CC BY
67
УДК 636.127.1:636.082.12
ПРОФИЛИ ДНК-MAPKEPOB (ISSR-PCR) У ЛОШАДЕЙ РЫСИСТЫХ ПОРОД
Н.В. БАРДУКОВ, Г.К. КОНОВАЛОВА, В.И. ГЛАЗКО
(Центр нанобиотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
Выполнен сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (КВК-РСК-мар-керов) у групп американских, русских, орловских и помесных рысаков. Среди исследованных спектров продуктов амплификации ДНК-геномных участков выделены наиболее вовлеченные в межгрупповую генетическую дифференциацию. Обсуждается эффективность использования КВК-РСК-маркеров в контроле генофондной динамики в процессе селекционной работе с рысаками.
Ключевые слова: ^БИ-РСИ-маркеры, микросателлиты, инвертированные повторы, геномные профили, генетическая структура, рысаки, помеси.
Изучение своеобразия генетической структуры различных групп с.-х. видов животных, исследования механизмов поя вления специфических характеристик генофондов я вля ются на сегодня шний день особенно актуальными, поскольку позволя ют подойти не только к решению задач общей и частной попул ционной генетики, но и к разработке методов управле-ни генетической изменчивостью,
коррекции структуры генофонда в желательном направлении. Одним из наиболее перспективных способов описани своеобрази попул ционно-генетической структуры в насто -щее врем вл етс использование
молекул рно-генетических маркеров. Особую важность эти методы приобретают в коневодстве, поскольку оценка рабочих качеств лошадей, в частности рысаков, возможна только в более позднем возрасте. Кроме того, широкое использование в скрещива-ни х улучшающих пород в селекци-
онном процессе, направленном на увеличение резвости лошадей, делает особенно актуальной проблему контроля их генетической структуры. Так, в особом внимании нуждается генофонд орловского рысака, улучшенного во второй половине XX в. кровью чистокровной верховой и американской рысистой пород. Без оценки и анализа результатов уже проведенной работы и при широком пополнении племенного дра орловской породы потомками англо-орловских и американо-орловских помесей возникает проблема утраты уникальных ценных качеств орловского рысака [1].
В настоя щее время имеется множество методов, позволяющих выдел ть специфические генофондные особенности групп животных, к одним из которых относитс метод оценки полиморфизма фрагментов геномной ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (Inter-Simple Sequence Repeat —
ISSR), c использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР, или PCR) [5]. ISSR-PCR-маркеры позволяют получать множественные спектры продуктов амплификации различных участков геномной ДНК (ампликоны). Каждый ампликон рассматривается как отдельный локус, отсутствие фрагмента ДНК в спектре ампликонов принимаетс как гомозигота по рецессивному аллелю, присутствие — как доминантный фенотип. Такие спектры позвол ют сравнивать полиморфизм геномов по разным участкам и оценивать своеобразие генофондов групп животных, их гетерозигот-ность и генетические взаимоотношения с другими группами. Составление селекционной программы с учетом не только родословной, оценок животных по происхождению, фенотипических и физиологических показателей, но и полилокусных генотипов, а также значений генетического сходства может способствовать ускорению и увеличению эффективности селекционной работы.
Нужно учитывать и то, что внутри породы может наблюдаться низкое генетическое разнообразие. Это может быть свя зано с малым количеством основателей, множественностью близкородственных скрещиваний, в частности, длительным использованием самцов одних и тех же линий в качестве улучшателей при межпородных скрещиваниях. Но для того, чтобы контролировать генофондную динамику, необходим предварительный подбор комплекса ISSR-PCR-маркеров, наиболее информативных дл решени перечисленных задач. В этих целя х в настоящей работе выполнен анализ ISSR-PCR-маркеров у групп лошадей рысистых пород.
Материалы и методы
Исследование проводилось на 48 ло-шад х рысистых пород (американские рысаки; русские рысаки; орловские рысаки; помеси — русские рысаки,
улучшенные американскими рысаками). Дл выделени ДНК использо-валс набор реагентов дл выделени геномной ДНК из цельной крови ДНК-Экстран-1 (ЗАО «Синтол», Москва). Дл определени полиморфизма ДНК использовались ISSR-PCR-маркеры. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Терцик, ДНК-технология »(Россия ) со следующими параметрами: первичная денатурация (t = 94°С, 2 мин); денатурация (t = 94°С, 30 с), отжиг (t = 55°С, 30 с), элонгация (t = 72°С, 2 мин) — 30 циклов; финальная элонгация (t = 72 °С, 10 мин). Для постановки реакции примен ли лиофилизованные ПЦР-наборы GenePak PCR core (ООО «Изоген», Москва) и 4 вида праймеров: (AG)9C, (GA)9C, (CTC)6C, (GAG)6C, я вляющихся фрагментами микросателлитных локусов. Разделение ПЦР-продуктов по молекул рной массе осуществл лось при помощи метода горизонтального электрофореза в 1,5%-м агарозном геле, далее производилось окрашивание ампликонов бромистым этидием и просвечивание гел под ультрафиолетовым излучением на трансиллюминаторе с целью вы в-лени ампликонов. Дл определени размеров ампликонов примен лс маркер молекуля рных масс 100 bp + 1.5 Kb + 3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 bp) M 27 (СибЭнзим, Росси ).
Статистическую обработку данных выполн ли с использованием стандартных компьютерных программ Stru^ure v2.2.
Результаты и их обсуждение
Выполнено генотипирование 48 лошадей рысистых пород по спектрам продуктов амплификации (ISSR-PCR-маркеры), полученных при использовании в ПЦР в качестве праймеров четырех участков микросателлитов ( (AG)9C, (GA)9C, (CTC)6C, (GAG)6C ). Суммарно по всем спектрам про-
дуктов амплификации (ампликонов) всего выя влено 35 локусов, 25 из которых были полиморфны. В спектре праймера (AG)9C выявлено 9 фрагментов днк, (са)9с — 8, (САС)6С —
11 (табл. 1). Наименьшее количество ампликонов обнаружено в спектре праймера (СТС)6С — 7 ампликонов, из них 2 были полиморфны у жеребцов, 3 — у кобыл.
Т а б л и ц а 1
Состав и полиморфизм спектров продуктов амплификации ДНК, фланкированных фрагментами инвертированных повторов микросателлитов (ISSR-PCR-маркеры), у исследованных групп рысаков
Праймер Количество ампликонов в спектре Границы длин локусов спектра, п.о. Количество внутрипородных полиморфных локусов
в абс. выражении в % от общего числа ампликонов
(AG)9C 9 1200-320 7 77,8
(GA)9C 8 1000-360 7 87,5
(GAG)6C 11 1400-180 8 72,7
(CTC)6C 7 1100-350 3 42,9
Выполнен расчет индекса PIC (полиморфное информационное содержание — Polymorphous Information Contents) по ф ормуле расчета гетерозигот для диаллельных локусов, для которых PIC=2f(1-f), где f — частота рецессивного аллеля, которая рассчитывается как корень квадратный из частот рецессивных генотипов (дол животных, у которых фрагмент ДНК данной длины отсутствует в спектре ампликонов, полученных с данным праймером).
Индекс PIC характеризует уровень гетерозиготности локусов — продуктов амплификации, исходя из представлений о т ом, что по каждому ло-
кусу исследованная группа животных находится в равновесном состоянии, соответствующем закону Харди-
Вайнберга. Полученные величины PIC для каждого локуса спектра усред-н ли по всем ампликонам спектров одного праймера и таким образом рассчитывали усредненную гетерози-готность спектра. Суммарно у исследованных животных основной вклад в гетерозиготность внос т спектры продуктов амплификации, полученных при применении в ПЦР в качестве праймеров фрагментов микросателлитов (GA)9C и (GAG)6C (табл. 2).
Небольшое количество животных относительно «чистых» по своему
Т а б л и ц а 2
Полиморфное информационное содержание спектров продуктов амплификации
Праймер По всем животным Помеси, русский рысак, улучшенный американским рысаком Амери- канский рысак Русский рысак Орлов- ский рысак
Праймер (А0)9О (9 локусов) 0,251 0,229 0,111 0,180 0,248
Праймер (ОА)9О (8 локусов) 0,352 0,343 0,272 0,239 0,125
Праймер (0АО)6О (11 локусов) 0,296 0,252 0,270 0,204 0,203
Праймер (ОТО)6О (7 локусов) 0,156 0,156 0,120 0,161 0,059
В среднем по всем праймерам 0,264 0,245 0,193 0,196 0,159
происхождению не позволяет получить надежные данные о межпородной генетической дифференциации. Тем не менее следует отметить, что у американских рысаков заметно ниже полиморфизм спектра (AG)9C, а у орловских — спектра (GA)9C по сравнению с другими группами животных при относительно сходных значени х PIC по другим спектрам. Полученные данные позволяют предполагать, что именно в спектрах (AG)9C и (GA)9C могут быть основные отличия между генофондами орловских и американских рысаков.
Известно, что русская рысистая порода вл етс результатом длительной селекционной работы с потомством от скрещивани орловских кобыл и жеребцов американского рысака. Кроме того, сама орловская порода во второй половине XX в. неоднократно испытывала вли ние американского рысака. Поэтому трудно было бы ожидать, что генофонды этих пород существенно отличаютс друг от друга. Тем не менее, в наших предыдущих исследовани х были обнаружены выраженные отличия генофондов орловского и русского рысака по распределению аллельных вариантов по таким генетико-биохимическим системам, как трансферрин, фософ-глюкомутаза [2]. Обнаружены также отличи по количеству и распределению аллельных вариантов между эти-
ми породами по микросателлитным локусам HTG-10 и HTG-14 [3]. Следует отметить, что в наши предыдущие исследования входили достаточно большие выборки лошадей этих пород (русский рысак — 99 гол., орловский рысак — 102 гол., содержавшиеся в услови х киевского ипподрома и принадлежавшие различным конным заводам, большая часть — Дубровскому конному заводу Украины). Очевидно, что изменение направления селекционной работы с орловским рысаком от экстерьерных характеристик в сторону резвости может существенно влиять на генетическую структуру породы с учетом сниженных репродуктивных характеристик у животных с ярко выраженным экстерьерным типом орловской породы [4].
Тем не менее, использование 3 5 локусов ІЗБИ-РСИ-маркеров для расчета генетических расстоя ний, даже при таких небольших выборках, позвол -ет надежно дифференцировать группы животных в полном соответствии с историей формирования их генофондов (табл. 3, рисунок). По методу Нея (Меі 1972, 1978) были рассчитаны индекс идентичности и генетические расстояния между орловскими, русскими, американскими рысаками и помеся ми между русскими и американскими рысаками. Наименьшее генетическое рассто ние оказалось
Т а б л и ц а 3
Значения индекса идентичности и генетических расстояний, рассчитанных по методу М. Ней, между породами и помесями рысаков на основании распределения аллелей и генотипов по 35 локусам !8вР-РСР-маркеров
Группа животных Несмещенные величины генетических расстояний М. Нея Несмещенные величины индекса идентичности М. Нея
Помеси / рус. рысаки 0,0400 0,9607
Помеси / амер. рысаки 0,0456 0,9554
Помеси / орл. рысаки 0,0443 0,9566
Амер. рысаки / рус. рысаки 0,0394 0,9614
Амер. рысаки / орл. рысаки 0,1232 0,8841
Рус. рысаки / орл. рысаки 0,0652 0,9369
Дендрограмма генетических взаимоотношений, построенная на основании величин генетических дистанций, рассчитанных по распределению !8вР-РСР-маркеров у разных групп рысаков: 1 — помеси; 2 — американские рысаки; 3 — русские рысаки;
4 — орловские рысаки
между помеся ми и русскими рысаками, немного большее — между помесями и американскими рысаками, еще большее — между американскими и русскими рысаками, затем между помесями и орловцами, ощутимо большее — между орловскими и русскими рысаками и самое большое — между орловскими и американскими рысаками.
На основании величин генетических расстояний была построена дендрограмма, отражающая генетические взаимоотношения между исследованными группами животных (см. рисунок). Полученные данные свидетельствуют о том, что при таких сложных скрещиваниях и гено-
фондных пересечениях в истории формирования групп исследованных животных использование полилокус-ных спектров ІЗБИ-РСИ-маркеров позволяет выявить генетическую дифференциацию даже между их малочисленными группами, отражающую особенности их происхождения . Можно ожидать также, что генотипирование спектров продуктов амплификации с использованием в качестве праймеров микросателлитов (ЛС)9С и (СЛ)9С может позволить достаточно надежно выя вля ть отличия между генофондами орловских и американских рысаков, а также контролировать их вклад в помесные группы животных.
Библиографический список
1. Гаврова Ю.И. Резвость и промеры орловских рысаков при скрещиваниях с лошадьми других быстроаллюрных пород: Автореф. канд. дисс. М., 2007.
2. Амбросьева Е.Д., Хохрякова Ж.А., Глазко В.И. Некоторые особенности генетической структуры орловской рысистой и русской рысистой пород лошадей / / Цитология и генетика, 1992. Т. 26. № 5. С. 37-41.
3. Глазко В.И., Облап Р.В., Кушнир А.В., Щирский О.Н. Генетические маркеры лошадей // С.-х. биология. Сер. Биология животных, 1999. № 4. С. 38-47.
4. Орлова Ю.А. Влияние ярко выраженного типа породы на племенные качества орловского рысака: Автореф. канд. дисс. Дивово, 2008.
5. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics, 1994. 20. P. 176-183.
SUMMARY
The comparative analysis of polymorphism of DNA fragments, flanking by the inverted repeats of microsatellites (ISSR-PCR markers) in groups of American, Russian, Oryol and cross trotters was carried out. Among the investigated spectra of amplification products of genomic DNA the most involving between them in intergroup genetic differentiation were revealed. The efficiency of the ISSR-PCR marker using in control of gene poll dynamics in the process of selection work with trotters was discussed.
Key words: ISSR-PCR markers, microsatellites, invert repeats, genomic profiles, genetic structure, trotters, crosses.
Бардуков Николай Владимирович — стажер, Центр нанобиотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева.
Коновалова Галина Константиновна — д. с.-х. н.
Глазко Валерий Иванович — д. с.-х. н. Эл. почта: vglazko@yahoo.com
