CC BY
38
УДК 616.36-006.68-091.8-092.9
ПРИМЕНЕНИЕ ЦИКЛОФОСФАНА ДЛЯ ОГРАНИЧЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 У КРЫС УСУГУБЛЯЕТ ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ НАРУШЕНИЯ В ПЕЧЕНИ
Анатолий Васильевич ЕФРЕМОВ, Татьяна Анатольевна КУНЦ, Елена Владимировна ОВСЯНКО, Ирина Юрьевна ИЩЕНКО, Мария Геннадьевна ПУСТОВЕТОВА
ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52
В печени крыс с карциносаркомой Walker 256 через 7 суток после введения циклофосфана выявлены показатели лизиса и некробиоза клеток паренхимы и стромы. В части клеток отмечены компенсаторно-приспособительные перестройки и развитие апоптоза. Сочетанные воздействия паранеопластических факторов и циклофосфана усиливают субклеточные проявления синусоидального обструктивного синдрома, вызванного действием циклофосфана. Ультраструктурные особенности паренхиматозных клеток отражают нарастание функционального ответа печени через запуск детоксикационных механизмов в гепатоцитах с развитой агра-нулярной цитоплазматической сетью.
Ключевые слова: печень, ультраструктура, карциносаркома Walker 256, циклофосфан.
Развитие опухоли сопровождается синдромом эндогенной интоксикации, обусловленным распадом опухолевых клеток и выделением паранеопластических токсических продуктов, разносимых током крови по организму и повреждающих мембраны нормальных клеток [1, 2]. Это приводит к системному нарушению обменных, иммунных и регуляторных функций организма, метаболических и адаптационных функций печени - центрального органа гомеос-таза, обезвреживающего токсические вещества, в том числе и цитостатики. Применяемый в экспериментальной и клинической практике цикло-фосфан заметно тормозит рост злокачественных опухолей, в частности, карциносаркомы Walker 256, однако его метаболиты оказывают на печень побочные эффекты, вызывая синусоидальный обструктивный синдром в связи с нарушением обмена глутатиона в клетках эндотелия печени [3] и снижением в них активности анти-оксидантных ферментов супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы [4]. Анализ литературы,
посвященный ультраструктурным изменениям клеток печени при действии циклофосфана и карциносаркомы Walker 256, показал фрагментарность и недостаточную изученность этих вопросов на субклеточном уровне в плане исследования клеток, составляющих стромальный компартмент, особенностей синусоидальных и перисинусоидальных пространств на фоне изменений микроциркуляции и фиброзирования. Целью настоящего исследования явилось изучение ультраструктурных преобразований в сосудистом русле печени крыс на фоне сочетанных влияний паранеопластических факторов карци-носаркомы Walker 256 и циклофосфана.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Крысам-самцам Wistar массой 180-200 г в мышцу бедра осуществляли трансплантацию 1 х 106 клеток карциносаркомы Walker 256 [5]. Циклофосфан («Биохимик», г. Саранск, Россия) вводили на 5-е сутки после перевивки опухоли однократно внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг.
Ефремов А.В. — д.м.н., проф., член-кор. РАМН, зав. кафедрой патофизиологии, заслуженный деятель науки РФ
Кунц Т.А. — научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ), e-mail: tkunts@ngs.ru
Овсянко Е.В. — к.м.н., доцент кафедры анатомии, гистологии, биологии стоматологического факультета Ищенко И.Ю. — к.б.н., научный сотрудник ЦНИЛ Пустоветова М.Г. — д.м.н., проф., зав. ЦНИЛ
Образцы печени для исследования забирали спустя 7 суток после введения препарата. В качестве контроля использовали крыс-опухолено-сителей на 7-е сутки после перевивки опухоли и здоровых животных на 7-е сутки после введения циклофосфана. Все манипуляции с лабораторными животными проводились с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Для электронно-микроскопических исследований образцы печени фиксировали в 4 % параформальдегиде ^егуа, Германия) на 0,1 М фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 2 ч с дополнительной дофиксацией в 1 % растворе че-тырехокиси осмия на том же буфере на льду в течение 1 ч. После дегидратации образцы заключали в эпоновую смесь и полимеризовали. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы (3545 нм) получали на ультратоме LKB-8800 (Швеция). Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца, напыляли слоем углерода и изучали в электронном микроскопе JEM-100SX (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование полутонких срезов печени крыс с карциносаркомой Walker 256 спустя 7 суток после однократного введения цикло-фосфана показало расширение центральных и портальных вен, застойное полнокровие сину-соидов, связанное со сладжированием эритроцитов, адгезированных к эндотелию совместно с гемолизированными эритроцитами, и появлением детрита разрушенных клеток, создающих обтурационные комплексы, иногда закупоривающие просветы капилляров и способствующие гипоксии. Ухудшение трофики и оксигенации обусловлено в большей степени повреждающим действием факторов неспецифической эндогенной интоксикации (НЭИ) - протеолитических агентов и цитокинов, в первую очередь, фактора некроза опухоли, который вызывает деструкцию клеток, подавляя их пролиферацию [1]. Обнаружены цитолитические изменения эндотелиоцитов и клеток Купфера синусоидов с утратой участков плазмалемм и выходом из них органоидов цитоплазмы, нередко заполняющих пространства капилляров.
Нами показано, что воздействие циклофос-фана вызывало появление участков десквамации эндотелия синусоидов, приводя к нарушению гематопаренхиматозного барьера и открытию прямых контактов поверхностей гепатоцитов с
кровью (рис. 1, б), а некробиотические изменения эндотелиоцитов (рис. 2, а) подтверждали данные об индукции циклофосфаном синусоидального обструктивного синдрома, обусловленного гибелью части клеток синусоидальной выстилки [3]. Возможной причиной этого при воздействии метаболитов циклофосфана может быть подавление экспрессии белка профили-на-1, связанного с примембранным актином, которое способствует появлению дефектов в мембранах этих клеток. Процесс десквамации и сегрегации эндотелиоцитов синусоидов при со-четанном воздействии факторов НЭИ и цикло-фосфана был выражен сильнее, что, очевидно, приводило к большей повреждаемости плазма-лемм гепатоцитов (см. рис. 2, в), так как участков синусоидов, лишенных синусоидальной выстилки, наблюдалось значительно больше, чем при раздельном воздействии повреждающих факторов НЭИ и циклофосфана.
Дистрофические и некротические изменения клеток паренхимы и стромы были локализованы в печеночных дольках от перипортальных до перицентральных зон, видимо, в связи с преимущественными повреждающими эффектами циклофосфана на клетки периферии долек - пе-рипортальные зоны, а факторов НЭИ - на пери-центральные зоны долек. Для части эндотелио-цитов застойных синусоидов были характерны черты апоптоза: конденсация хроматина ядер и уплотнение цитоплазмы (см. рис. 2, б). Показано, что причиной активации апоптозных триггеров - каспазы-3 и каспазы-9 - является гипоксия, которая способна повысить активность каспазы-3 в 30 раз в течение 5 ч [7].
По сравнению с другими группами, намного чаще выявлялись плазматические клетки и в синусоидах, и в пространствах Диссе (см. рис. 1, в). Известно, что появление в печени плазмо-цитов связано с иммунологическими сдвигами и циркуляцией противоопухолевых иммунных комплексов при росте злокачественных опухолей [1, 2]. Сам факт накопления в печени плаз-моцитов и их апоптотических изменений (см. рис. 1, в) объясняется наличием хемокинов из разрушенных клеток, привлекающих сюда лимфоциты, адгезивные взаимодействия которых с эндотелием приводят к апоптозу и гибели, что обеспечивает динамическое равновесие между производством и устранением «излишних» лимфоцитов [8].
Часть клеток Купфера обнаруживала признаки усиления фагоцитоза (см. рис. 1, а). Согласно литературным данным, активированные фагоциты печени стимулируют пролиферацию
Рис. 1. Ультраструктурные изменения клеток печени крыс. а — фрагмент активированной клетки Купфера. В цитоплазме видны захваченные гемолизированные эритроциты и гетерофагосомы с клеточным детритом (7 сут после введения циклофосфана). Ув. 7000; б — обилие коллагена в пространстве Диссе, в котором видны эритроциты и клеточный детрит, проникшие туда из-за нарушения гематопаренхима-тозного барьера; пространство застойного синусоида пререполнено клеточным детритом, среди которого виден фрагмент плазматической клетки (опухоленосители через 7 сут после введения циклофосфа-на). Ув. 15000; в — часть застойного синусоида с гемолизированными эритроцитами, фибриноподобным материалом, клеточным детритом и апоптозным плазмоцитом (опухоленосители через 7 сут после введения циклофосфана). Ув. 15000
клеток Ито и их способность синтезировать коллаген [9], являясь причиной субэндотелиального фиброза, характерного для синусоидального об-структивного синдрома [3]. В печени опухоле-носителей под действием циклофосфана наблюдалось выраженное переполнение пространств Диссе коллагеном, обусловленное высокой степенью трансдифференциации клеток Ито.
Наряду с некробиотически поврежденными эндотелиоцитами, имеющими литические дефекты плазмалемм, в части синусоидов выявлялись укрупненные, активированные клетки эндотелия с развитыми цитоплазматическими органоидами, округлыми или фестончатыми очертаниями ядер, т. е. с увеличенной поверхностью ядер (см. рис. 2, г) - чертами, свойственными гипертрофированным клеткам. Показано, что эндотелиоциты приобретают подобные характеристики под воздействием эндотелийстимулиру-ющего фактора (ESF), продуцируемого клетками карциносаркомы Walker 256 [10]. Цитируемые авторы показали, что этот фактор вызывает неспецифическую для клеточных типов эндотелия гипертрофию и способность к формированию дополнительных капиллярных пространств
в органах. Мы полагаем, что в рассматриваемой экспериментальной ситуации, когда имеют место обширные цитолитические повреждения эндотелия синусоидов, ESF мог выполнять ре-модулирующую восстанавливающую функцию в печени. В ядрах гипертрофированных эндоте-лиоцитов нами обнаружены ядрышкоподобные гроздьевидные тельца, окруженные двойными мембранами (см. рис. 2, г), которых обычно не наблюдается вокруг ядрышек. Нам не удалось идентифицировать и интерпретировать эти тельца согласно имеющимся литературным источникам по ультраструктуре ядра, хотя сомнений не вызывает, что их появление связано с активацией функций эндотелия, направленной на восполнение функций утраченных клеток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, воздействие циклофосфана с целью ограничения роста карциносаркомы Walker 256 на печень крыс-опухоленосителей отягощало субклеточные проявления некробио-тических процессов, определяемых воздействием факторов НЭИ за счет суммирования их пов-
Рис. 2. Ультраструктурные изменения клеток печени крыс-опухоленосителей на 7-е сут после введения циклофосфана. а — некробиотически измененный эндотелиоцит (слева вверху) и лишенный эндотелиальной выстилки фрагмент гепатоцита с впячиваниями цитоплазматических отростков. Тени гемолизирован-ных эритроцитов и цитоплазматический детрит разрушенных клеток контактируют с плазмалеммой гепатоцита. Ув. 18000; б — апоптотически измененный эндотелиоцит с конденсированным хроматином ядра и компактизованной цитоплазмой. Ув. 10000; в — в просвете синусоида видны фрагменты эндотелия после десквамации и сегрегации. В плазмалемме гепатоцита видны литические дефекты (стрелки). Ув.15000; г — фрагмент активированного эндотелиоцита с увеличенной поверхностью ядра, в котором находится образование неясной природы, окруженное двойной мембраной (стрелка). В расширенных каналах гладкого эндоплазматического ретикулума гепатоцитов виден белковый материал. Ув. 9600
реждающих влияний на клетки стромы органа. В совокупности эти влияния усиливали проявления синусоидального обструктивного синдрома, вызываемого циклофосфаном. Обнаружены ультраструктурные признаки цитолитических процессов, вызывающие дефекты плазмалемм клеток, развитие апоптотических изменений клеток стромы. Наряду с этим отмечались субклеточные проявления компенсаторных и восстановительных процессов в эндотелиальных клетках синусоидов, выраженные в меньшей
мере, чем при раздельном влиянии метаболитов циклофосфана и опухолевых факторов НЭИ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории электронной микроскопии НИИ физиологии СО РАМН за техническую поддержку и признательны специалисту по научной фотографии НГМУ Ложкину М.И. за действенную помощь в изготовлении иллюстраций к статье.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ганцев Ш.Х. Онкология. М., 2004. 516 с.
2. Онкология: национальное руководство. М., 2008. 1072 с.
3. Wang X., Kanel G.C., DeLeve L.D. Support of sinusoidal endothelial cell glutathione prevents hepatic veno-occlusive disease in the rat // Hepatology. 2000. 31. 428-434.
4. Sulkowska M., Sulkowski S., Skrzydlewska E. The effect of pentoxifylline on ultrastructure and antioxidant potential during cyclophosphamide-induced liver injury // J. Submic. Cytol. Pathol. 1999. 31. (3). 413-422.
5. Хегай И.И., Попова Н.А., Иванова Л.Н. Влияние экспрессии гена вазопрессина на рост карциносаркомы Walker 256 у крыс // Генетика. 2000. 42. (7). 993-995.
6. Ding Z., Lambrechts A., Parepally M., Roy P. Silencing profilin-1 inhibits endothelial cell prolifera-
tion, migration and cord morphogenesis // J. Cell Sci. 2006. 119. (19). 4127-4137.
7. Dong Z., Saikumar P., Patel Y., Weinberg J. M., Venkatachalam M.A. Serine protease inhibitors suppress cytochrome c-mediated caspase-9 activation and apoptosis during hypoxia-reoxygen-ation // Biochem. J. 2000. 347. (3).669-677.
8. Ruoslahti E., Reed J.C. Anchorage dependence, integrins, and apoptosis // Cell. 1994. 77. (4). 477-478.
9. Gressner A.M. Transdifferentiation of hepatic stellate (Ito) cells to myofibroblasts: a key event in hepatic fibrogenesis // Kidney Int. 1996. 49. (1). 39-45.
10. McAuslan B.R., Hoffman H. Endothelium stimulating factor from Walker carcinoma cells: Relation to tumor angiogenic factor // Exp. Cell Res. 1979. 119. (1). 181-190.
CYCLOPHOSPHAMIDE ADMINISTRATION FOR LIMITATION OF CARCINOSARCOMA WALKER 256 GROWTH IN RATS AGGRAVATES THE PARANEOPLASTIC ULTRACTRUCTURAL DISTURBANCES IN THE LIVER
Аnatoly Vasilyevich EFREMOV, Тatyana Anatolyevna RUNTS, Еlena Vladimirovna OVSYANKO, Irina Yuryevna ISHENKO, Marya Gennadyevna PUSTOVETOVA
Novosibirsk State Medical University 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
The signs of lysis and necrobiosis intensification in parenchyma and stroma cells were revealed in the liver of carcinosarcoma Walker 256-bearing rats at the 7th day after cyclophosphamide administration. Compensatory and adaptive reconstructions and apoptosis were noted in part of cell as a result of cyclophosphamide cytostatic effect. Combined effects of paraneoplastic factors and cyclophosphamide enhance subcellular sinusoidal obstructive syndrome manifestation caused by cyclophosphamide. Hepatocytes ultrastructural features reflect the functional liver response via triggering of detoxification mechanisms in hepatocytes with extensive smooth endoplasmatic reticulum.
Key words: liver, ultrastructure, carcinosarcoma Walker 256, cyclophosphamide.
Efremov A.V. — doctor of medical sciences, professor, Corresponding Member of RAMN, head of the chair of pathophysiology, honored scientist of the RF
Kunts T.A. — researcher of Central Research Laboratory, e-mail: tkunts@ngs.ru
Ovsyanko E.V. — candidate of medical sciences, associated professor of the chair of anatomy, histology, biology Ishenko I.Yu. — candidate of biological sciences, researcher of Central Research Laboratory Pustovetova M.G. — doctor of medical sciences, professor, head of Central Research Laboratory
