CC BY
22СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛОВОЛОКОН И УГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Понаморева О.Н.(olga@tsu.tula.ru) (1), Мазанова А.А.(3), Каленюк А. А.(2), Алферов ВА/^ет^^иЛи^.ш) (1), Решетилов.А.Н (anatol@ibpm.serpukhov.su) (3)
(1) Тульский государственный университет
(2) Институт сорбции и проблем эндоэкологии НАН Украины
(3) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Иммобилизованный биологический материал наряду с его широким использованием в биореакторах (производство физиологически активных веществ, трансформация органических соединений, очистка водных и газовых сред) сравнительно недавно нашел еще одно эффективное применение в аналитических приборах нового поколения - биосенсорах. Успехи этой стремительно развивающейся области аналитической биотехнологии отражены в ряде обзоров и монографий [1-5]. Одной из достаточно острых в биосенсорном анализе является проблема специфичности.
Субстратная специфичность биосенсоров каталитического типа (ферментных, клеточных, тканевых) относится к наиболее важному параметру, определяющему их практическую полезность. Специфичность (или селективность детекции) может значительно варьировать в зависимости от типа биоматериала, конструкции сенсора, метода иммобилизации и в действительности невозможно получить "абсолютную специфичность", подразумевающую чувствительность анализатора исключительно к целевому соединению.
Несмотря на то, что проблема неспецифичности анализа относится не только к сенсорам каталитического, но и аффинного типа [6], ее острота наиболее выражена для каталитических, в первую очередь, микробных сенсоров. Это обусловлено присутствием в клетках множества ферментов, приводящих к отклику биосенсора на широкий спектр окисляемых ими субстратов [6-9].
Новые тенденции, появившиеся в области создания биосенсорных анализаторов, позволяют в некоторых случаях рассматривать широкую субстратную специфичность или неселективность как преимущество и возможность ее использования для создания анализаторов многокомпонентных сред типа "искусственный нос", "искусственный язык" [10-11]. Для реализации таких систем полезными являются методы направленного изменения субстратной специфичности для получения предпочтительной чувствительности к определенному субстрату.
Ранее в работах [12-14] были представлены данные о чувствительности двух типов микробных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans (Э. oxydans) к глюкозе и этиловому спирту; в силу того, что модели
сенсоров были различны, чувствительность к субстратам также различалась, что, в сущности, отражало субстратную специфичность сенсоров. Так, в соответствии с опубликованными в [12, 13] данными активность клеток, сорбированных на мембранный носитель, была выше при окислении этанола в сравнении с интенсивностью окисления глюкозы. Использование этого же штамма бактерий в электроде медиаторного типа, в котором клетки были иммобилизованы на частицах графитового порошка, содержащих сорбированный медиатор 1,1-диметилферроцен, приводило к инверсии чувствительности - интенсивность окисления глюкозы превышала интенсивность окисления этанола [14]. Причина наблюдаемого эффекта авторами указанных публикаций не исследовалась. Вместе с тем описанное изменение свойств биологического рецептора представляется важным и может составить основу для направленного изменения субстратной специфичности. Можно предположить, что основой изменений специфичности при переходе от биосенсора на основе электрода Кларка к электроду медиаторного типа может являться изменение условий иммобилизации либо способ регистрации сигнала (прямая амперометрия) наряду с присутствием дополнительного компонента биорецептора диметилферроцена.
Для выяснения причины изменения специфичности была выполнена данная работа, цель которой состояла в изучении влияния компонентов ме-диаторного электрода (графитового материала, парафинового масла, медиатора) на изменение биохимического поведения бактерий О.охуйат. Полученная информация об изменении субстратной специфичности микробных клеток может быть полезна для понимания функционирования мембраннос-вязанных ферментов в интактных клетках и в условиях электрокаталитического окисления субстратов, а также использована практически в различных биотехнологических циклах.
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы
В работе был использован штамм 01ысопоЬас1вг охуйат № 9.7 из рабочей коллекции лаборатории. Бактерии выращивали по методу, описанному в [15]. В ходе исследований применяли графитовую пудру, парафиновое масло и медиатор 1,1'-диметилферроцен (РЫкл). Также были использованы модифицированные углеродные материалы в виде войлока, жгута или ткани [16]. Модификацию углеродных материалов проводили по общепринятым методикам, заключающимся в жидкофазной обработке окисляющими агентами
[17, 18].
При измерении сигналов сенсора в качестве электролита использовали 10 мМ калий-фосфатный буферный раствор, рН 6.5. В качестве модельных субстратов были выбраны глюкоза и этанол.
2.2. Формирование электродов и проведение измерений
Графитовые пастовые электроды готовили следующим образом. Гра-фитово-масляной пастой (100 мг графитовой пудры, смешанной с 50 мкл па-
рафинового масла) заполняли пластиковый шприц (объем 1.0 мл, внешний и внутренний диаметр диаметры выходного отверстия составляли 4.0 и 1.7 мм, соответственно). Выходное отверстие заполняли на глубину 1 мм модифицированной пастой, приготовленной растиранием в агатовой ступке 100 мг графитовой пудры, 50 мкл парафинового масла и 2.0 мг 1,1 диметилферроцена, использованного в качестве медиатора.
Медиаторный электрод, модифицированный клетками, погружали в кювету (2 мл) с тщательно перемешиваемым раствором. Ответы сенсора на вводимые в раствор концентрации субстратов регистрировали при 250 мВ относительно Ag/AgCl электрода сравнения. В случае использования модифицированных углеродных материалов последние пропитывались ацетоновым раствором медиатора (10 М). Клетки микроорганизмов иммобилизовали сорбцией, для чего на поверхность пасты, заполняющей шприц, или углеродных материалов наносили 3 мкл клеточной суспензии (100 мг сырого веса/мл), смешанной с графитовой пудрой, и подсушивали в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
При регистрации клеточного дыхания с помощью кислородного электрода типа Кларка (оценка контрольного состояния бактерий) клетки микроорганизмов наносили на рабочую поверхность электрода (3 мкл клеточной суспензии, 50 мг сырого веса/мл), подсушивали в течение 30 мин и фиксировали с помощью капроновой сетки. Измерения проводили при полном насыщении буфера кислородом воздуха в кювете объемом 5 мл. Концентрация субстратов во всех случаях, если не указано дополнительно, составляла 5 мМ.
3. Результаты и обсуждение
В качестве контрольных значений были выбраны сигналы сенсора на основе кислородного электрода с иммобилизованными сорбцией нативными клетками микроорганизмов. Полученный ответ сенсора на этанол в 2 раза превышал ответ на глюкозу (соотношение ответов на этанол и глюкозу составляет 2:1, соответственно).
Следующий этап исследования был направлен на оценку соотношений сигналов сенсора, содержащего рецепторный элемент, представленный бактериями, удерживаемыми силами физической сорбции на мембранном носителе. Для иммобилизации использовали хроматографическую бумагу ОБ/А, изготовленную из стекловолокон; возможность ее применения для иммобилизации бактерий представлена в работах [12, 13]. Соотношение сигналов на этанол и глюкозу при иммобилизации клеток на мембрану ОБ/А незначительно изменялось (снижалось) и составляло 1.5:1 (рис.1).
Дальнейшее этапы были посвящены оценке влияния компонент медиа-торного электрода на субстратную специфичность сенсора; при этом регистрацию активности клеток производили, как и в предыдущих случаях, кислородным электродом. Рассматривали следующие варианты формирования биологического рецепторного элемента на поверхности электрода: 1) сорбция медиатора из ацетонового раствора на рабочую поверхность электрода с последующей иммобилизацией клеток на поверхности электрода;
2) сорбция клеточной суспензии, смешанной с графитовой пудрой, на поверхности электрода;
3) сорбция клеточной суспензии, смешанной с графитовой пудрой, предварительно обработанной ацетоновым раствором медиатора, на поверхности электрода;
4) сорбция клеточной суспензии, смешанной с графитовой пудрой, медиатором и парафиновым маслом, на поверхности электрода.
Рис. 1. Относительные ответы сенсора на глюкозу и этанол. Клетки иммобилизованы на хроматографической бумаге ОБ/Л.
На рис. 2 представлены относительные сигналы сенсора (ответ глюкозу принят за 100%) для исследованных случаев: сорбция клеток на поверхности, обработанной раствором медиатора ("1" на рис.2); сигналы медиаторного электрода при электрокаталитическом окислении субстратов ("2" на рис.2); сорбция клеток, смешанных с графитовой пудрой, на поверхности электрода Кларка ("3" на рис.2); сорбция клеток, смешанных с графитовой пудрой, обработанной ацетоновым раствором медиатора ("4" на рис.2) и сорбция клеток, включенных в состав графитовой пасты, предназначенной для регистрации процессов электрокатализа, на поверхности электрода Кларка ("5" на рис.2).
В 1 - Электрод Кларка, сорбция на поверхности
1 1 2 - Медиаторный графитовый электрод
1 1 3 - Электрод Кларка, клетки + графитовая пудра
4 - Электрод Кларка, клетки+ графитовая пудра + медиатор
1=1 5 - Электрод Кларка, клетки + графитовая пудра + медиатор + парафиновое масло
Рис. 2. Ответы сенсоров, модифицированных различными способами, на глюкозу и этанол.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие медиатора не оказывает заметного влияния на соотношение сигналов "этанол/глюкоза" ("1" на рис.2). Вместе с тем, введение графита в композицию рецепторного элемента приводит к различному относительному снижению ответов на этанол ("2"-"5" на рис.2). Эффект снижения чувствительности сенсора к этанолу, выраженный в абсолютных значениях изменения тока электрода, приведен на рис.3. Видно, что при добавлении к клеткам графита отклик сенсора на введение глюкозы остается практически без изменений, а на этанол значительно снижается ("1" и "2", рис.3). При этом соотношение сигналов "этанол/глюкоза" инвертируется по сравнению с контрольным и составляет величину порядка 0.15:1. Эффект проявляется только в том случае, если в составе рецепторного элемента присутствует графитовая пудра.
0,7
0,6
0,5
^ 0,4
[5 0,3
о
0,2
0,1
0,0
1 - электрод Кларка, сорбция на поверхности
2 - электрод Кларка, клетки + графитовая пудра
3 - электрод Кларка, клетки + графитовая пудра + медматор
4 - электрод Кларка, клетки + графитовая пудра + медиатор + парафиновое масло
Рис. 3. Абсолютные ответы сенсоров, модифицированных различными способами, на глюкозу и этанол.
Полученные результаты позволяют предположить, что на биохимическое поведение бактерий G.oxydans влияет присутствие графитового материала; по-видимому, это может быть связано с возникновением непосредственного контакта графитовых частиц с клетками и изменением в результате этого свойств локализованных в клеточной мембране дегидрогеназ бактерий. Как известно, ферменты глюкоздегидрогеназа (ГДГ) (КФ 1.1.99.17) и алкогольде-гидрогеназа (АДГ) (КФ 1.1.99.8) катализируют первые реакции окисления глюкозы и этанола [19]:
н
сн2он —о
соон
он
н он он
ГДГ
н но н
-он
н
н
н
он
он
он
глюкоза
I
сн2он
глюконовая кислота
с2н5он
этанол
АДГ
Ш3-С
о
н
уксусный альдегид
Эти ферменты являются поверхностно локализованными и связаны с весьма упрощенной электроно-транспортной цепью бактерий G.oxydans [20]. Структура АДГ и ГДГ во многом похожа: они содержат пироллохинолинхинон (РОО) в качестве кофактора [21]; оба фермента имеют один центр связывания с субстратом, который находится на субъединицах похожего строения (дегидрогеназных компонентах) с молекулярной массой 85000 и 83000 для АДГ и ГДГ соответственно [19]. Из-за отсутствия принципиальной разницы в строении активных центров механизмы функционирования обоих ферментов совпадают [22]. Однако существуют некоторые различия в структуре этих ферментов. АДГ - фермент, обладающий четвертичной структурой, состоит из 3-х субъединиц: дегидрогеназного компонента, цитохромного компонента и компонента неизвестной функции. ГДГ локализована более глубоко в ци-топлазматической мембране и представляет собой активный белок третичной структуры и по строению напоминает дегидрогеназную субъединицу АДГ. У ГДГ отсутствуют характерные для АДГ дисульфидные связи, и их место занимает гистидин. Оба фермента отличаются особенностями в строении внешних петель, что и оказывает влияние на их субстратную специфичность. На рисунке 4 представлена возможная схема функционирования микробного медиаторного биосенсора с участием мембрано-локализованных ферментов. В связи с указанным имеется возможность предположить, что адсорбция бактерий на носителе с неоднородной поверхностью приводит к значительному изменению конформации мембран бактерий. Такие конформационные изменения в первую очередь должны затрагивать ферменты, локализованные в верхнем слое плазматической мембраны или на ее поверхности, например алкогольдегидрогеназу, которая локализована в мембране не так глубоко по сравнению с глюкоздегидрогеназой.
Рис.4. Схема функционирования микробных медиаторных биосенсоров. 1 - АДГ - алкогольдегидрогеназа (ДГ- дегидрогеназная субъединица; цит С553
- цитохром; Р - субъединица неизвестной функции); 2 - цитохромоксидаза; 3
- плазматическая мембрана; 4 - наружная мембрана; 5 - графитовое наполнение электрода.
Для подтверждения предположения о влиянии свойств поверхности графита на характер биохимического поведения G.oxydans провели исследование воздействия углеродных материалов с разными поверхностными характеристиками на субстратную специфичность бактерий. В ходе исследования при формировании электродов были использованы углеродный жгут (карбонизат) с небольшой удельной поверхностью и небольшим количеством кислотных центров, активированная углеродная ткань с большой удельной поверхностью и со значительным количеством основных центров, а также два образца окисленной углеродной ткани с кислотными центрами на поверхности. Характеристика используемых в исследовании материалов приведена в Таблице 1 (по данными работы [16]). Полученные результаты подтверждают, что в присутствии углерода и углеродных материалов снижается каталитическая активность клеток Gluconobacter oxydans к этанолу (рис. 5).
Углеродные материалы с положительно заряженной поверхностью оказывают меньшее влияние на изменение субстратной специфичности G.oxydans. Значительное снижение чувствительности G.oxydans к этанолу наблюдается при использовании в качестве сорбента окисленной углеродной ткани с отрицательно заряженной поверхностью. Вероятно, в данном случае имеет место эффект специфического связывания компонентов наружной мембраны микроорганизмов с химическими группами носителей.
аблица 1. Характеристики углеродных материалов.
Углеродные модифицированные носители Кол-во иммобили-зо-ванных клеток, мг/г 8уд, м /г Обменная емкость
0,1 Н №0Н, мэкв/г 0,1 Н нс1, мэкв/г
Углеродный жгут (карбони-зат) 25,3 11 0,2 0,0
Углеродная ткань (активированная) 47,5 1240 0,2 0,5
Углеродная ткань (окисленная 1) 28,0 260 1,8 0,1
Углеродная ткань (окисленная 2) 30,0 300 2,4 0,0
Рис. 5. Специфичность клеток G. oxydans, иммобилизованных на различных углеродных материалах. Контрольные измерения выполнены при сорбции клеток на хроматографическую бумагу.
Полученные данные позволяют предположить, что наблюдаемое изменение субстратной специфичности бактериальных клеток Gluconobacter
oxydans обусловлено влиянием графитового материала; в этой связи можно допустить, что данный эффект обусловлен физико-химическими свойствами поверхности графита и его взаимодействием с мембранными структурами бактерий. Результаты исследования подсказывают возможные пути поиска для направленного изменения субстратной специфичности микробных сенсоров, что представляет интерес в практическом плане; кроме того, возможно использование медиаторных микробных сенсоров для изучения механизмов функционирования дыхательной цепи цитоплазматических мембран микробных клеток.
Работа выполнена при поддержке регионального конкурса РФФИ «Центр» Грант 01-04-96023 "Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов".
ЛИТЕРАТУРА
1. Сорочинский В. В., Курганов Б. И. Биосенсоры для определения органических соединений. I. Сенсоры аминокислот. мочевины. спиртов и органических кислот (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. N 6. С. 579-594
2. Сорочинский В. В., Курганов Б. И. Биосенсоры для определения органических соединений. II. Сенсоры углеводов. ароматических. гетероциклических и других органических соединений (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. N 1. С. 22-42
3. Biosensors. Fundamentals and applications. (Eds. Turner A. P. F., Karube I., Wilson G. S. ) Oxford University Press. 1988. 770 p.
4. Donald G. Buerk. Biosensors: Theory and applications. / Lancaster: Technomic Publishing Company, Inc., 1993. 221 p.
5. Gabor Harsanyi. Sensors in Biomedical Applications: Fundamentals, Technology and Applications. / Lancaster: Technomic Publishing Company, Inc., 2000. 350 p.
6. Riedel K. Microbial sensors and their applications in the environment. // Experimental Technique of Physics. 1994. V. 40. N 1. P. 63-76.
7. Bousse L. Whole cell biosensor. // Sensor and Actuators: Chemical. 1996. V.34. N 1-3. P. 270-275.
8. Riedel K. Microbial sensors and their applications in the environment. // Experimental Technique of Physics. 1994. V. 40. N 1. P. 63-76.
9. Tran-Minh C., Naessen M. Whole-cell biosensor for determination of volatile organic compounds in the form of aerosole. // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 364. N 1-3. P. 153-158.
10. Gopel W., Ziegler C., Breer H. et al. //Bioelectronic noses: a status report. Part I. Biosenors&Bioelectronics. 1998. V. 13. N 3-4. P. 479-493
11.Ziegler C., Gopel W.Hammerle H. et al. //Bioelectronic noses: a status report. Part II. Biosensors&Bioelectronics, 1998. V. 13. N 5. P. 539-571
12.Решетилов А.Н., Ильясов П.В., Донова М.В., Довбня Д.В., Боронин А.М.. Определение концентрации глюкозы в образцах сыворотки крови человека микробным биосенсором. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1995, N 8, с.218-221.
13.Reshetilov A.N., Trotsenko Yu.A., Morozova N.O., Iliasov P.V., Ashin V.V. // Characteristics of Gluconobacter oxydans B-1280 and Pichia methanolica MN4 cell based biosensors for detection of ethanol" // Process Biochemistry. 2001. V.36. P.1015-1020.
14.А.Н. Решетилов, А. А. Мазанова, Н.В. Китанина, Л. Гортон, А.М. Боронин. Электрокаталитическое окисление субстратов иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans в присутствии медиатора электронного переноса.// Доклады академии наук. 1998. Т. 358. N 2. С. 263-265.
15. Донова М. В., Борман Е. А., Кощеенко К. А., Красильникова Т. Н., По-морцева Н. В. Окисление D-сорбита в L-сорбозу иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans, инкубированными в ростовой среде.// Прикл. биохимия и микробиология. 1988. T. 24. C. 368-374.
16. А Каленюк А.А., Таранова Л.А., Решетилов А.Н., Тарасенко Ю.А., Стрел-ко В.В. Иммобилизация бактерий на модифицированных углеродных волокнах для применения в биосенсорах. - Биотехнология, 1999, N 5, с.71-78.
17.Ермоленко И. Н., Люблинер И. П., Гулько Н. В. Элементосодержащие угольные волокнистые материалы. Минск: Наука и техника. 1982. 272 с.
18. Тарковская И. А. Окисленный уголь. Киев: Наук. Думка. 1981. 196 с.
19.Ameyama M., Adachi O. D-glucose dehydrogenase from Gluconobacter Sub-oxydans // Methods Enzymol. 1982. V.89. P. 450-457. Review.
20.Луста К.А., Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах. //Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т.34. N 4. С.339-353 (обзор).
21.Ameyama M, Matsushita K, Ohno Y, Shinagawa E, Adachi O. Existence of a novel prosthetic group, PQQ, in membrane-bound, electron transport chain-linked, primary dehydrogenases of oxidative bacteria.// FEBS Lett. 1982. V.139. N 2. P.255-263.
22. Shinagawa E, Matsushita K, Adachi O, Ameyama M. Evidence for electron transfer via ubiquinone between quinoproteins D-glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans.// J Biochem. 1990. V. 107. N 6. P.863-870.
