CC BY
166
ниш
Содержание провоспалительных цитокинов, хемоаттрактанов и деструктивных металлопротеиназ в разных типах нестабильных атеросклеротических бляшек
Ю.И. Рагино1, д.м.н., проф., зав. лабораторией клинических биохимических и гормональных исследований НИИ терапии СО РАМН
А.М. Чернявский2., д.м.н., проф., зам. директора по научной работе ФГУ ННИИПК Росмедтехнологий Я.В.. Полонская1., к.б.н., старший научный сотрудник лаб. клинических биохимических и гормональных исследований НИИ терапии СО РАМН
А.М. Волков2, д.м.н., зав. лабораторией патоморфологии ФГУ ННИИПК Росмедтехнологий Е.В. Каштанова1, к.б.н., научный сотрудник лаб. клинических биохимических и гормональных исследований НИИ терапии СО РАМН
1 — Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения РАМН (НИИ терапии СО РАМН), г. Новосибирск;
2 — Федеральное Государственное учреждение Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. Е.Н. Мешалкина Росмедтехнологий (ФГУ ННИИПК Росмедтехнологий), Новосибирск
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РФФИ № 09-04-00374а
У мужчин с коронарным атеросклерозом без острого коронарного синдрома определены и изучены характерные и значимые для нестабильных бляшек разных типов (липидного, воспалительно-эрозивного и дистрофически-некротического) коронарных артерий воспалительные, деструктивные биомаркеры и хемоаттрактанты. Из 3-х типов нестабильных бляшек не только для воспалительно-эрозивного, но и для липидного типа характерна повышенная воспалительная активность (повышенные концентрации интерлейкина-1-бета, интерлейкина-6, интерлейкина-8, интерлейкина-18 и моноцитарного хемотаксического протеина-1) в сравнении с дистрофически-некротическим типом, при котором доминирующей является повышенная деструктивная активность (повышенные концентрации фактора некроза опухоли-альфа, эндотелина-1 и сниженный уровень тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 типа)..
Ключевые слова: атеросклеротические бляшки коронарных артерий, липидный, воспалительно-эрозивный и дистрофически-некротический типы нестабильности бляшек, воспалительные ци-
токины, хемоаттрактанты, деструктивные матриксные металлопротеиназы
Contents of proinflammatory cytokines, chemoattractants and destructive metalloproteinases in varrious tipe of unstable atherosclerotic plaques
Yu.I. Raginol, A.M. Chernyavski2, Ya.V Polonskayal, A.M. Volkov2, E.V Kashtanoval
1 — Institute of Internal Medicine Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk
2 — Research State of Circulation Pathology of Russian Medical Technology Agency, Novosibirsk
Typical and significant inflammatory, destructive biomarkers and chemoattractants of various types of unstable plaques (lipid type, inflammatory-erosive type, necrotic type) of coronary arteries were determined and studied in coronary atherosclerosis men without acute coronary syndrome. The increased inflammatory activity (increased concentrations of interleukin 1-beta, interleukin 6, interleukin 8, interleukin 18 and monocytes chemotactic protein - 1) was typical not only for unstable plaques inflammatory-erosive type, but for lipid type too in comparison with necrotic type of unstable plaques. On the other hand, increased destructive activity (increased levels of tumor necrotic factor alpha, endothelin 1 and decreased level of tissue inhibitor of metalloproteinase-1) was typical for necrotic type of unstable plaques only.
— Key words: atherosclerotic plaques of coronary arteries, lipid, inflammatory-erosive and necrotic types of unstable plaques, inflammatory cytokines, chemoattractants, destructive matrix metalloproteinases.
Абстракт
Abstract
23
Пусковым механизмом тромбообразования на поверхности атеросклеротической бляшки, приводящего к окклюзии артерии и развитию инфаркта миокарда, является нарушение целостности эндотелия на участке деструкции покрышки нестабильной или «уязвимой» атеросклеротической бляшки со склонностью к изъязвлению и разрыву [1-4]. Формирование нестабильной бляшки с истонченной покрышкой, очаговой деструкцией эндотелия, воспалительной клеточной инфильтрацией, рыхлым липидным ядром (иногда с участками некроза, кальциноза) [5-8], является критической стадией развития атеросклеротического очага [9, 10].
На сегодняшний день доказано, что важную роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки играет воспалительный процесс. Во многих исследованиях выявлена значительная инфильтрация нестабильных атеросклеротических бляшек активированными макрофагами, Т-лимфоцитами и лейкоцитами [2, 5, 8], секретирующими провоспалительные цито-кины, в том числе интерлейкин-1-бета (ИЛ-1-бета), ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и другие [10, 11]. ИЛ-1-бета и ФНО-
альфа индуцируют образование эндотелиальными клетками адгезивных молекул, приводя к снижению антиадгезивных и антикоагуляционных свойств эндотелия, ИЛ-6 - цитотоксический фактор диффе-ренцировки Т-лимфоцитов - стимулирует синтез и секрецию основных белков острой фазы воспаления, ИЛ-8 стимулирует продукцию факторов моноцитов и макрофагов, активирующих хемотаксис нейтро-филов и Т-лимфоцитов в атеросклеротические очаги, ИЛ-18, секретируемый Т-лимфоцитами, активирует моноциты и макрофаги, инициирует процессы апоптоза [3, 9, 11-13].
Параллельно с воспалительными цитокинами активированные макрофаги атеросклеротических очагов секретируют ряд хемоаттрактантов, в том числе, моноцитарный хемотаксический протеин (МСР-1), эндотелиально-моноцитарный активирующий полипептид (ЕМАР-11), молекулы межклеточной адгезии ЫСАМ-1) и молекулы адгезии эндотелиоцитов ^САМ-1). МСР-1, экспрессирующийся макрофагами в ответ на воздействие цитокинов ФНО-альфа, ИЛ-1-бета и ИЛ-6, является специфическим хемоаттрактантом моноцитов и Т-лимфоцитов [2,
Рисунок 1. Разные типы нестабильных атеросклеротических бляшек [19].
1 1 __ 1 1
1 1 1 - - 1 1 \
шшГ) ■вг^З^ив* jf
1 1
A B C D E F G
Неокклюзивный тромб
Тромбоциты
Макрофаги
Неокклюзивный пристеночный
тромб/фибрин
Массивный кальцинат
Большое липидное ядро
Разрыв покрышки
ГМК Протеогликаны
Нормальная Кровоизлияние, Кальцинат Организованный
покрышка некроз, организация, тромб
ангионеогенез
Нормальная интима
Нестабильная фиброатерома
Бляшка с воспалением, эрозией
Бляшка с некрозом, кальцинозом
Стенозирующая
3, 12]. ЕМАР-11, секретирующийся макрофагами и Т-лимфоцитами, является провоспалительным ци-токином и хемоаттрактантом, индуцирующим образование прокоагулянтного тканевого фактора на поверхности эндотелиоцитов, активацию нейтро-филов, апоптоз, ингибирование неоваскуляризации интимы/медии артериальной стенки [1 2-14].
Кроме провоспалительных цитокинов и хемоаттрактантов макрофаги продуци-руют матриксные металлопротеиназы (ММП) [15, 16], вызывающие деградацию внеклеточного матрикса. Из них колла-геназы ММП-1, ММП-13 расщепляют фибрилляр-
ный коллаген I и III типов, желатиназы ММП-2 и ММП-9 и стромолизин ММП-3 расщепляют адгезивные молекулы, нефибриллярные формы коллагена и протеогликаны [13, 17, 18]. Тканевой ингибитор металлопротеиназ 1 типа (ТИМП-1) является ингибитором ММП-1, ММП-3, ММП-9 и, связываясь с активным каталитическим центром ММП, блокирует их активность, образуя нековалентные комплексы (например, комплекс ТИМП-1 /ММП-3) [17, 18].
Существует несколько разных типов нестабильности атеросклеротических очагов. Наиболее часто
их классифицируют на 3 типа: 1) липидный (фи-броатерома), 2) воспалительно-эрозивный и 3) деструктивный (дистрофически-некротический) (рис. 1). Характерными чертами первого типа являются крупное атероматозное ядро (циркулярно или эксцентрично расположенное), истонченная фиброзная покрышка; второго - небольшое липид-ное ядро, фиброзная покрышка, обильно инфильтрированная клетками воспалительного ряда (макрофаги и Т-лимфоциты) или пенистыми клетками, гибель эндотелиальных клеток на поверхности воспалительной или липидной эрозии покрышки; третьего - выраженные дистрофические изменения и некрозы в покрышке, очаги кальцификации разных размеров под истонченной покрышкой [5, 6, 19].
Наше исследование было посвящено изучению роли факторов воспалительно-деструктивного процесса в развитии разных типов нестабильности ате-росклеротических очагов коронарных артерий
Материалы и методы
Исследование было проведено в рамках Программы совместных научно-исследовательских работ НИИ терапии СО РАМН и ФГУ ННИИПК Рос-медтехнологий. Проведение исследования было одобрено Этическими комитетами обоих учреждений. В исследование были включены мужчины с ангиографически верифицированным коронарным атеросклерозом и стабильной стенокардией напряжения II-IV ФК, которые поступили в клинику ФГУ ННИИПК Росмедтехнологий на операцию коронарного шунтирования. Всеми пациентами заполнялась форма Информированного согласия на участие в исследовании.
В ходе операции при наличии интраопераци-онных показаний у 54 пациентов была проведена эндартерэктомия из коронарной артерии. Каждый из 54 материалов эндартерэктомии, содержащий фрагменты интимы/медии коронарной артерии, был разделен на 3-4 фрагмента для проведения гистологических и биохимических исследований.
Гистологический анализ фрагментов интимы/ме-дии коронарных артерий после макроскопического описания (распространенность бляшки, степень сте-нозирования просвета артерии, кровоизлияния в структуры бляшки, наличие обызвествления, тромбов) и стандартной окраски гематоксилин-эозином и Ван Гизон проводился на бинокулярном микроскопе Axiostar Plus (C. Zeiss). Из 162 фрагментов интимы/медии условно неизмененная ткань интимы была детерминирована в 19 случаях, липидное пятно/полоска - в 23, стабильная молодая атероскле-ротическая бляшка - в 34, стабильная бляшка с фи-брозом/кальцинозом - в 41, нестабильная бляшка со склонностью к изъязвлению или разрыву - в 45. У нестабильных бляшек был определен тип нестабильности: 1) фиброатерома с массивным липид-ным ядром и тонкой фиброзной покрышкой (липидный тип) - 14 образцов; 2) бляшка с повышенным
содержанием протеогликанов, воспалительными или липидными эрозивными повреждениями в покрышках (воспалительно-эрозивный тип) - 16; 3) бляшка с кальцинированным ядром, выраженными дистрофическими изменениями и некрозами в покрышках (дистрофически-некротический тип) - 15 образцов.
Для проведения биохимических исследований замороженные в жидком азоте фрагменты были гомогенизированы при температуре 4°С в растворе фосфатно-солевого буфера, рН 7,4. Измерение белка в гомогенатах проводили по методу Лоури, расчёт биохимических показателей производился относительно белка. Методом иммунофермент-ного анализа с использованием наборов ELISAs в гомогенатах определяли уровни ФНО-альфа, ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18 (BCM Diagnostics наборы), С-реактивного белка (высокочувствительный метод, вчСРБ) (Bender Medsystems наборы), MCP-1, EMAP-II (BCM Diagnostics наборы), sICAM-1 и sVCAM-1 (Bender Medsystems наборы), ТИМП-1, ММП-3, ММП-7 и ММП-9 (BCM Diagnostics наборы) и эндотелина-1 (Biomedica наборы).
Статистическую обработку результатов проводили в программе SPSS for Windows (версия 11,5), используя критерий статистической достоверности - р <0,05.
Результаты и обсуждение
Некоторые исследованные нами ранее из перечисленного выше комплекса провоспалительных, деструктивных биомаркеров и хемоаттрактантов были определены как значимые для стадии развития нестабильной атеросклеротической бляшки [20]. Согласно результатам наших исследований, стадия развития нестабильной бляшки в сравнении с другими стадиями развития атеросклеротиче-ского очага (липидное пятно, стабильные молодая и фиброзная бляшки) характеризуется наибольшими концентрациями интерлейкинов ИЛ-6 и ИЛ-8 (15,9±1,1 нг/мг белка и 37,1±4,8 пг/мг белка, соответственно), хемоаттрактантов MCP-1 и EMAP-II (401,7±39,8 и 2007,8±189,5 пг/мг белка, соответственно), деструктивных ММП-7 и ММП-9 (2,31±0,2 и 6,2±0,6 нг/мг белка, соответственно) и сниженным содержанием ТИМП-1 (117,2±11,3 нг/мг белка) [20].
Результаты сравнительного исследования уровней воспалительных, деструктивных биомаркеров и хемоаттрактантов в бляшках с разными типами нестабильности показали (таблица), что в бляшках воспалительно-эрозивного типа концентрации воспалительных биомаркеров ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18 и хемоаттрактантов MCP-1, EMAP-II выше в сравнении с дистрофически-некротическим типом в 3,2, 2,2, 2,7, 2,8, 3,7 и 1,3 раза, соответственно (p<0,05).
Повышенные концентрации воспалительных ци-токинов ИЛ-6 и ИЛ-8 и хемоат-трактантов MCP-1
Таблица. Содержание воспалительных биомаркеров, хемоаттрактантов и деструктивных биомаркеров в нестабильных атеросклеротических бляшках разных типов (М±т).
1. 2. Бляшка с 3. Бляшка с
Показатели Фиброатерома, воспалением, кальцинозом, * р<0,05
п=14 эрозией, п=16 некрозом, п=15
ИЛ-1, пг/мг белка 8,1±1,3* 7,6±1,2* 2,4±1,1 1,2 vs 3
ФНО-альфа, пг/мг 2,3±0,2 2,6±0,2 3,9±0,4* 3 vs 1,2
ИЛ-6, нг/мг 27,6±2,4* 14,2±1,3* 6,3±0,6 1,2 vs 3
ИЛ-8, пг/мг 58,9±5,4* 56,1±5,4* 20,9±2,1 1,2 vs 3
ИЛ-18, пг/мг 9,4±1,3* 8,6±1,2* 3,1±1,1 1,2 vs 3
вчСРБ, нг/мг 2,2±0,2 2,2±0,2 2,5±0,3 р>0,05
МСР-1, пг/мг 470,6±41,6* 598,0±54,1* 159,7±13,8 1,2 vs 3
ЕМАР-11, пг/мг 2099,3±197,0 2180,4±200,1* 1701,1±165,5 2 vs 3
sICAM-1, нг/мг 85,4±8,3 88,7±8,5 82,4±8,9 р>0,05
sVCAM-1, нг/мг 145,2±10,3 152,2±12,4 149,1±13,3 р>0,05
ТИМП-1, нг/мг 147,4±11,8 151,0±15,0 103,0±9,5* 3 vs 1,2
ММП-3, нг/мг 1,7±0,1 2,1±0,2 2,0±0,2 р>0,05
ММП-7, нг/мг 3,3±0,3* 2,1±0,2 1,3±0,1 1 vs 2,3
ММП-9, нг/мг 6,0±0,5 5,1±0,5 6,5±0,6 р>0,05
Эндотелин-1, пг/мг 1,4±0,2 1,6±0,2 3,1±0,6* 3 vs 1,2
Примечание: » - статистически достоверное различие между показателями соот-ветствующих групп (р<0,05)..
и ЕМАР-11 в нестабильных бляшках воспалительно-эрозивного типа отражают наиболее выраженную активность острого воспалительного процесса и реакций тканевого повреждения, сопровождающихся повышенным хемотаксисом моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и Т-лимфоцитов.
Однако повышенная воспалительная активность нами была выявлена и в нестабильных бляшках ли-пидного типа. Так, уровни воспалительных цитоки-нов ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18 и хемоаттрактан-та МСР-1 в них оказались также выше в сравнении с дистрофически-некротическим типом в 3,4, 4,4, 2,8, 3,0 и 2,9 раза (р<0,05), соответственно. Полученные данные указывают на наличие воспалительной активности в нестабильных бляшках не только воспалительно-эрозивного типа, но и липидного типа. Кроме того, в нестабильных бляшках липидного типа обнаружена наибольшая концентрация ММП-7, которая оказалась выше в 1,6 и 2,5 раза (р<0,05), чем в бляшках воспалительно-эрозивного и дистрофически-некротического типов.
Отличительными особенностями нестабильных бляшек дистрофически-некротического типа в сравнении с липидным и воспалительно-эрозивным типами оказались повышенный уровень ФНО-альфа (в 1,7 и 1,5 раза, соответственно, р<0,05), сниженный уровень ТИМП-1 (в 1,4 и 1,5 раза, соответственно, р<0,05) и повышенный уровень эндотелина-1 (в 2,2 и 1,9 раза, соответственно, р<0,05), что от-
ражает наличие повышенных деструктивных изменений в бляшках этого типа нестабильности. Действительно, сниженное содержание ТИМП-1 (ингибитора деструктивных ММП) и повышенные уровни деструктивных биомаркеров - ФНО-альфа и эндотелина-1 (биомаркера деструкции эндоте-лиоцитов) в нестабильных бляшках дистрофически-некротического типа свидетельствует о большей потенциальной возможности ферментативной и неферментативной деструктивной активности в бляшках этого типа. Повышенная же активность деструкции соединительнотканного матрикса в фиброзных покрышках нестабильных бляшек приводит к истончению и разрыву покрышек нестабильных бляшек и развитию острого коронарного синдрома [1-4].
Несмотря на ранее полученные нами результаты о характерном для нестабильных бляшек повышенном уровне ММП-9 [20], по уровням ее активности каких-либо значимых различий между тремя типами нестабильных бляшек выявлено не было. С другой стороны, полученные данные о повышенной концентрации ММП-7 (матрилизин, разрушающий протеогликаны, фибронектин, ламинин, версикан и др. [13, 18]) в нестабильных бляшках липидного типа, которая, кроме собственной активности, еще является активатором про-ММП-9, свидетельствует о значимом вкладе именно этого деструктивного фермента в формирование указанного типа нестабильности атеросклеротических очагов.
Корреляционный анализ выявил наличие выраженной связи исследуемых параметров деструктивной и воспалительной активности в атероскле-ротических очагах. Показаны корреляционные связи (р<0,01) уровня ММП-9 с ИЛ-6 (коэффициенты Пирсона и Кендалла, соответственно, 0,421 и 0,318), ИЛ-8 (0,337 и 0,291), МСР-1 (0,389 и 0,397), ЕМАР-11 (0,334 и 0,297). Подобный характер корреляционных связей с уровнями провос-палительных цитокинов обнаружен и для ММП-7. Выявлены корреляционные связи уровня ММП-3 с ФНО-альфа (0,541 и 0,487, р<0,01) и с ИЛ-1-РА (-0,277 и -0,307, р<0,05). Значимые (р<0,01) корреляции показаны для ТИМП-1 с параметрами активности воспалительного процесса - ФНО-альфа (-0,230 и -0,182), ИЛ-6 (-0,227 и -0,189), ИЛ-8 (-0,249 и -0,225), МСР-1 (-0,371 и -0,303) и уровнем ИЛ-1-РА (0,512 и 0,364).
Полученные результаты сравнительного исследования биомаркеров активности воспалительно-деструктивного процесса в разных типах нестабильности атеросклеротических очагов позволили выявить его особенности, характерные для разных типов нестабильных бляшек. Так, из 3-х типов нестабильных бляшек не только для воспалительно-эрозивного, но и для липидного типа характерна повышенная воспалительная активность (повышенные концентрации ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18 и МСР-1) в сравнении с дистрофически-некротическим типом, при котором доминирующей является повышенная деструктивная активность (повышенные концентрации ФНО-альфа, эндотелина-1 и сниженный уровень ТИМП-1).
Списоклитературы
1. AmbroseJA, Srikanth S. Vulnerable plaques and patients: improving prediction of future coronary events. //Am. J. Med, 2010; 123:10-16.
2. Shah PK. Cellular and molecular mechanisms of plaque rupture. / High-risk atherosclerotic plaques: mechanisms, imaging, models, and therapy. Edited by LM. Khachigian.//CRC Press, New York, 2005; 1-19.
3. Shah PK., Sharifi B. Insights into the Molecular Mechanisms of Plaque Rupture and Thrombosis. //Biochemistry of Atherosclerosis, edited by SK. Cheema, Springer, New York, 2006; 455-563.
4. Holschermann H., Tillmanns H., Bode C. Pathophysiology of acute coronary syndrome.// Hamostaseologie, 2006; 2———6:99-103.
5. Moreno PR. Vulnerable plaque: definition, diagnosis, and treatment. // Cardiol. Clin., 2010; 28:1-30.
6. Waksman R., Seruys P.W. Handbook of the vulnerable plaque. //London, 2004, p. 1-48.
7. SchaarJA., Muller JE., Falk E. et al. Terminology for high-risk and vulnerable coronary artery plaques. //Eur. Heart J, 2004,25: 1077-1082.
8. Sadeghi1 ММ, Glover DK., Lanza GM. et al. Imaging Atherosclerosis and Vulnerable Plaque.//J. Nucl. Med, 2010; 51(Suppl 1): 51S-65S.
9. Puddu GM., Cravero E., Arnone G. et al. Molecular aspects of atherogenesis: new in-sights and unsolved questions.//J. Biomedical Science, 2005,18:373-388.
10. Virmani R, Burke AP, Farb A, Kolodgie FDD. Pathology of the vulnerable plaque. //J. Am. Coll. Cardiol., 2006; 47 (8 Suppl): C13-C18.
11. Shah PK., Wang L., SharifiB. New insights into molecular mechanisms of plaque insta-bility.//Atherosclerosis, 2006, 7:156157.
12. Braunersreuther V., MachF, Steffens S. The specific role of chemokines in atherosclero-sis.//Thromb.Haemost., 2007;97: 714-721.
13. Wang X, Connolly TM. Biomarkers of vulnerable atheromatous plaques: translational medicine perspectives. //Adv. Clin. Chem, 2010; 50: 1-22.
14. Schwarz MA, Zheng H., Liu J. et al. Endothelial-monocyte activating polypeptide II al-ters fibronectin based endothelial cell adhesion and matrix assembly via alpha5 beta1 in-tegrin.//Exp. Cell Res., 2005; 311:229-239.
15. Bui Q.T, Prempeh M., Wilensky RL. Atherosclerotic plaque development. //Int. J. Bio-chem. Cell Biol., 2009; 41:2109-2113.
16. Daskalopoulou SS., DaskalopoulosME., Theocharis S. et al. Metallothionein expression in the high-risk carotid atherosclerotic plaque.//Curr.Med.Res. Opin, 2007;23:659-670.
17. Katsuda S., Kaji T. Atherosclerosis and extracellular matrix.//J. Atheroscler Thromb., 2003,10:267-274.
18. Newby A.C. Dual role of matrix metalloproteinases in intimal thickening and atheroscle-rotic plaque rupture. //Physiol. Rev., 2005, 85: 1-31.
19. Naghavi M., Libby P., Falk E. et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient. A callfor new definitions and risk assessment strategies: part I. // Circulation, 2003; 108:1664-1672.
20. Рагино ЮИ, Чернявский АМ, Полонская ЯВ. и соавт. Изменение содержания провоспалительнъх цитокинов и деструктивнъх металлопротеиназ в процессе раз-вития атеросклеротического очага до нестабильной бляшки. //Кардиология, 2009;6:43-50.
