CC BY
67Тематический номер «Ветеринария»
www.agroyug.ru
УДК 619:542.2/001/53:616.[07:9]:579 Безбородова Н.А., с.н.с., к.в.н. Ким Н.А., с.н.с.
ФНБНУ Уральский НИВИ, г. Екатеринбург
сравнение лабораторных методов диагностики инфекций, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами
В настоящее время патогенные и условно-патогенные бактерий все чаще становятся причиной заболеваний сельскохозяйственных животных, что может стать причиной, способствующей более ранней выбраковке животных, увеличению сухостойного периода, снижению воспроизводительной функции. Для преодолений данных проблем, необходима ранняя и более точная диагностика бактериальных заболеваний, которая имеет большое значение при постановке более точного диагноза назначения и проведения адекватной терапии [2,4].
В современных условиях диагностика инфекционных болезней сохраняет все свои традиционные черты, сформировавшиеся за последние десятилетия. В то же время диагностика характеризуется непрерывным совершенствованием уже найденных приемов и методов распознавания болезней и поисками новых, более эффективных [2,6].
В последние десятилетия наблюдается непрерывное изменение, как клинической картины инфекционных заболеваний, так и особенностей их патогенеза. Например, известные достаточно опасные возбудители могут вызывать стёртые формы болезней или наоборот: условно-патогенные или считавшиеся непатогенными микроорганизмы становятся причиной тяжелых форм [5,8]. Меняется троп-ность патогенных микроорганизмов и, как следствие, появляются новые формы инфекционных процессов. Возникают хронические, персистирующие формы инфекций и изменяется антигенная структура возбудителей, микроорганизмы переходят в некульти-вируемое состояние [2,4,6].
Для обнаружения и идентификации возбудителя болезни у сельскохозяйственных животных применяются разные лабораторные методы. Для определения в биологическом материале условно-патогенных и патогенных микроорганизмов используются микробиологические методы исследования и ПЦР-диагностика. Микробиологические исследования позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме возбудителей инфекционных заболеваний. Также такой анализ является эффективным способом выявления уровня чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам [2,3,7,10].
На сегодняшний день одной из перспективных направлений развития лабораторной диагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР — метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе) [2,5,7]. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате на-
рабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. В отличие от традиционных микробиологических методов, метод пЦр позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение анти-биотикорезистентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию [5,7,8].
В настоящее время устойчивость к антибиотикам стала актуальной проблемой в сельском хозяйстве [3]. Инфекции, вызванные резистентными штаммами Salmonella, E.coli и Campylobacter, могут вызывать у животных тяжелое протекание болезней. Вирулентность условно-патогенных микроорганизмов повышается с каждым годом всё больше и больше. Бесконтрольное поголовное применение антибиотиков способствует формированию резистентности и повышению уровня патогенности. Поэтому так необходимы методы диагностики, такие как устойчивость, к антимикробным препаратом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов диско-диффузионным методом и резистентность, которая определяет точечные мутации к целому ряду групп антибиотиков [3,8,10].
Цели и задачи.
Провести сравнительный анализ двух методов диагностики (микробиология, ПЦР) для определения и идентификации в биологическом материале от крупного рогатого скота патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, с определением резистентности и чувствительности к антимикробным препаратам.
Материалы и методы.
Исследования проводились в 2016 году в отделе ветеринарно-лабораторной диагностики с испытательной лабораторией ФГБНу Уральского НИВИ. На исследование поступило 10 проб молока и 5 проб влагалищной слизи от коров. Пробы были направлены на микробиологическое исследование с определением чувствительности к антимикробным препаратам и на ПЦР-диагностику с постановкой резистентности.
Микробиологические исследования биологического материала проводили согласно общепринятым методикам. В работе использовались накопительные и дифференциально-диагностические питательные
ЭФФЕКТИВНОЕ №2 март
животноводство 2018
среды (МПБ, среда Плоскирева, среда Эндо, Энтерококк агар и т.д.). Идентификацию бактерий осуществляли методом пересева на «пестрые ряды», приготовления и окраски мазков по Грамму. Дополнительно использовали пластины биохимические, дифференцирующие для энтеробактерий - ПБДЭ (идентификация по 20 диагностическим признакам),
000 НПО «Диагностические системы», Россия. У всех выделенных бактерий определяли антибиотикоре-зистентность при помощи диско-диффузионного метода.
ПЦР-диагностику осуществляли с использованием реагентов для выделения ДНК из биологического материала «ДНК сорбент» и тест-системы «Ветсепто-скрин», наборов на определение резистентности по наличию генетических маркеров к цефалоспоринам 1-2 группы (выявление генов CTX-M, МесА), к карбапе-немам 1 группы (выявление гена VIM) и макролидам
1 группы (выявление гена ErmB), ООО «НПФ Литех», Россия. ПЦР исследования осуществлялись в режиме реального времени с применением анализатора Rotor-Gene 3000, Австралия.
Результаты исследований.
При исследовании методом ПЦР во всех пробах влагалищной слизи были обнаружены бактерии группы Enterobacter spp., в двух пробах E. coli и в одной пробе бактерии группы Proteus spp.. Резистентность у обнаруженных бактерий к цефалоспоринам 1-го ряда (цефазолин, цефалотин, цефалоксин, цеф-триаксон, цефалодин) и к карбапенемам 1-го ряда (меропенем, имипенем, дорипенем и т.д.) была не обнаружена. В 5 пробах молока присутсвовали St. aureus и Streptococcus spp..Единично был обнаружен E. faecalis. В остальных пробах молока не были найдены патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Резистентность у бактерий к цефалоспоринам 1-го ряда (цефазолин, цефалотин, цефалоксин, цефтриаксон, цефалодин), к цефалоспоринам 2-го ряда (цефуроксин, цефаклор), к карбапенемам 1-го ряда (меропенем, имипенем, дорипенем) была не обнаружена.
Микробиологические исследования выявили почти во всех пробах влагалищной слизи наличие Enterococcus faecalis, в двух пробах Pseudomonas aeruginosa и в одной пробе St. aureus. В 4 пробах молока был обнаружен золотистый стафилококк и энтерококк фекальный, в нескольких пробах синег-нойная палочка и бактерии группы энтеробактер. Все обнаруженные виды микроорганизмов были чувствительны к антимикробным препаратам (ампициллин, амоксициклин, доксициклин, левомицетин, офлоксацин, рифампицин, цефтриаксон, ципрофлок-сацин, меропенем).
Выводы.
Проведенные исследования двумя разными способами показали различия видового состава микробного фона в биологическом материале.
Методом ПЦР в пробах влагалищной слизи были обнаружены бактерии группы Enterobacter spp., Proteus spp. и E. coli. Микробиологические исследования выявили наличие в пробах Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и St. aureus. Данные патогенные и условно-патогенные бактерий могут быть причиной возникновения заболевания органов размножения, среди которых значительное место занимают эндометриты [5,9].
В пробах молока методом ПЦР были обнаружены бактерии: St. aureus, E. faecalis и Streptococcus spp.. Микробиологические исследования показали наличие в молоке бактерий: St. aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и группу Enterobacter spp. Недопустимо попадание в молоко болезнетворных бактерий и микробов. Золотистый стафилококк мо-
жет приводить к воспалению молочных желез у коров, развитию маститов, а употребление такого молока к диспепсическим расстройствам желудочно-кишечного тракта и пищевым отравлениям, как у людей, так и у животных. В некоторых пробах присутствовали бактерии группы Е^егососсц^ spp. Данные микроорганизмы могли попасть в пробу молока при несоблюдении правил отбора проб (грязные руки, инвентарь и т.д.) и норм гигиены содержания крупного рогатого скота.
Все обнаруженные виды патогенных и условно-патогенных бактерий были чувствительны к антимикробным препаратам и не имели резистентности к ним, что подтвердилось и ПЦР и микробиологическими исследованиями.
При исследовании биологического материла методами ПЦР и микробиологии были получены разные результаты. Невозможно сказать, что один из методов был не точен или не верен, так как в развитии лабораторной диагностики инфекционных заболеваний очевидна необходимость комплексного подхода, который заключается в использовании различных лабораторных методов для установления этиологического диагноза инфекционного заболевания. Разные методы, используемые в лабораторной практике должны сочетать друг друга, дополняя полноту исследовании.
Литература:
1. Агольцов, В.А. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота / В.А. Агольцов, Е.С. Красникова, А.А. Щербаков //Вестник Алтайского государственного аграрного университета. -2012 - № 4. - Т.90. - С. 56-59.
2. Дроботова, Д.Ю. Передовые решения для лабораторной диагностики в ветеринарии от компании ООО «Интерлабсер-вис»/ Д.Ю. Дроботова //Farm Animals. - 2013. - № 3. - С.34-40.
3. Забровская, А.В. Чувствительность к антимикробным препаратам микроорганизмов, выделенных от сельскохозяйственных животных и из продукции животноводства/ А.В. Забровская // Farm Animals.- 2013. - №1. - С.78-83.
4. Комплексная программа по оздоровлению хозяйств от смешанных вирусно-бактериальных инфекций крупного рогатого скота/ Под общей редакцией О.Г.Петровой, И.М.Донник, И.А.Шкуратовой / Екатеринбург. - 2006. - с.21.
5. Лаптев, Г.Ю. Исследование вагинальной слизи высокопродуктивных коров в послеотельный период посредством ПЦР в реальном времени/ Г.Ю. Лаптев, Н.А. Новикова, Л.А. Ильина // Сельскохозяйственные животные. - 2014. - №3. - С. 10-12.
6. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник, под редакцией проф. А.И. Карпищенко, 2001 год, «Интермедика», Санкт-Петербург.
7. Петрова, О.Г. Молекулярно-биологические методы диагностики внутриутробных инфекций крупного рогатого скота / О.Г. Петрова, ЕЮ. Белоусова, Е.В. Печура и д.р. // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. - 2006. - № 8.- С. 176-177.
8. Ряпосова, М.В. Опыт усовершенствования методов лабораторной диагностики при оценке состояния здоровья высокопродуктивных коров / М.В. Ряпосова, А.И. Белоусов, Е.Н. Беспамятных //Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. - 2013. - Т.3. - №6. - С223-235.
9. Ряпосова, М.В. Распространение и этиология хронических эндометритов у коров в сельскохозяйственных организациях Свердловской области / М.В. Ряпосова, Е.Н. Шилова, О.В. Соколова // Ветеринария Кубани. - 2010. -№ 6. - С. 8-9.
10. Турченко А.Н., Коба И.С. Проблема акушерско-гинекологи-ческой патологии у коров // Актуальная проблемы соврем. ветеринарии / Краснодарский науч.-исслед. вет. ин-т. - Краснодар, 2011. - Ч. 2. -С. 216-221.
