CC BY
35
2003
Известия ТИНРО
Том 135
УДК 577.115.3(265.54)
А.С.Хардин, Т.В.Морозова (Институт биологии моря ДВО РАН)
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МАРКЕРНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СЕЗОННОЙ ДИНАМИКИ ВИДОВОГО СОСТАВА ФИТОПЛАНКТОНА ЗАЛ. ВОСТОК
ЯПОНСКОГО МОРЯ*
Для изучения сезонных изменений в структуре планктонного сообщества использовали метод световой микроскопии и метод маркерных жирных кислот. Исследован состав жирных кислот фитопланктона зал. Восток Японского моря. Высокая биомасса и плотность диатомовых микроводорослей в зимний, весенний и осенний периоды и доминирование динофитовых микроводорослей летом отражались на составе жирных кислот общего планктона. Анализ жирных кислот и данные световой микроскопии показали, что при активном цветении диатомовых микроводорослей из родов Thalassiosira, Thalassionema и Chaetoceros содержание 16:1 n-7 и 20:5n-3 в липидах общего фитопланктона было сравнительно выше. Содержание 22:6n-3 и 18:1n-9 в липидах фитопланктона выше при доминировании динофлагеллят. Обнаружена положительная зависимость между общепринятым маркером диатомовых микроводорослей — соотношением 16:1 п-7/16:0 — и относительной биомассой планктонных диатомовых водорослей.
Khardin A.S., Morozova T.V. Appliance of the method of marker fatty acids for study the seasonal dynamics of species composition of phytoplankton in Vostok Bay, the Japan Sea // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 266-271.
Both light microscopy and fatty acid biomarkers were used to determine phytoplankton abundance and to discover seasonal changes in planktonic community in Vostok Bay (Japan Sea). High biomass and diatoms dominance were observed during the winter, spring and autumn blooms. High biomass and dinoflagel-lates dominance were in summer. Both phenomena were reflected by fatty acid profiles. When genera Thalassiosira, Thalassionema and Chaetoceros were predominant in plankton , the shares of 16:1n-7 and 20:5n-3 in total lipids of plankton were high, but the 22:6n-3 and 18:1n-9 were more abundant when dinoflagellates dominated. Moreover, we found a good positive correlation between the common diatom marker — ratio (16:1n-7)/(16:0), and the weight percentage of diatoms.
Липиды являются важной частью потока углерода по трофическим уровням в морских экосистемах (Sargent et al., 1977). Жирные кислоты (ЖК) — главная часть липидов морских организмов. ЖК выполняют ряд ключевых функций в клеточных мембранах, в процессах воспроизводства, передаче нервных импульсов, контроле ионного баланса и энергетического обмена (Arts et al., 2001). Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) незаменимы для жизнедеятельности морских животных, так как их биосинтез de novo происходит в фотосин-
* Работа выполнена при финансовой поддержке ДВО РАН, грант "Реакция морской биоты на изменения природной среды и климата".
тезирующих организмах (Sargent, Whittle, 1981). Фитопланктон, как продуцент, является главным источником ПНЖК в водных экосистемах (Desvilettes et al.,
1997). Для многих морских беспозвоночных животных, например для двустворчатых моллюсков, фитопланктон — единственная пища, поэтому исследование его биохимического состава, пищевой ценности для промысловых животных и биологии весьма актуально (Pazos et al., 1996).
Известно, что микроводоросли в пределах одного отдела имеют достаточно сходный состав ЖК, что позволяет в некоторых случаях использовать этот признак для установления таксономического положения микроводорослей (Volkman et al., 1989; Dunstan et al., 1993; Viso, Marty, 1993). Выделено множество характеристических наборов ЖК и их соотношений, являющихся в некотором роде хемотаксономическими показателями или биологическими маркерами (биомаркерами). Для диатомовых водорослей, основных продуцентов органического вещества в морских экосистемах (Селина, 1998), маркерным является соотношение пальмитоолеиновой (16:1n-7) и пальмитиновой (16:0) кислот (16:1n-7/16:0 > 1) (Ackman et al., 1968). Рядом исследователей отмечено, что маркерным для липидов диатомей является также высокое содержание эйко-запентаеновой (20:5n-3) кислоты, которая у этих микроводорослей накапливается в больших количествах. В качестве биологических маркеров диатомовых водорослей могут выступать не только отдельные ЖК и их соотношения, но и суммарное содержание некоторых ЖК, например сумма ПНЖК с длиной углеродной цепи С16 (Viso, Marty, 1993). Для динофитовых водорослей характерно высокое содержание докозагексаеновой (22:6n-3), олеиновой (18:1n-9) и суммы С|8 ЖК (Reuss, Poulsen, 2002).
18
В фитопланктоне зал. Восток Японского моря обнаружены микроводоросли из нескольких отделов: Cyanophyta, Chrysophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Raphidophyta и Chlorophyta. Большую часть биомассы планктонных микроводорослей этого залива в среднем за год формируют представители отдела Ba-cillariophyta и частично отдела Dinophyta. Сезонные изменения видового состава микроводорослей, установленные методом световой микроскопии, — одна из самых наглядных и документированных характеристик фитопланктона (Селина,
1998). Эти изменения (в виде пиков цветения) достаточно стабильны от года к году.
Цель данной работы — на примере фитопланктона зал. Восток Японского моря показать, что изменение содержания маркерных ЖК отражает сезонную смену видового состава фитопланктона и анализ состава ЖК может быть использован для экспресс-оценки видовой структуры планктонного сообщества.
Материал собирали с акватории зал. Восток (зал. Петра Великого, Японское море) в 1999-2002 гг. Пробы отбирали 1-литровым батометром Молчанова у поверхности воды. В качестве контрольного метода определения соотношения биомасс применялся метод световой микроскопии, для которого пробы фиксировали раствором Утермеля и концентрировали методами осаждения или фильтрацией через нуклепоровые фильтры с диаметром пор 2 мкм. При подсчёте клеток микроводорослей использовали камеры Ножотта объемом 0,07 и 1,0 мл. Биомассу водорослей оценивали объемным методом (Коновалова, 1972; Федоров, 1979; Нестерова, Василенко, 1986). Для нивелирования ошибки измерения, которая связана с суточной вертикальной миграцией фитопланктона, пробы отбирали в 10-12 ч дня.
Общие липиды выделяли по методу Б лая и Дайера (Bligh, D yer, 1959). М ети-ловые эфиры ЖК (МЭЖК) общих липидов готовили по методу Карро и Дубак (Carreau, D ubacq, 1978) и очищали препаративной тонкослойной хроматографией на пластинках "Сорбфил" (Россия) в бензоле. Анализ МЭЖК проводили методом газожидкостной хроматографии на хроматографе GC-14A ("Shimadzu", Япо-
ния) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение проводили на кварцевых капиллярных колонках с фазой Supelcowax 10 (0,25 мм х 30 м) ("Supelco", США) при температуре 210 °С и с фазой SPB-5 (0,25 мм х 30 м) ("Supelco", США) при температуре 220 оС. Температура испарителя и детектора — 240 оС. Газ-носитель — гелий. Для количественного обсчета хроматограмм использовали программно-аппаратный комплекс Z-Chrom ("Z-Лаб", Россия). Идентификацию пиков МЭЖК осуществляли на основании сравнения со стандартами и расчета индексов эквивалентной длины цепи ECL (Christie, 1988).
Анализ планктонного сообщества зал. Восток методом световой микроскопии показал, что в течение периода наблюдений преобладали диатомеи. Уровень их доминирования в общем фитопланктоне варьировал от 63,3 % в июле до 99,6 % в январе. Основу биомассы диатомовых водорослей формировали Thalas-siosira nordenskioldii, Thalassionema nitzschioides и Chaetoceros spp. Так, в январе и марте наиболее многочисленной была T. nordenskioldii, на ее долю приходилось соответственно 93,3 и 97,1 %, общей биомассы фитопланктона. В июле и сентябре доминировали водоросли рода Chaetoceros (соответственно 53,4 и 81,0 %). В ноябре большая часть биомассы (62,6 %) была представлена T. nitzschioides.
Динофитовые микроводоросли в течение всего периода исследований значительно уступали диатомовым по биомассе, составляя от 0,2 до 16,5 % общей биомассы фитопланктона. Наибольший вклад динофитовых в суммарный планктон был отмечен в июле. Из других групп микроводорослей наиболее представленными были золотистые, рафидофитовые и мелкие жгутиковые (неиденти-фицированные пигментированные клетки, чаще флагелляты, размером менее 10 мкм). Наибольшее их развитие также было отмечено в июле, когда суммарная биомасса этих водорослей достигала 20,2 % (рис. 1).
^100-1--1— —|-1— _ |=| — -
S 80
0 Си
1 70 8 60
I 50 Е
I 40
I 30
щ 20
Л. ю
О
Январь Март Июль Сентябрь Ноябрь
□ Bacillariophyta IDinophyla □ Другие водоросли
Рис. 1. Сезонное изменение биомассы микроводорослей различных таксономических групп
Fig. 1. Seasonal changes in biomass of microalgae from different taxonomic groups
Данные состава ЖК общих липидов суммарного фитопланктона представлены в таблице. В общих липидах фитопланктона в течение всего года доминировали 20:5n-3, 16:1n-7, 16:0 и миристиновая (14:0) ЖК. Содержание других ЖК значительно изменялось в зависимости от времени года. Например, максималь-
ное количество кислоты 16:4n-1 (20,9 %) зарегистрировано в январских пробах. Нами было отмечено, что максимальное содержание 22:6n-3 из года в год наблюдалось в июле и достигало 26,7 % в пробах 2002 г.
Состав жирных кислот общих липидов фитопланктона зал. Восток (Японское море) в зависимости от сезона, % Fatty acid composition of the total lipids of the phytoplankton of Vostok Bay (the Japan Sea) depending on season, %
Жирная кислота Январь Март Июль Сентябрь Ноябрь
14:0 5,9±0,5 2,1 ±0,6 4,9 ± 3,1 14,5±2,9 9,3±0,5
15:0 0,5±0,1 0,5±0,3 0,8±0,4 1,1 ±0,1 1,4±0,1
15:1n-5 _* 0,1 ±0,1 0,1 ±0,1 0,2±0,0 0,4±0,1
16:0 9,1 ±0,2 17,4± 1,7 20,2 ± 5,1 18,5 ± 1,8 12,5 ±0,6
16:1n-7 14,0±0,5 22,1 ±3,1 4,0± 1,2 13,6 ±3,3 19,1 ±0,8
16:1n-5 0,2±0,2 0,1 ±0,1 0,2±0,0 0,4±0,0 0,3±0,0
17:0-i _ 0,5±0,4 0,4±0,1 0,7±0,2 2,2±0,2
17:0-a 0,4±0,0 0,7±0,3 0,3 ± 0,1 0,5 ±0,1 1,0 ±0,1
16:2+Фит.** 3,5±0,6 1,9± 1,0 0,3±0,0 1,3 ±0,3 2,7±0,3
17:1n-9 _ 2,6± 1,7 0,5±0,2 0,9±0,3 3,3 ±0,1
16:3n-3 3,4±0,6 0,1 ±0,1 0,1 ±0,1 0,1 ±0,0 0,1 ±0,0
16:4n-1 20,9±0,2 3,8± 1,3 0,1 ±0,1 1,2 ±0,9 3,8±0,4
18:0 0,6±0,1 1,6 ± 1,5 4,5±2,0 3,2±0,4 1,7 ±0,4
18:1n-11 0,4±0,0 0,1 ±0,0 0,1 ±0,1 0,2±0,0 0,1 ±0,1
18:1n-9 1,8 ±0,3 13,5±3,4 6,6±0,2 3,3 ± 1,0 4,0±0,2
18:1n-7 0,4±0,2 2,0±0,9 2,3±0,6 1,9 ±0,4 0,7±0,0
18:2n-6 1,2 ±0,1 0,5±0,5 2,3±0,5 1,8 ±0,3 1,6 ±0,2
18:3n-3 0,3±0,1 0,4±0,4 1,6 ± 0,8 1,2 ±0,5 0,2 ±0,1
18:4n-3 4,9±0,5 4,3± 1,7 3,7±3,9 2,1 ±0,2 2,9±0,3
20:1n-11 _ _ 0,8±0,8 0,6±0,2 0,2±0,0
20:1n-9 _ 0,2 ± 0,1 0,7±0,2 0,3 ±0,1 1,9 ±0,2
20:1n-7 _ 0,2±0,2 0,5±0,1 0,3±0,0 0,1 ±0,0
20:4n-6 _ 0,2 ± 0,1 2,5± 1,8 1,1 ±0,2 0,3 ±0,1
20:5n-3 29,1 ± 1,7 13,5±4,6 14,5± 3,8 15,2 ±2,4 20,1 ±3,4
22:1n-11 0,3±0,2 0,2±0,3 0,6 ± 0,1 0,3 ±0,1 1,0 ±0,1
22:5n-3 _ 0,3±0,3 0,7±0,3 0,6±0,2 0,3 ±0,1
22:6n-3 1,1 ±0,0 8,1± 1,8 18,8±7,9 10,3 ± 5,1 3,6±0,2
Другие*** 1,6±0,5 3,0±2,4 7,8±4,5 4,5 ±1,3 5,4± 1,9
* "_" _ значение менее 0,1 %.
** Фит. _ фитановая кислота.
*** Другие — жирные кислоты, не включенные в таблицу (14:1n-5,
15:0-i, 15:0-ai, 16:0-i, 16:0-ai, 17:0, 18:0-i, 18:0-ai, 19:0-i, 19:0-ai, 18:2n-4, 19:0,
18:3n-6, 19:1, 20:0-i, 20:0, 20:2n-9, 20:2n-6, 20:3n-6, 20:3n-3, 20:4n-3, 22:1n-9,
21:5n-3, 22:5n-6, 22:4n-3).
Для липидов водорослей, относящихся к роду Thalassiosira, характерно высокое содержание 16:4n-1 (Viso, Marty, 1993). Цветение T. nordenskioldii в январе закономерно отражается и на профиле ЖК фитопланктона, что прежде всего видно на примере 16:4n-1, содержание которой в это время года было максимально.
О высокой плотности диатомовых водорослей в водах изучаемой акватории свидетельствует то, что 20:5n-3 во всех пробах фитопланктона является одной из главных ЖК. 3 начение маркерного для диатомей соотношения 16:1n-7/16:0 > 1 и сумма С16 ПНЖК также подтверждают эти данные (рис. 2).
Увеличение плотности динофитовых водорослей в июльском фитопланктоне приводит к изменению состава ЖК общего фитопланктона. Так, максимальное содержание в липидах одного из маркеров динофлагеллят 22:6n-3 зарегистрировано в этом месяце (рис. 3).
Рис. 2. Сезонное изменение содержания жирных кислот (биомаркеров диатомовых водорослей) в общих липидах фитопланктона
Fig. 2. Seasonal variations of the fatty acid abundance (biomarkers for diatoms) in the total lipids of the phytoplankton
Рис. 3. Сезонное изменение содержания жирных кислот (биомаркеров динофла-геллят) в общих липидах фитопланктона
Fig. 3. Seasonal variations of the fatty acid abundance (biomarkers for dinoflagel-lates) in the total lipids of the phytoplankton
Вспышки цветения динофитовых водорослей в летний период (июль) коррелировали с высоким содержанием олеиновой и пальмитиновой кислот (см. таблицу). Также необходимо отметить, что значение соотношения 16:1 n-7/16:0 < 1, что не характерно для диатомовых микроводорослей.
В осенний период биомасса диатомовых существенно возрастает за счет видов рода Chaetoceros sp., S. costatum и T. nitzschioides (98,4-99,2 % биомассы всего фитопланктона). Одновременно наблюдается снижение плотности динофитовых водорослей, о чем свидетельствуют уменьшение содержа-
ния 22:6n-3, 18:1 n-9 и увеличение доли 16:1 n-7 и 20:5n-3 в липидах общего фитопланктона.
Таким образом, нами показано, что содержание маркерных ЖК фитопланктона зал. Восток Японского моря отражает сезонное изменение его видовой структуры. Обнаружена положительная корреляция между значением соотношения 16:1n-7/16:0 общих липидов фитопланктона и биомассой диатомовых водорослей. Анализ ЖК фитопланктона предложено использовать в качестве метода для предварительной экспресс-оценки видовой структуры фитопланктона.
Литература
Коновалова Г.В. Сезонная характеристика фитопланктона в Амурском заливе Японского моря // Океанология. — 1972. — Т. 12. — С. 123-128.
Нестерова Д.А., Василенко Л.С. Размерная характеристика массовых видов фитопланктона западной части Чёрного моря // Гидробиол. журн. — 1986. — Т. 22. — С. 16-21.
Селина М.С. Фитопланктон залива Восток Японского моря: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Владивосток, 1998. — 25 с.
Федоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. — М.: МГУ, 1979. — 168 с.
Ackman R.G., Tocher C.S., McLachlan J. Marine phytoplankter fatty acids // J. Fish. Res. Board Can. — 1968. — Vol. 25. — P. 1603-1620.
Arts M.T., Ackman R.G., Holub B.J. "Essential fatty acids" in aq uatic ecosystems: a crucial link between diet and human health and evolution // Can. J. Fish. Aq uat. Sci. — 2001. — Vol. 58. — P. 122-137.
Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of the total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37. — P. 911-917.
Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of a macroscale method to the micro-scale for fatty acid methyl trans-esterification of biological lipid extracts // J. Chromatogr. — 1978. — Vol. 151. — P. 384-390.
Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl esters derivatives of fatty acids on gas chromatography // J. Chromatogr. — 1988. — Vol. 447. — P. 305-314.
Desvilettes C.H., Bourdier G., Amblard C.H., Barth B. Use of fatty acids for the assessment of zooplankton grazing on bacteria, protozoans and microalgae // Freshw. Biol. — 1997. — Vol. 38. — P. 629-637.
Dunstan G.A., Volkman J.R., Barret S.M. et al. Essential polyunsaturated fatty acid from 14 species of diatom (Bacillariophyceae) // Phytochemistry. — 1993. — Vol. 35. — P. 155-161.
Pazos A.J., Ruis C., Garcia-Martin O. et al. Seasonal variations of the lipid content and fatty acid composition of Crassostrea gigas cultured in EL Grove, Galicia, N.W. Spain // Comp. Biochem. Physiol. — 1996. — Vol. 114B. — P. 171-179.
Reuss N., Poulsen L.K. Evolution of fatty acids as biomarkers for a natural plankton community. A field study of a spring bloom and a post-bloom period off West Greenland // Mar. Ecol. — 2002. — Vol. 141. — P. 423-234.
Sargent J.R., Gatten R.R., Mcintosh R. Wax esters in the marine environment — their occurrence, formation, transformation and ultimate fates // Mar. Chem. — 1977. — Vol. 5. — P. 573-584.
Sargent J.R., Whittle K.J. Lipids and hydrocarbons in the marine food web // Analysis of marine ecosystems / A.R.Longhurst (ed.). — L.: Academic Press, 1981. — P. 491-533.
Viso А.С., Marty J.C. Fatty acids from 28 marine microalgae // Phytochemistry. — 1993. — Vol. 34. — P. 1521-1533.
Volkman J.K., Jeffrey S.W., Nichols P.D. et al. Fatty acids and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. — 1989. — Vol. 128. — P. 219-240.
Поступила в редакцию 21.08.03 г.
