CC BY
35
УДК 543.545.2
*
Е.В. Сокрута, А.В. Калистратова , Л.В. Коваленко
ФГБОУ ВО Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 *a.kalistratova@inbox.ru
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ДЕСТРУКЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ С АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Разработана методика качественного и количественного анализа продуктов гидролитической деструкции таких фосфорорганических веществ с антихолинэстеразной активностью, как диизопропилфосфорная кислота (ДИПФ), циклогексилметилфосфоновая кислота (ЦГМФ) и метилфосфоновая кислота (МФК) методом капиллярного электрофореза.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, гидролитическая деструкция, капиллярный электрофорез.
Синтетические фосфорорганические соединения (ФОС) широко используются в качестве биологически активных веществ, в частности, они находят применение в сельском хозяйстве и в медицине. Некоторые эфиры фосфорной кислоты с комплексообразующей способностью используются в промышленности и в металлургии [1]. Среди синтетических фосфорорганических веществ с биологической активностью следует отметить соединения с антихолинэстеразной активностью (дихлофос, хлорофос) [2]; с противовирусной активностью (фосфонукусная и фосфонмуравьиная кислоты) [3]; с противоостеопорозной активностью (бисфосфонаты) [4] и с противораковой активностью (циклофосфамид) [4]. Все эти области применения требуют организации контроля за содержанием данных ФОС и продуктов их деструкции (термической, химической или биохимической) на этапах их производства, применения и утилизации, поэтому разработка методов идентификации ФОС и продуктов их превращений является актуальной задачей.
Для решения данной проблемы хорошо подходит метод капиллярного электрофореза (КЭ) [5]. Он основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Данный метод отличается высокой эффективностью, селективностью по отношению к анализируемым веществам, доступностью вспомогательных реактивов и экспрессностью.
Наша задача состояла в разработке методики качественного и количественного анализа продуктов гидролиза ФОС с антихолинэстеразной активностью методом капиллярного электрофореза. Работа проводилась на системе капиллярного электрофореза «Капель-105М» фирмы «ЛЮМЕКС» с капилляром длиной 60 см, и диаметром 75 мкм. Методом КЭ были проанализированы полученные нами продукты гидролитической деструкции фосфорорганических веществ с фосфорилирующей способностью (диизопропилфторфосфат,
фторангидриды моноэфиров метилфосфоновой кислоты и др.), в частности, исследовались
метилфосфоновая кислота (МФК),
циклогексилметилфосфоновая кислота (ЦГМФ) и диизопропилфосфорная кислота (ДИПФ) (рис. 1).
н3с
ьис о
\ //
у "он
но
Метилфосфоновая кислота
н3с
\ /
-о о
v:
сн3
Диизопропилфосфорная кислота
)-О О
\//
/ ^он
н3с
Цшагогекси лмети л ф осфоновая кислота
Рис. 1. Структурные формулы фосфорорганических отравляющих соединений
Анализ анионов методом КЭ требует обращения полярности внутренней поверхности кварцевого капилляра, что достигается путем введения в буфер катионных ПАВ. В связи с этим нами были рассмотрены различные концентрации
цетилтриметиламонний бромида (ЦТАБ) в используемом для ЭФ буфере. Сравнение проводили по стандартному раствору диизопропилового эфира фосфорной кислоты с концентрацией 500 мг/л. Полученные электрофореграммы (ЭФГ) представлены на рис. 2. Оптимальная минимальная концентрация ЦТАБ, позволяющая осуществлять воспроизводимый анализ за приемлемое время соответствует 0,1 мМ.
Дальнейшее снижение его содержания в растворе приводит к отсутствию проявления сигнала искомой кислоты на ЭФГ.
2 3 4 Б
Рис. 2. Подбор оптимальной минимальной концентрации ЦТАБ в буфере
Так как ФОС не поглощают в используемом для детектирования УФ-диапазоне, был применен метод косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора. Для подбора оптимального хромофора было проведено сравнение эффективности следующих компонентов: сорбиновая, аскорбиновая и бензойная кислоты (таблица 1).
Таблица 1. Подбор оптимального хромофора для косвенного анализа производных фосфорорганических
кислот
В качестве оптимального хромофора была выбрана сорбиновая кислота, так как ее использование обеспечило меньшее время выхода анализируемого компонента и максимальные высоту и площадь пика, определяющие чувствительность методики.
Одной из проблем, возникшей во время работы, оказался подбор рН буфера, так как рКа соответствующих производных метилфосфоновой кислоты, диэфира фосфорной и сорбиновой кислот лежат в достаточно широком диапазоне значений от 3 до 7.5. При этом рН буфера должен обеспечить условия, при которых все компоненты смеси находятся в однозарядной форме. Такой результат для выбранных в исследовании веществ был достигнут при значении рН равном 5,0 (рис. 3).
- рН = 7
- рН = б
- рН = 5
.МФК
Рис. 3. Подбор оптимального рН буфера
Для того чтобы разделить пики, соответствующие ЦГМФ и ДИПФ, в буфер были добавлены такие органические компоненты, как спирты (метанол, этанол, изопропанол, трет-бутанол), а также амины и ацетонитрил (рис. 4). Тем не менее, введение данных компонентов не оказало существенного влияния на электрофоретическую подвижность анализируемых анионов и сигналы ЦГМФ и ДИПФ. Использование данных модификаторов не позволило получить разделение до базовой линии.
—10 % Метанол
а
— 10% Ацетонитрил
— 20 мМ Диэтиламин
.МФК ЦГМФ
б
Рис. 4. Влияние модификаторов буфера на разделение компонентов смеси: а). Влияние спиртов; б) влияние ацетонитрила и диэтиламина.
Оптимальный результат разделения был достигнут при использовании в качестве модификатора моноэтаноламина (МЭА) (рис. 6). Буфер состава 5 мМ сорбиновой кислоты, 0,1 мМ ЦТАБ, 6мМ МЭА, метанол:вода 4:6, рН = 5,0 обеспечивает полное разделение трехкомпонентной смеси при температуре 25°С и напряжении 20кВ за 8 мин.
Хромофор Длина волны, нм Время выхода, мин Высота пика, о.п. Площадь пика, о.п.
Сорбиновая кислота 254 2,692 42,791 818,3
Бензойная кислота 254 2,993 3,264 100,2
Аскорбиновая кислота 243 3,318 15,747 411,4
Разработанная методика качественного и количественного анализа производных фосфорной и фосфоновой кислот может служить основой для создания методик анализа других
фосфорорганических веществ, обладающих биологической активностью, например,
фосфорорганических антибиотиков, бисфосфонатов, фосфорорганических инсектицидов,
противовирусных фосфорорганических средств и гербицидов с антиметаболитным механизмом действия (глифосат, глюфосинат).
Сокрута Евгения Витальевна, студентка 4-го курса кафедры Химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Калистратова Антонида Владимировна ассистент кафедры Химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Коваленко Леонид Владимирович д.х.н., проф., зав. кафедрой кафедры Химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Кузьмина Р.И., Денисов Н.С., Денисов С.Н., Угланова В.З. К вопросу выбора дериватизирующего агента при переводе метилфосфоновой кислоты и ее О-алкиловых эфиров в хроматографируемые производные//Изв. Сарат. ун-та. Нов.сер. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2015. - Т. 15. - Вып. 2. -С.34 - 38.
2. Коваленко Л. В., Ощепков М.С., Соловьева И.Н. Химия и биологическая активность фосфорорганических соединений/ учеб.пособие - М. : РХТУ им. Д. И. Менделеева. - 2015. - С. 100 -109.
3. Мурабулдаев А.М. Синтез производных фосфонтиокарбоновых кислот и модифицированных нуклеотидов с потенциальной противовирусной активностью. - Москва. - 2004. - С. 5-7.
4. Орлова Р.В., Тюкавина Н.В.Бисфосфонаты в системе паллиативного лечения костных метастазов//материалы 7-ой ежегодной Российской онкологической конференции. - Москва. - 2003. -С. 10-18.
5. Harstad R.K., Johnson A.C., Weisenberger M.M., Bowser M.T. Capillary Electrophoresis // Analytical Chemistry. - 2016. - V.88. - P. 299 - 319.
SokrutaEvgeniya Vital'evna, Kalistratova Antonida Vladimirovna*, Kovalenko Leonid Vladimirovich
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: a.kalistratova@inbox.ru
THE DEVELOPMENT OF ANALYSIS OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS WITH ANTIHOLINESTERASE ACTIVITY DEGRADATION PRODUCTS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
Abstract
Мethod of qualitative and quantitative analysis of hydrolytic degradation products of organophosphorus substances with anticholinesterase activity by capillary electrophoresis has been developed.
Key words: organophosphorus compounds, hydrolytic destruction, capillary electrophoresis
--
в 7 Я
Рис. 6. Электрофореграмма смеси, полученная с оптимальным составом буфера (сорбиновая кислота 5 мМ, ЦТАБ 0,1 мМ, МЭА 6мМ, МеОН : Н2О 4:6, рН 5)
