990) с использованием коэффициента экстинкции для нативного полностью оксигенированного гемоцианина P. camtschaticus в мономерной форме (Molon et al., 2000).
Элетрофоретическое разделение проб сыворотки с гемоцианином осуществлялось по методу Лэммли (Laemmli, 1970) на оборудовании фирмы Helicon. Разделение образцов сыворотки (~ 10 мкг гемоцианина) производилось в 10 %-ном полиакриламидном геле (4 %-ный концентрирующий гель) при температуре 4 °С и постоянном токе 20 миллиампер (мА). В качестве маркеров молекулярной массы использовались белки фирмы Fermentas: ß-галактозидаза бактерии Escherichia coli — 116,0 килодальтон (кДа), бычий сывороточный альбумин — 66,2 кДа, овальбумин — 45,0 кДа и лактат-дегидрогеназа из мышц свиньи — 35,0 кДа. При проведении неденатурирующего диссоциирующего электрофореза образцы сыворотки с гемоцианином предварительно диализовались в течение суток против 0,05 моль/л трис-HCl, 0,01 моль/л ЭДТА, рН 8,9 с трехкратной сменой буфера при 4 оС. Электрофоретическое разделение образцов гемолимфы производилось в 12 %-ном полиакриламидном геле в буфере того же состава при постоянном токе 15 мА при 4 оС. Окраска гелей производилась 0,05 %-ным реактивом Кумасси (Бриллиантовый голубой) R-250 фирмы Sigma.
Статистическая обработка материала проводилась по общепринятым методикам (Лакин, 1980). Степень сопряженности между признаками измерялась с помощью коэффициента корреляции рангов по Спирмену.
Результаты и их обсуждение
По материалам ловушечных съемок камчатского краба в Баренцевом и Охотском морях были изучены изменения концентрации и структуры гемоцианина в гемолимфе промысловых самцов в течение межлиночного периода. Районы исследований камчатского краба и сбора биохимических проб представлены на рис. 1, 2 и в табл. 1, 2. Нами было показано, что биохимический показатель — концентрация гемоцианина — в гемолимфе P. camtschaticus тесно связан с наиболее важным технологическим показателем — уровнем наполнения конечностей краба мышечной тканью. Уровень наполнения конечностей мышечной тканью у крабов закономерно изменяется в течение линочного цикла (Слизкин, Сафронов, 2000). Такой же циклический характер носят изменения концентрации гемоцианина в гемолимфе самцов P. camtschaticus в период между линьками (Моисеев, Моисеева, 2006а, б; Моисеева, Моисеев, 2008а, б, 2009; Моисеев и др., 2009; Moiseev et al., 2009; Moiseeva, Moiseev, 2009). В предлиночный период уровень гемоцианина в крови камчатского краба резко снижается. После линьки концентрация гемоцианина в гемолимфе P. camtschaticus постепенно возрастает, достигая максимальных значений в третьей поздней (III-2) межли-ночной стадии (Моисеев, Моисеева, 2006б; Моисеева, Моисеев, 2008а).
Для всех указанных сезонов и районов наших исследований (табл. 1, 2) на большом экспериментальном материале методами статистического анализа была установлена значительная статистически достоверная корреляционная взаимосвязь между концентрацией гемоцианина в крови P. camtschaticus и уровнем наполнения конечностей мышечной тканью в течение межлиночного цикла (табл. 3, 4). Степень сопряженности между двумя признаками измерялась с помощью коэффициента корреляции рангов по Спирмену — rs (Лакин, 1980). Эмпирический коэффициент rs для данных различных лет составил от 0,53 до 0,74.
Многолетние наблюдения, проведенные лабораторией промысловых беспозвоночных и лабораторией прибрежных исследований ВНИРО с 2001 по 2009 г.,
Таблица 3
Уровень наполнения конечностей мышечной тканью и концентрация гемоцианина в гемолимфе у промысловых самцов камчатского краба
в Баренцевом море в межлиночный период (m ± SE)
Table 3
Filling of the limbs with muscular tissue and hemocyanin concentration in hemolymph of the red king crab males of commercial size
from the Barents Sea in their molt cycle (m ± SE)
Район, год Период II Наполнение, Межлиночная стадия III-0 III-1 Не, Наполнение, Не, Наполнение, Не, III-2 Наполнение, Не,
/0 мг/мл % мг/мл % мг/мл /0 мг/мл
Варангер-фиорд, 2004 г. X-XI XII 28 + 3 2,1 +0,6 53 + 2 5,1 + 1,8 65 + 5 60 7,9+ 1,8 75 + 7 4,5 + 2,2 11,8 + 2,1 80+2 83 + 5 14,7 ± 1,6 12,4 + 0,7
ИЭЗ, восточная часть, 2006 г. II 22+ 1 2,3 + 1,0 49 + 1 4,7+ 1,7 73 + 2 10,8 + 0,7 83+ 1 13,1+0,6
Примечание. Здесь и далее Не . — гемоцианин
Таблица 4 Уровень наполнения конечностей мышечной тканью и концентрация гемоцианина в гемолимфе у промысловых самцов камчатского краба в Охотском море в межлиночный период (m ± SE) Table 4 Filling of the limbs with muscular tissue and hemocyanin concentration in hemolymph of the red king crab males of commercial size from the Okhotsk Sea in their molt cycle (m ± SE)
Район, год Период II Наполнение, Межлиночная стадия III-0 III-1 Не, Наполнение, Не, Наполнение, Не, III-2 Наполнение, Не,
/0 мг/мл % мг/мл % мг/мл /0 мг/мл
ИЭЗ, зал. Бабушкина (Магаданская область), 2006 г. VI-VII 33 + 4 2,0+ 1,0 59 + 4 6,5 + 0,7 78 + 4 8,6+ 1,3 91 + 3 15,0+2,7
Шельф западной Камчатки, 2006 г. XI 25 + 5 1,3 + 0,4 80 + 2 10,9+ 1,0 95+ 1 13,2 + 2,5
Шельф западной Камчатки, 2008 г. IX-X 86 + 3 11,9 + 0,7 96 + 3 13,5 + 0,7
показали, что в прибрежных районах Баренцева моря в первой половине осени в улове наблюдается большая доля Р. camtschaticus, которые по внешним признакам подлежат промысловому изъятию, но имеют недостаточное наполнение конечностей мышечной массой (Моисеев и др., 2005; Тальберг, 2005; Pereladov е! а1., 2009).
На рис. 3 показан средний уровень наполнения конечностей мышечной тканью в осенне-зимний период у коммерческого краба в прибрежной зоне Баренцева моря и в его открытой части по сравнению с уровнем наполнения конечностей у краба западнокамчатского шельфа. Как видно на рис. 3, достижение хорошего наполнения у краба в прибрежной зоне Баренцева моря запаздывает по сравнению с крабом западнокамчатской популяции на 1,0-1,5 мес. В открытой части Баренцева моря это запаздывание не столь значительно. Можно заключить, что прибрежная зона Баренцева моря по условиям существования для камчатского краба имеет более значительные отличия от районов обитания данного вида в северо-восточной части Охотского моря.
Рис. 3. Средний уровень наполнения конечностей мышечной тканью у промысловых самцов камчатского краба в Баренцевом и Охотском морях: 1 — прибрежная зона Баренцева моря; 2 — открытая часть Баренцева моря (ИЭЗ России); 3 — шельф западной Камчатки (ИЭЗ России)
Fig. 3. Average filling of the limbs with muscular tissue for the red king crab males of commercial size in the Barents and Okhotsk Seas: 1 — coastal zone of the Barents Sea; 2 — open waters of the Barents Sea; 3 — shelf of West Kamchatka
Для крабов из прибрежных районов Баренцева моря на примере Варангер-фиорда было показано, что в первой половине осени наряду с плохим наполнением конечностей мышечной тканью у них наблюдается низкое содержание гемоциани-на в гемолимфе, а также изменения молекулярной структуры данного белка.
Субъединичная структура гемоцианина P. camtschaticus исследовалась нами методом электорофореза в полиакриламидных гелях. Методом денатурирующего электрофореза по Лэммли с додецилсульфатом натрия было показано, что молекула гемоцианина камчатского краба состоит из 4 компонентов (рис. 4). Молекулярная масса основного компонента составляла 79 кДа, трех минорных компонентов — 92, 74 и 71 кДа, что соответствует и литературным данным (Molon et al., 2000). Такая структура гемоцианина наблюдалась как у P. camtschaticus из
Охотского моря, так и у крабов из Баренцева моря (см. табл. 1 всего межлиночного цикла (рис. 4, 5 и 6).
Рис. 4. SDS-электрофорез по Лэммли гемоцианина P. camtscha-ticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — ИЭЗ России в Баренцевом море, февраль 2006 г. Относительные молекулярные массы компонентов оценивались с помощью маркеров молекулярного веса фирмы Fermentas: II—IV — стадии межлиночного цикла, 1-4 — субъединицы гемоцианина
Fig. 4. SDS-PAGE profiles of hemocyanin from red king crabs sampled in the open waters of the Barents Sea in February, 2006 at different stages of their molt cycle (II—IV). Relative molecular weights of components are estimated using Fermentas LMW protein markers: 1-4 — subunits of hemocyanin
2)
в течение
LMW KDa
116.0
66.2
II 45.0 lll-O 111-1
35.0
Рис. 5. SDS-электрофорез по Лэммли гемоцианина P. camtschaticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — Охотскоe море (траверз зал. Бабушкина, ИЭЗ России), июнь-июль 2006 г. Обозначения как на рис. 4
Fig. 5. SDS-PAGE profiles of hemocyanin from red king crabs sampled in the open waters of the Okhotsk Sea (at the Babushkin Bay) in June-July, 2006 at different stages of their molt cycle (II—IV). Relative molecular weights of components are estimated using Fermentas LMW protein markers. Symbols as in fig. 4
Отличия в структуре данного белка были отмечены только у крабов, пойманных в осенний период в районе Варангер-фиорда (рис. 7). Электрофоретичес-кое разделение проб с гемоцианином у крабов из Варангер-фиорда давало различные результаты в зависимости от стадии межлиночного цикла, концентрации гемоцианина в крови и времени сбора материала. В октябре-ноябре у камчатс-
IM-2
111-1 I!
Рис. 6. SDS-электрофорез по Лэммли гемоцианина P. camtschaticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — Охотское море (шельф западной Камчатки), ноябрь-декабрь 2006 г. Обозначения как на рис. 4
Fig. 6. SDS-PAGE profiles of hemocyanin from red king crabs sampled in the open waters of the Okhotsk Sea (on West Kamchatka shelf) in November-December, 2006 at different stages of their molt cycle (II—IV). Relative molecular weights of components are estimated using Fermentas LMW protein markers. Symbols as in fig. 4
Рис. 7. SDS-электрофорез по Лэммли гемоцианина P. camtschaticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — Баренцево море, Варангер-фиорд, октябрь-декабрь 2004 г.: II—IV — стадии межлиночного цикла; 1-4 — компоненты гемоцианина с молекулярными массами: 1 — 92 кДа; 2 — 79 кДа; 2* — 77 кДа; 3 — 74 кДа; 4 — 71 кДа
Fig. 7. SDS-PAGE profiles of hemocyanin from red king crabs sampled in the coastal area of the Barents Sea (Varanger Fjord) in October-December, 2004 at different stages of their molt cycle (II—IV). Relative molecular weights of components are estimated using Fermentas LMW protein markers: 1-4 — hemocyanin components with molecular weight: 1 — 92 kDa; 2 — 79 kDa; 2* — 77 kDa; 3 — 74 kDa; 4 — 71 kDa
ких крабов Варангер-фиорда, находящихся в ранних постлиночных стадиях — II и Ш-1 (третья промежуточная стадия), пробы с гемоцианином давали при элект-рофоретическом разделении только три полосы с молекулярными массами 74, 79 и 92 кДа. У крабов в Ш-0 (третьей ранней стадии) наблюдалась также дополнительная полоса с молекулярной массой 77 кДа (рис. 7). В декабре в Варангер-фиорде средняя концентрация гемоцианина в гемолимфе Р. camtschaticus в стадиях Ш-0 и Ш-1 значительно возрастала, соответственно увеличивалось наполнение конечностей мышечной тканью (см. табл. 3). В состав молекулы гемоцианина у крабов в стадиях Ш-0 и Ш-1 в декабре входили субъединицы с молекулярными массами 71, 74, 79 и 92 кДа (рис. 7). В стадиях Ш-2 (третья поздняя стадия) и IV электрофоретическое разделение проб с гемоцианином давало 4 полосы с молекулярными массами 71, 74, 79 и 92 кДа в течение всего осенне-зимнего периода. Следует отметить, что в IV (предлиночной) стадии гемоцианин состоял из 4 компонентов, несмотря на плохое наполнение предлиночного краба и низкую концентрацию гемоцианина в гемолимфе (менее 2 мг/мл).
Вариации субъединичного состава гемоцианина у Р. camtschaticus из района Варангер-фиорда в осенне-зимний период были также исследованы методом диссоциирующего неденатурирующего электрофореза (рис. 8). Для этого каждую пробу гемоцианина предварительно диализовали в течение суток против трис-НС1 буфера с высоким рН, содержащего 0,01 моль/л ЭДТА. В этих условиях молекула гемоцианина диссоциировала на отдельные субъединицы, которые сохраняли нативную конформацию и электростатический заряд. При разделении нативных субъединиц гемоцианина у камчатских крабов в стадиях II, Ш-0 и Ш-1 из Варангер-фиорда в октябре-ноябре на электрофореграмме наблюдалась только одна быстро мигрирующая полоса, а у крабов в стадиях Ш-2 и IV — еще три дополнительных медленно мигрирующих полосы. В декабре пробы гемоцианина у крабов, находящихся в различных стадиях межлиночного цикла, состояли из 4 компонентов.
Рис. 8. Неденатурирующий диссоциирующий электорофорез гемоцианина P. cam-tschaticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — Баренцево море, Варангер-фиорд, октябрь-декабрь 2004 г. Обозначения как на рис. 4
Fig. 8. Alkaline dissociation electrophoresis of of hemocyanin from red king crabs sampled in the coastal area of the Barents Sea (Varanger Fjord) in October-December, 2004 at different stages of their molt cycle (II—IV). Symbols as in fig. 4
Камчатский краб, переселенный из Тихого океана в Баренцево море, успешно адаптировался в новой среде обитания. Об этом свидетельствует стремитель-
ный рост численности популяции и расширение ареала обитания P. camtschaticus в Баренцевом море (Камчатский краб ..., 2003). Таким образом, адаптивные возможности данного вида оказались адекватными требованиям, предъявляемым новыми для него условиями существования. Одним из известных механизмов физиологической адаптации у ракообразных является модуляция газотранспортной функции гемолимфы. Основным белком гемолимфы ракообразных является гемоцианин, выполняющий функцию переноса кислорода к тканям. Известно, что нативные гемоцианины ракообразных являются мультимерными белками, состоящими из нескольких полипептидных цепей — структурных субъединиц. Субъединицы гемоцианинов различаются как по аминокислотному составу, так и по электростатическому заряду и молекулярной массе (Markl et al., 1979; Markl, Decker, 1992). Эта особенность, которая называется феноменом гетерогенности гемоцианинов ракообразных на субъединичном уровне, играет роль в модуляции кислородсвязывающих свойств молекулы. Субъединичный состав ге-моцианина у различных видов ракообразных варьирует в зависимости от сезона года, солености и температуры воды, концентрации растворенного в воде кислорода (Bellelli et al., 1988; Mangum, Rainer, 1988; Mangum, 1994). Данные изменения структуры белка носят приспособительный характер, позволяя гемоцианину эффективнее связывать и транспортировать кислород в различных условиях внешней среды, что необходимо для адаптации организма.
Ареал распространения камчатского краба в Баренцевом море занимает обширную площадь, поэтому условия обитания в разных его частях существенно различаются. Особо следует выделить районы заливов и фиордов, гидрологический режим в которых заметно отличается от условий открытой части Баренцева моря. В таких районах могут образовываться локальные скопления (стада) камчатского краба (Матюшкин, 2003а, б; Моисеев и др., 2005; Тальберг, 2005; Pereladov et al., 2009).
Исследованная нами молекулярная структура гемоцианина у P. camtschaticus из Баренцева и Охотского морей (см. рис. 1, 2, табл. 1, 2) в большинстве случаев соответствовала структуре, описанной в литературе для камчатского краба Японского моря из зал. Петра Великого (Molon et al., 2000). У камчатских крабов из Охотского моря и крабов из открытой части Баренцева моря структура молекулы гемоцианина не зависела от стадии линочного цикла, наполнения конечностей мышечной тканью и концентрации гемоцианина в гемолимфе. Модифицированная структура гемоцианина наблюдалась нами только у постлиночных крабов с плохим наполнением из района Варангер-фиорда в начале осени. Весной на акватории Варангер-фиорда гемоцианин у камчатских крабов имел обычную структуру (рис. 9).
Вариации структуры гемоцианина в зависимости от сезона были показаны для лобстеров Palinurus elephas (Bellelli et al., 1988), причем наблюдаемые изменения связывались с флюктуациями условий существования этих животных в течение года, так как P. elephas обитают на относительно небольших глубинах (менее 150 м). Предположительно на структуру гемоцианина P. elephas могут влиять сезонные изменения температуры воды и длины светового дня, а также наличие или отсутствие пищи. Bellelli с соавторами (1988) также были показаны значительные колебания концентрации гемоцианина в гемолимфе P. elephas в зависимости от сезона, но межлиночное состояние лобстеров они не оценивали. У лобстера Palinurus mauritanicus, родственного P. elephas, но обитающего на больших глубинах (до 400 м), сезонные изменения структуры гемоцианина обнаружены не были, что, по-видимому, связано с большей стабильностью условий среды его обитания. Однако при проведении опыта в аквариальных условиях, когда P. mauritanicus содержался при различных температурных режимах в разные сезоны года, у него также были обнаружены изменения структуры гемоциа-нина (Condo et al., 1991). Таким образом, адаптивные изменения структуры ге-
Рис. 9. SDS-электрофо-рез по Лэммли гемоцианина P. camtschaticus в разных стадиях межлиночного цикла. Район сбора проб гемолимфы — Баренцево море, Варангер-фи-орд, май 2009 г. Обозначения как на рис. 4
Fig. 9. SDS-PAGE profiles of hemocyanin from red king crabs sampled in the coastal area of the Barents Sea (Varanger Fjord) in May, 2009 at different stages of their molt cycle (II— IV). Relative molecular weights of components are estimated using Fermentas LMW protein markers. Symbols as in fig. 4
моцианина могут быть вызваны даже у тех видов ракообразных, у которых они не наблюдаются в естественных условиях. Возможно, что механизмы подстройки функциональных свойств гемоцианина к условиям среды путем изменения структуры молекулы являются универсальными для различных видов Crustacea.
Модификации структуры гемоцианина трактуются как долгосрочный адаптивный ответ ракообразных на изменение условий среды обитания (Mangum, Rainer, 1988; Truchot, 1992). Таким образом, наблюдаемые вариации структуры гемоцианина у камчатского краба осенью в Варангер-фиорде указывают на специфику условий существования P. camtschaticus в этом районе в этот период года. По нашему мнению, данная специфика имеет свое отражение и в замедлении темпов прироста мышечной ткани у крабов, обитающих в этом районе в осенний период, поскольку модификации структуры гемоцианина наблюдались только у постлиночных крабов с плохим наполнением. Наличие отличительных особенностей существования камчатского краба в районе Варангер-фиорда и в других заливах и бухтах фиордового типа показано и другими исследователями различными методами (Матюшкин, 2003а, б; Зеленина и др., 2008; Pereladov et al., 2009; Zelenina et al., 2009).
При организации промысла камчатского краба в Баренцевом море в основном используется устоявшаяся методология, разработанная при многолетних исследованиях P. camtschaticus в дальневосточных морях. Однако при этом не учитываются особенности жизненного цикла данного вида в Баренцевом море (Камчатский краб ..., 2003). Так, в дальневосточных морях после массовой линьки наилучшего наполнения камчатский краб, как правило, достигает к началу осени (Слизкин, Сафронов, 2000). В настоящее время в Баренцевом море промысел краба P. camtschaticus открывается также в сентябре. Но с самого начала открытия специализированного промысла в Баренцевом море в 2004 г. и все последующие годы наблюдалось плохое наполнение камчатского краба в начале осени (Борисов и др., 2003; Моисеев, 2003; Пинчуков, Беренбойм, 2003; Долгов, 2006; Моисеева, Моисеев, 2008а; Moiseev et al., 2009; устное сообщение С.В. Круглова). В связи с этим выход в море промысловых судов задерживался в ряде случаев до середины октября, а в начале массового изъятия большая доля
(до 30-40 %) пойманных крабов выбраковывалась из-за плохого наполнения конечностей. Технологическая кондиция у основной части Р. camtschaticus баренце-воморской популяции достигалась только в ноябре-декабре. Такая картина наблюдалась как в прибрежных областях, так и в открытой части Баренцева моря.
Начало осени является временем массовой миграции крабов из районов нагула в прибрежной зоне в открытую часть моря. На Дальнем Востоке, как правило, камчатский краб в этот период достигает хорошего наполнения конечностей мышечной тканью. Хорошему наполнению соответствует достаточно высокая концентрация гемоцианина, которая необходима для адекватного снабжения мышц кислородом во время активных перемещений крабов. В Баренцевом море в начале осени значительная часть популяции камчатского краба находится в ранних постлиночных стадиях (Пинчуков, Беренбойм, 2003), имеет недостаточную упитанность и низкую концентрацию гемоцианина в гемолимфе (Борисов и др., 2003; Моисеева, Моисеев, 2008а, б; Moiseev е! а1., 2009; Moiseeva, Moiseev, 2009). Такие крабы мигрируют из мест нагула в прибрежной зоне в открытую часть Баренцева моря, так как сигналом для этого, по-видимому, являются внешние стимулы, возможно, уменьшение продолжительности светового дня. Поэтому достижение камчатским крабом баренцевоморской популяции промысловой кондиции задерживается на продолжительное время, иногда до начала ноября.
Температурный, световой и трофический сигналы воздействуют на крабов одновременно. Совокупность их воздействия определяет картину миграций, ли-ночного процесса, роста и развития крабов, которую мы непосредственно наблюдаем в пространстве и времени. Однако вычленить воздействие каждого отдельного фактора на тот или иной жизненный процесс у крабов или определить, какой из этих факторов доминирует на разных этапах жизненного цикла, мы пока можем только умозрительно. Изучение изменений биохимических параметров гемолимфы крабов, отражающих адаптивные изменения физиологии и метаболизма при воздействии внешних факторов, может быть полезным при решении таких задач.
Заключение
Вариации структуры гемоцианина у камчатского краба из района Варангер-фиорда в осенне-зимний период свидетельствуют об особенностях условий существования Р. camtschaticus в этом районе. Поскольку изменения структуры гемо-цианина наблюдались только у постлиночных крабов с плохим наполнением, можно предположить наличие прямой или опосредованной взаимосвязи между данными изменениями и воздействием на крабов факторов внешней среды, вызывающих замедление темпов прироста мышечной ткани. Многолетние рыбохозяйственные исследования свидетельствуют о том, что в прибрежных районах Баренцева моря в первой половине осени в улове наблюдается большая доля Р. camtschaticus, которые по внешним признакам подлежат промысловому изъятию, но имеют недостаточное наполнение конечностей мышечной массой. В связи с этим представляет интерес установление факторов внешней среды, вызывающих характерные изменения структуры гемоцианина камчатского краба. Это помогло бы не только лучше понять особенности жизненного цикла камчатского краба как в Варангер-фиорде, так и в других местах его обитания, но и использовать биохимические показатели гемолимфы в прогностических целях и в конечном итоге более рационально распоряжаться промысловыми запасами данного вида.
Список литературы
Борисов В.В., Степаненко В.В., Толкачева В.Ф. Технология обработки камчатского краба Баренцева моря // Камчатский краб в Баренцевом море. — Мурманск : ПИНРО, 2003. — С. 299-311.
Долгов С.В. Зависимость между межлиночной категорией панциря и наполнением конечностей мышечной тканью у камчатского краба баренцевоморской популяции // Мат-лы 7-й Всерос. конф. по промысловым беспозвоночным (памяти Б.Г. Иванова). — М. : ВНИРО, 2006. — С. 65-67.
Зеленина Д.А., Мюге Н.С., Волков А.А., Соколов В.И. Камчатский краб (Paralithodes camtschaticus) в Баренцевом море: сравнительное исследование интроду-цированных и нативных популяций // Генетика. — 2008. — Т. 44, № 7. — С. 983-991.
Иванов Б.Г. Потери ног у крабов (Crustacea, Decapoda: Brachyura Majidae, Anomura Lithodidae) в западной части Берингова моря // Исследования биологии промысловых ракообразных и водорослей морей России. — М. : ВНИРО, 2001. — С. 180-205.
Камчатский краб в Баренцевом море : монография. — Мурманск : ПИНРО, 2003. — 383 с.
Лакин Г.Ф. Биометрия : монография. — М. : Высш. шк., 1980. — 293 с.
Лысенко В.Н. Особенности линьки камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) на западнокамчатском шельфе // Исследования биологии промысловых ракообразных и водорослей морей России. — М. : ВНИРО, 2001. — С. 111-119.
Матюшкин В.Б. Особенности размножения камчатского краба в фьордовых водах Западного Мурмана // Камчатский краб в Баренцевом море. — Мурманск : ПИН-РО, 2003а. — С. 88-100.
Матюшкин В.Б. Сезонные миграции камчатского краба в Баренцевом море // Камчатский краб в Баренцевом море. — Мурманск : ПИНРО, 2003б. — С. 70-78.
Моисеев С.И. Промыслово-биологические исследования камчатского краба (Pa-ralithodes camtschaticus) в январе-марте 2002 г. в прибрежной зоне Варангер-фиорда (Баренцево море) // Тр. ВНИРО. — 2003. — Т. 142. — С. 151-177.
Моисеев С.И., Вагин А.В., Полонский В.Е. Характеристика осенних скоплений камчатского краба в Варангер-фиорде и тактика его промысла на ограниченном полигоне // Тр. ВНИРО. — 2005. — Т. 144. — С. 194-211.
Моисеев С.И., Моисеева С.А. Изменения уровня гемоцианина в гемолимфе камчатского краба Paralithodes camtschaticus баренцевоморской популяции в течение ли-ночного цикла // Мат-лы 9-го съезда Гидробиол. о-ва РАН. — Тольятти : ИЭВБ РАН, 2006а. — Т. 2. — С. 43.
Моисеев С.И., Моисеева С.А. Изучение структурных особенностей гемоцианина из гемолимфы камчатского краба Paralithodes camtschaticus баренцевоморской популяции в течение линочного цикла // Мат-лы 7-й Всерос. конф. по промысловым беспозвоночным (памяти Б.Г. Иванова). — М. : ВНИРО, 2006б. — С. 105-108.
Моисеев С.И., Муллин Ю.Н., Моисеева С.А. Выживаемость крабов в ловушках: уровень гемоцианина в гемолимфе различных видов крабов как индикатор влияния голодания на организм животных // Мат-лы 10-го съезда Гидробиол. о-ва РАН. — Владивосток : Дальнаука, 2009. — С. 276.
Моисеева С.А., Моисеев С.И. Зависимость между наполнением конечностей мышечной тканью и концентрацией гемоцианина в гемолимфе у камчатского краба (Pa-ralithodes camtschaticus) баренцевоморской популяции // Вопр. рыб-ва. — 2008а. — Т. 9, № 1(33). — С. 200-217.
Моисеева С.А., Моисеев С.И. Сезонная вариабельность концентрации и структуры гемоцианина в гемолимфе камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) барен-цевоморской популяции // Современное состояние водных биоресурсов : мат-лы науч. конф., посвящ. 70-летию С.М. Коновалова. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2008б. — С. 908-913.
Моисеева С.А., Моисеев С.И. Оценка доли крупноразмерных самцов камчатского краба баренцевоморской популяции, вступающих в линьку, по уровню гемоциа-нина в гемолимфе // Мат-лы 10-й Всерос. конф. по проблемам рыбопромысл. прогнозирования. — Мурманск : ПИНРО, 2009. — С. 97-98.
Павлов В.Я. Жизнеописание краба камчатского Paralithodes camtschaticus (Tilesius, 1885) : монография. — М. : ВНИРО, 2003. — 110 с.
Пинчуков М.А., Беренбойм Б.И. Линька и рост камчатского краба в Баренцевом море // Камчатский краб в Баренцевом море. — Мурманск : ПИНРО, 2003. — С. 100-106.
Промысловые беспозвоночные шельфа и материкового склона северной части Охотского моря : монография / Михайлов В.И., Бандурин К.В., Горничных А.В., Карасев А.Н. — Магадан : МагаданНИРО, 2003. — 284 с.
Руководство по изучению десятиногих ракообразных Decapoda дальневосточных морей. — Владивосток : ТИНРО, 1979. — 60 с.
Слизкин А.Г., Сафронов С.Г. Промысловые крабы прикамчатских вод : монография. — Петропавловск-Камчатский : Северная Пацифика, 2000. — 180 с.
Тальберг Н.Б. Сравнительная характеристика особенностей миграций камчатского краба на прибрежных акваториях Баренцева и Охотского морей // Тр. ВНИРО. — 2005. — Т. 144. — С. 91-101.
Bellelli A., Giardina B., Corda M. et al. Sexual and seasonal variability of lobster hemocyanin // Comp. Biochem. Physiol. — 1988. — Vol. 91A. — P. 445-449.
Condo S.G., Pellegrini M.G., Corda M. et al. Lobster haemocyanin. Influence of acclimatization on subunit composition and functional properties // Biochem. J. — 1991. — Vol. 277. — P. 419-421.
DeFur P.L., Mangum C.P., Reese J.E. Respiratory responses of the blue crab Callinectes sapidus to long-term hypoxia // Biol. Bull. — 1990. — Vol. 178. — P. 46-54.
Engel D.W., Brouwer M., Mercaldo-Allen R. Effect of molting and environmental factors on trace metal body-burdens and hemocyanin concentrations in the American lobster, Homarus americanus // Mar. Environ. Res. — 2001. — Vol. 52(3). — P. 257-269.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature (London). — 1970. — Vol. 227. — P. 680-685.
Mangum C.P. Subunit composition of hemocyanin of Callinectes sapidus: pheno-types from naturally hypoxic waters and isolated oligomers // Comp. Biochem. Physiol. — 1994. — Vol. 108B. — P. 537-541.
Mangum C.P., Rainer J.S. The relationship between subunit composition and O2 binding of blue crab hemocyanin // Biol. Bull. — 1988. — Vol. 174. — P. 77-82.
Markl J., Decker H. Molecular structure of the arthropod hemocyanins // Adv. Comp. Environ. Physiol. — 1992. — Vol. 13. — P. 325-376.
Markl J., Hofer A., Bauer G. et al. Subunit heterogeneity in arthropod hemocyanins. II. Crustacea // J. Comp. Physiol. — 1979. — Vol. 133. — P. 165-175.
Mattiello S., Raicevich S., Giomi F. et al. Resistance to stress and Hc functional modulation in Liocarcinus sp. // Micron. — 2004. — Vol. 35. — P. 55-57.
Moiseev S.I., Gorjanina S.V., Moiseeva S.A. The muscular tissue condition in limbs of red king crab (Paralithodes camtschaticus) in the Barents Sea during autumn and winter period: differences from the West Kamchatka population // The Kamchatka (red king) crab in the Barents Sea and its effect on the Barents Sea ecosystem. — M. : VNIRO, 2009. — P. 37.
Moiseeva S.A., Moiseev S.I. Changes of hemocyanin concentration in the hemolymph of red king crab (Paralithodes camtschaticus) in the Barents Sea and on the West Kamchatka shelf during postmolt period // The Kamchatka (red king) crab in the Barents Sea and its effect on the Barents Sea ecosystem. — M. : VNIRO, 2009. — P. 38.
Molon A., Di Muro P., Bubacco L. et al. Molecular heterogeneity of the hemocyanin isolated from the king crab Paralithodes camtschaticae // Eur. J. Biochem. — 2000. — Vol. 267. — P. 7046-7057.
Pereladov M.V., Moiseev S.I., Talberg N.B. Long-terms trends in structure of coastal concentrations of the red king crab in the eastern part of the Varangerfjord // The Kamchatka (red king) crab in the Barents Sea and its effect on the Barents Sea ecosystem. — M. : VNIRO, 2009. — P. 39-40.
Truchot J.P. Respiratory function of arthropod hemocyanins // Adv. Comp. Environ. Physiol. — 1992. — Vol. 13. — P. 377-410.
Van Holde K.E., Miller K.I. Hemocyanins // Adv. Protein Chemistry. — 1995. — Vol. 47. — P. 1-81.
Zelenina D.A., Mugue N.S., Stoklitskaya D.S., Jerstad K.E. Red king crab genetics in the Barents Sea — development of a joint Russian // The Kamchatka (red king) crab in the Barents Sea and its effect on the Barents Sea ecosystem. — M. : VNIRO, 2009. — P. 33.
Поступила в редакцию 2.03.11 г.
