Биохимическая оценка активности антиоксидантной системы овса при воздействии фосфорсодержащих поллютантов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

- в интервале соотношений ТЭ0С-^Н20 от 1 -^3 до 1 -=-20 продолжительность инкубационного периода созревания геля при прочих равных условиях наименьшая и составляет 22 - 26 минут.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Шабанова Н.А., Саркисов П.Д. Основы золь-гель техноло-

гии нанодисперстного кремнезема. - М.: ИКЦ Академкнига, 2004. - 208 с.

2. Кодинцева ЕЮ. и др. Влияние начальных условий на кине-

тику гелеобразования в гидрозолях кремнезема//Кол. жур,-1990. - Т 52. - № 3. - С. 553 - 558.

3. Демская ЭЛ., Соколова А.П., Хотимченко B.C. Исследова-

ние физико-химических свойств гель-стекол на основе татраэтоксида кремния // Физика и химия стекла.-1991,-Т 17. -№3,- С. 109 - 113.

О.М. Плотникова

Курганский государственный университет, И.В. Дуплякина, A.M. Корепин

Региональный центр по ОУХО Курганской области

БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ОВСА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФОСФОРСОДЕРЖАЩИХ ПОЛЛЮТАНТОВ

Аннотация: Для биохимической оценки антиоксидантной системы растений в работе исследовано влияние метилфос-фоновой кислоты и дигидрофосфата на активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы в листьях овса посевного с использованием водных культур.

В результате выполненной работы найдено, что биохимические показатели АОС в листьях овса посевного - ферменты пероксидаза, полифенолоксидаза и каталаза - дали хороший отклик на избыток неорганического (дигидрофосфатов) и органического (метилфосфоновой кислоты) фосфора и в перспективе могут быть использованы в качестве биохимических маркеров загрязнения компонентов природной среды фосфорсодержащими поллютантами. Найдено, что при увеличении концентрации фосфатов значимо изменяется активность полифенолоксидазы (существенно повышается) и активность каталазы (существенно понижается). При действии МФК в ряду концентраций от 10-3 до 10-18 М выявлен "эффект сверхмалых доз": максимальные изменения активности ферментов обнаружено при концентрациях МФК 10-4-10-5 М и 10-15-10-18 М: пероксидаза при этих концентрациях МФК имеет максимальную активность, а полифенолоксидаза - минимальную, а в области концентраций МФК 10-9-10-1 ОМ изменение активности ферментов по сравнению с контролем практически отсутствует.

Ключевые слова: антиоксидантная активность, фосфорсодержащие поллютанты, метилфосфоновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Система факторов антиоксидантной защиты является одной из важнейших среди систем, направленных на поддержание целостности организма и химического постоянства его внутренней среды. Антиоксиданты регулируют процессы свободнорадикального окисления, создают оптимальные условия для нормального метаболизма. К ним относятся: ферменты антиоксидантной защиты - супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза; некоторые белки - альбумин, ферритин; низкомолекулярные соединения - стероиды, убихиноны, фосфолипиды, мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбат, билирубин, токоферолы [9].

Изменение активности антиоксидантной системы растений происходит при многих патологических процессах, а также при различных видах внешних воздействий, в том числе при действии на живые организмы фосфорсодержащих поллютантов и ксенобиотиков [5].

Фосфорсодержащими загрязняющими веществами (поллютантами) могут стать при избыточном применении фосфорсодержащие удобрения, широко применяемые в сельском хозяйстве. Длительное применение высоких доз фосфорных удобрений показало, что существенная их часть накапливается в почвах в легкорастворимой форме в значительных количествах (600-1000 мг/кг почвы) и происходит так называемое зафосфачивание почв. Процесс поглощения почвами фосфатов удобрений медленный, однако в условиях дефицита фосфорных удобрений происходит мобилизация фосфатов почв при постепенной переходе трудно растворимых фосфатов в более растворимые.

Наряду с удобрениями источником фосфорного загрязнения почв и вод являются фосфорсодержащие пестициды - как гербициды, так и инсектициды. Из фосфорсодержащих гербицидов в сельском и лесном хозяйстве широко используется дешевый и доступный глифосат. Микроорганизмы достаточно быстро и полно разлагают глифосат в почвах в аэробных и анаэробных условиях с образованием аминометилфосфонатов. Период разложения (от месяца до года) зависит от доз внесения и типов почв. Важнейшими из инсектецидов являются фос-форорганические инсектициды, которые отличаются высокой активностью при умеренных нормах расхода, широким спектром действия на вредителей, относительно быстрым разложением в окружающей среде с образованием нетоксичных продуктов [7]. В ассортименте постоянно имеется 70-80 фосфорорганических инсектицидов, это эфиры, тиоэфиры, эфироамиды фосфорной, тио- и дитиофосфорной и фосфоновой кислот общей формулы РР'Р(Х)У, где Р и Р' - алкил, алкоксил (СНэО- или С2Н50-, реже С3Н70-), алкилтио- или алкиламиногруппы; Х - это О или Э; У - группа, способная отщепляться при гидролизе. Например, к группе тиофосфатов относятся паратион (тиофос), метилпаратион (метафос), диазинон (базудин); в больших масштабах применяют малатион (карбофос), инсектоакарицид фозалон (один из важнейших заменителей ДДТ). Наибольшее практическое значение среди фосфатов имеют ДДВФ или дихлорфос и налед (Р = Р' = СНэО-, X = О, У= СН=СС12, и У = СНВгСС12Вг, соответственно) - это контактные инсектициды, применяемые как средство против бытовых насекомых, для обработки садов, огородов, зернохранилищ. Большинство фосфорорганических инсектицидов действует на нервную систему насекомых, ингибируя путем фосфорилирования фермент ацетилхолинэстеразу (АХЭ), который теряет способность гидролизовать ацетилхолин, участвующий в передаче нервного импульса через синапсы. Многие фосфороргани-ческие инсектициды, содержащие связи Р=Э и Р-1МНСОСН3, под действием ферментов оксидаз окисляются, превращаясь в более сильные ингибиторы АХЭ, а под действием фосфатаз, карбоксиэстераз, карбоксиамидаз гидролизуются до фосфорных или фосфоновых кислот, утрачивая при этом способность ингибировать АХЭ.

К наиболее токсичным ксенобиотикам относятся фосфорорганические отравляющие вещества (ФОБ), образующие при детоксикации фосфонаты. К фосфонатам относятся и метилфосфоновая кислота (МФК), ее эфиры и соли, которые являются конечными продуктами гидролиза ФОБ зарина (фторангидрид изопропилового эфира МФК), зомана (фторангидрид пинаколилового эфира) и \/х-газов (О-этиловый 3-2-(М,1М-диизопропиламино)этило-вый эфир МФК). Алкилфосфоновые кислоты и их соли яв-

ляются устойчивыми в природных средах соединениями и обнаруживаются в почвах спустя десятилетия. Так, МФК была обнаружена через 10 лет после загрязнения сухой почвы на полигоне Дагуэй, а диизопропилметилфосфо-нат - в грунтовых водах на территории арсенала Рокки-Маунтин (США) [10].

Метилфосфонаты, согласно литературным данным, характеризуются низкой токсичностью [1], однако их влияние на живые организмы остается мало изученным. Изучение влияния МФК на активность антиоксидантной системы является особенно важным, так как фосфонаты имеют малополярную С-Р связь и поэтому могут вступать в цепи свободнорадикальных процессов, а по пространственному строению и силе кислоты МФК схожа с фосфорной кислотой. Метилфосфоновая кислота может появиться в природных средах в период работы объектов по уничтожению химического оружия (УХО) с ФОВ (г Щучье Курганской области, п. Марадыковский Кировской области и др.) [2].

Показатели активности антиоксидантной системы (АОС) растений могут являться индикаторами антропогенного воздействия на живые организмы, поэтому целью данного исследования стало изучение активности ферментов АОС овса посевного на загрязнение фосфорсодержащими поллютантами.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для биохимической оценки антиоксидантной системы растений в работе была исследована активность ка-талазы и пероксидазы как ферментов, характеризующих способность организма трансформировать образующиеся в процессе метаболизма перекисные соединения, а также полифенолоксидаза как фермент, характеризующий окисление фенольных соединений и других аналогичных органических соединений.

В качестве приоритетных загрязняющих веществ в исследовании использованы метилфосфоновая кислота и фосфаты как конечный продукт разложения МФК в природных средах, что обосновано составом и технологией уничтожения ФОВ.

В качестве растительных объектов был выбран овес посевной (Avena sativa L.) как распространенная сельскохозяйственная культура и широко используемый тест-объект.

Исследования были проведены с использованием водных культур. Для проведения опытов была выбрана питательная смесь Хогланда-Снайдерса с рН=6,0 и семена овса сорта «Скакун», стерилизованные раствором перманганата калия. Для изучения влияния на антиок-сидантную систему загрязнения неорганическим фосфором в питательную среду добавляли дигидрофосфат калия и натриевую соль метилфосфоновой кислоты.

Для определения активности пероксидаз в листьях овса использовали метод А.Н. Бояркина, основанный на определении скорости окисления бензидина под действием фермента, содержащегося в растениях, до продукта окисления синего цвета определенной концентрации, устанавливаемой на фотоэлектроколориметре при л=650 нм. Для извлечения пероксидаз из растений использовали ацетатный буфер. Показания ферментативной активности снимали в фазах развития растений первого, второго и третьего листа. Определение активности полифенолоксидазы основано на измерении активности фермента по скорости окисления диметил-л-фенилен-диамина с образованием продукта окрашенного в сине-фиолетовый цвет [8]. Метод определения активности ка-талазы по методу М.А. Королюк состоит в способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [6].

Метод определения общего фосфора, предложенный Лоури и Лопесом, основан на переводе фосфора в раствор путем сжигания растительного материала смесью серной и хлорной кислот с последующей обработкой молибденовокислым аммонием в кислой среде. В присутствии аскорбиновой кислоты образуется восстановленный фосфорномолибденовый комплекс сложного состава, интенсивность синей окраски при 490 нм которого пропорциональна содержанию фосфат-ионов в растворе [4].

Определения массовой концентрации МФК в растениях проводили методом газовой хроматографии (ГХ). В результате чего были разработаны важнейшие этапы про-боподготовки природных образцов и изготовлен метана-тор - реактор для химического преобразования МФК в хро-матографируемую форму. Экспериментально показано, что применяемые методики дают точный и достоверный результат определения массового содержания МФК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения влияния на антиоксидантную систему загрязнения неорганическим фосфором в питательную смесь вносилось определенное количество КН2РО4 (в пересчете на Р2О5 , ПДК Р2О5 - 200,0 мг/кг согласно «Перечню предельно допустимых концентраций и ориентировочно допустимых количеств химических веществ в почве ГН 6229-91») по схеме 1.

Данные сравнительного анализа по влиянию метилфосфоновой кислоты на антиоксидантную систему овса в виде относительных активностей пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы, приведенные на рис. 1, показывают, что:

1. Внесение МФК оказывает влияние на активность ферментов по сравнению с контролем (вариант 1 - «растения на питательной смеси»):

а) активность пероксидазы значительно повышается;

б) активность полифенолоксидазы понижается;

в) активность каталазы изменяется по типу синусоиды.

2. При уменьшении концентрации МФК наблюдаются области явного влияния МФК на активность фермента - это область концентраций 10-4-10-5 М и область так называемых «сверх малых доз» 10-15-10-18М:

а) активность пероксидазы наивысшая при 10-3М МФК и понижается при уменьшении концентрации МФК до 10-8М, затем наблюдается повышение активности с относительным максимумом при концентрации МФК 10-15М;

б) активность полифенолоксидазы максимально низкая при концентрации МФК 10-4-10-5М, затем наблюдается повышение активности с относительным максимумом при концентрации МФК 10-10М и вновь максимальное понижение при 10-18М;

в) активность каталазы максимально понижена при концентрации МФК 10-5М, затем наблюдается повышение активности и при концентрации МФК 10-10-10-15М активность фермента максимальна.

Рассмотренные зависимости активностей ферментов от концентрации метилфосфоновой кислоты иллюстрируют эффект сверхмалых доз (СМД) или сверхмалых концентраций (СМК). При уменьшении концентрации вещества (на 1-3 порядка) эффект закономерно снижается, затем наступает «зона молчания», а далее при еще более низких концентрациях, отличных от первоначальных на 8-12 порядков, эффект возникает снова. К настоящему времени известны несколько гипотез о механизмах действия СМД, которые, однако, не позволяют получить единой картины этого явления, а описывают только отдельные особенности действия СМД [3].

№ варианта Модельная система Обозначение на диаграммах

1 Растения на питательной смеси (Контроль) п/с

2 Растения на питательной смеси + 1 ПДК Р2О5 1 ПДК

3 Растения на питательной смеси + 5 ПДК Р2О5 5 ПДК

4 Растения на питательной смеси + 10 ПДК Р2О5 ЮПДК

Для изучения влияния на антиоксидантную систему овса МФК в питательную среду вносилось определенное количество метилфосфоновой кислоты в виде ее натриевой соли по схеме опытов:

№ варианта Модельная система Обозначение на диаграмме

1 Растения на питательной смеси (Контроль) п/с

2 Растения на питательной смеси + 5*10" М МФК 5Е-3

3 Растения на питательной смеси +10" М МФК 1Е-3

4 Растения на питательной смеси + 5»10"4 М МФК 5Е-4

5 Растения на питательной смеси + 10"~ М МФК 1Е-5

6 Растения на питательной смеси + 10"6 М МФК 1Е-6

7 Растения на питательной смеси +10" М МФК 1Е-8

8 Растения на питательной смеси + 10"1иМ МФК 1Е-10

9 Растения на питательной смеси + 10"1" М МФК 1Е-15

10 Растения на питательной смеси +10" М МФК 1Е-18

1. Внесение дигидрофосфата калия оказывает влияние на активность ферментов:

а) активность полифенолоксидазы повышается при увеличении концентрации фосфатов;

б) активность каталазы понижается при увеличении концентрации фосфатов;

в) активность пероксидазы практически не изменяется;

2. Наибольшее влияние избыток фосфатов оказывает на активность полифенолоксидазы и каталазы, при 10 ПДК Р205, активность полифенолоксидазы в данной модельной системе максимальна, а каталазы - минимальна.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе на модельных системах изучено влияние важнейших для контроля в природной среде зон защитных мероприятий объектов УХО с ФОБ фосфорсодержащих поллютантов - дигидрофосфата калия, который хорошо растворим в воде и легко усваивается растениями и поэтому является источником доступного неорганического фосфора для растений, и метилфосфоновой кислоты, которая образуется при деструкции фосфороргани-ческих отравляющих веществ (зарина, зомана, \/х).

В результате выполненной работы найдено, что выбранные биохимические характеристики АОС в листьях овса посевного - ферменты пероксидаза, полифенолок-сидаза и каталаза - показали хороший отклик на избыток как неорганического фосфора (дигидрофосфатов), так и органического фосфора (метилфосфоновой кислоты). При увеличении концентрации фосфатов значимо изменяется активность полифенолоксидазы, которая существенно повышается, и активность каталазы, которая существенно понижается. При действии МФК различных концентраций выявлен «эффект сверхмалых доз»: максимальные изменения активности ферментов обнаружено при концентрациях МФК 10 4-10 5 М и 1015-10"18 М: пероксидаза при этих концентрациях МФК имеет максимальную активность, а полифенолоксидаза - минимальную, а в области концентраций МФК 10 э-1010М изменение активности ферментов по сравнению с контролем практически отсутствует.

Анализ полученных экспериментальных данных для

%

80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 -20,0 -40,0

Шн

□ Пероксидаза

■ Полифенолоксидаза

□ Каталаза

5Е-3 1Е-3 5Е-4 1Е-5 1Е-6 1Е-8 1Е-10 1Е-15 1Е-18

Рис. 1. Сравнительный анализ активностей ферментов в модельных системах относительно контроля («растения на питательной смеси») при различном содержании МФК

Данные по активности ферментов в модельных системах относительно контроля при различном содержании КН2Р04 показаны на рис. 2.

% 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 -20,0 -40,0 -60,0

I

п Пероксидаза

■ Полифенолоксидаза

п Каталаза

1ПДК

5ПДК

юпдк

Рис. 2. Активность ферментов в модельных системах относительно контроля («растения на питательной смеси») при различном содержании КН2Р04 (в пересчете на Р205)

Анализ влияния дигидрофосфата калия на антиоксидантную систему овса в виде сравнения относительных активностей пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы показывает, что:

модельных систем позволяет сделать вывод, что активность ферментов антиоксидантной системы может быть использована в качестве биохимического маркера загрязнения фосфорсодержащими поллютантами. Неоспоримая ценность полученных результатов состоит в том, что они могут стать основой для внедрения в систему эко-токсикологического контроля за состоянием компонентов природной среды по биохимическим показателям живых организмов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров В.Н., Емельянов В.И. Отравляющие вещества. - М.: Военное изд - во, 1990.

2. Андреева В.А. Фермент пероксидаза: Участие в защитном механизме растений.-М..Наука, 1988.

3. Булатов S.S., Хохоев Т.Х., Дикий В.В. и др. Проблема малых и сверхмалых доз в токсикологии. Фундаментальные и прикладные аспекты//Рос.хим.ж.-2002. -m.XLVI. -№6. -С.58-62.

4. ГОСТ 26206-84. Определение подвижных форм фосфора и калия по методу Ониани в модификации ЦИНАО.

5. Квеситадзе Г.И. Метаболизм антропогенных токсикантов в высших растениях.-М..Наука, 2005.

6. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.О. и др. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело,- 1988. -№1. -С. 16-19.

7. Лунев М.И. Пестициды и охрана агрофитоценозов. - М.: Колос, 1992.

8. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М.: Колос, 1976.

9. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов.-СПб: П/ЮРД, 2004.

10. Савельева Е.И., Зенкевич И.Г., Кузнецова Т.А. и др. Исследование продуктов превращений фосфорорганических отравляющих веществ методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии //Рос.хим.ж,- 2002. -m.XLVI. -№6. -С.82-91.

О.М. Плотникова, А.П. Ларионова, H.H. Матвеев Курганский государственный университет

ИЗМЕНЕНИЕ БИОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ AVENA SATIVA ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ПОЧВЫ ИОНАМИ ЖЕЛЕЗА И ЦИНКА

Аннотация: Техногенная деятельность человека приводит к повышенному содержанию в почве как макроэлементов, так и микроэлементов. В норме элементы минерального питания выполняют структурную, метаболическую и регуляторную функции. Избыточное поступление в растение железа и цинка оказывает токсическое действие, проявляющееся в виде окислительного стресса [4]. При этом возникают активные формы кислорода (АФК), изменяется состояние энзиматической антиоксидантной защитной системы. Выявление взаимосвязи между степенью загрязненности почвы и изменениями биометрических показателей, а также антиоксидантной системы может быть положена в основу нового метода индикации загрязнения почвы железом и цинком.

Цель исследования - изучить влияние различных концентраций ионов железа и цинка на изменение биометрических показателей, активности ферментов антиоксидантной системы овса посевного (Avena sativa).

Ключевые слова: биометрические показатели, активные формы кислорода, антиоксидантная активность

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Для изучения влияния загрязнения ионами железа и цинка в питательную среду Хогленда - Снайдерса в соответствии со схемой эксперимента вносилось определен-

ное количество сульфата цинка и цитрата железа. ПДК ионов цинка Ъп2* составляет 23 мг/кг (согласно «Перечню предельно допустимых концентраций и ориентировочно допустимых количеств химических веществ в почве ГН 622991»), средняя рассчитанная концентрация СРК (для почв Щучанского района) подвижных форм ионов Ре3+- 90 мг/кг. Солома использовалась в качестве сорбента, вносилась из расчета 1 г на 100 мл питательной среды.

В сосуд наливали по 400 мл питательной среды Хогленда - Снайдерса, отмечая уровень жидкости (количество питательной смеси поддерживалось на данном уровне), рН среды 6,0. В каждую бутылку помещалось по 4 патрона с семенами овса сорта «Скакун». Ежедневно в течение 20 минут проводилась аэрация растворов воздухом [1].

При проведении эксперимента отмечают сроки наступления фаз, этапов развития растений. В ходе эксперимента определяли длину, воздушно сухую массу 30 растений. Повторность определений четырехкратная.

Определение активности каталазы проводили методом М.А. Королюк [2], пероксидазы и полифенолокси-дазы - по методу А.Н. Бояркина [3].

Таблица 1

Схема эксперимента

№ Варианты опыта Обозначение на диаграммах

1 Питательная среда контроль*

2 Питательная среда + солома к* + с**

3 Питательная среда + 0,5 СРК Ре,+ 0,5 СРК Fe

4 Питательная среда + 1 СРК Ре3+ 1 СРК Fe

5 Питательная среда + 5 СРК Ре,+ 5 СРК Fe

6 Питательная среда + солома + 5 СРК Ре,+ 5 СРК Fe + с

7 Питательная среда + 0,5 ПДК йг+ 0,5 пдкгп

8 Питательная среда + 1 ПДК йг+ 1 ПДК&1

9 Питательная среда + 5 ПДК йг+ 5ПДК&1

10 Питательная среда + солома + 5 ПДК Ъп1+ 5 ПДК Zn+c

к* - контроль (питательная среда); с** - солома.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ влияния цинка и железа на биометрические показатели овса посевного выявляет действие повышенных концентраций ионов в вариантах без внесения соломы (рис. 1).

% 20,0 10,0 0,0 -10,0 -20,0 -30,0 -40,0 -50,0 -60,0 J

■ 1 -4,0 1

I ■Л»

-23,5

шш

12,1 11,6

23,2 -24,5 М

LI Е27Ж

А —I

□ длина побегов

I масса побего

K« 0.5СРК 1СРК 5 СРК 5 СРК 0.5ПДК 1ПДК 5ПДК 5ПДК Fe Fe Fe Fe +c Zn Zn Zn Zn+c

Рис. 1. Влияние ионов железа и цинка на биометрические показатели овса

Внесение ионов железа в количестве 0.5СРК, 1СРК, 5СРК приводит к уменьшению длины побегов на 17,6%; 23,5% и 43,1%. Внесение ионов цинка 0.5ПДК, 1ПДК, 5ПДК приводит к уменьшению длины побегов на 24,5%; 35,3% и 48,0%, соответственно. При внесении соломы в варианты опыта с 5-кратным превышением ионов СРК железа и ПДК цинка наблюдалось увеличение длины побегов с 14,5 см