CC BY
35
УДК 577.152.1
ПОВЫШЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ Lucióla mingrelica СЛУЧАЙНЫМ МУТАГЕНЕЗОМ М.И. Кокшаров, Н.Н. Угарова
(кафедра химической энзимологии; e-mail: mkoksharov@enz.chem.msu.ru)
Люцифераза светляков находит широкое применение в ряде областей биотехнологии и молекулярной биологии, но использование люциферазы часто ограничивается ее быстрой инактивацией при повышенных температурах. В результате четырех последовательных циклов случайного мутагенеза мы получили мутант люциферазы светляков Lucióla mingrelica со значительно возросшей термостабильностью. Полученные амикислотные замены также привели к повышению удельной активности и снижению константы Михаэлиса по АТР в 8 раз, что свидетельствует о более высокой каталитической эффективности мутанта. Показано, что использование случайного мутагенеза является высокоэффективным подходом для увеличения стабильности люциферазы.
Ключевые слова: люцифераза светляков, Lucióla mingrelica, случайный мутагенез, термостабильность, спектры биолюминесценции.
Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) катализирует реакцию окисления D-люциферина (LH2) кис-
2 2+
лородом воздуха в присутствии ATP и ионов Mg [1]. Она является одним из самых эффективных преобразователей энергии химической реакции в свет [2, 3]. Благодаря высокой каталитической активности, специфичности к ATP и простоте регистрации биолюминесцентного сигнала люцифераза светляков широко применяется в различных аналитических методах, основанных на определении ATP [4], используется в качестве гена-маркера [5], в пиросеквенировании и ряде других областей. Применение нативных люцифераз светляков часто ограничивается их низкой стабильностью при повышенных температурах. В частности, люцифераза светляков Lucióla mingrelica дикого типа при 37° теряет половину активности за 50 мин.
Проводилось множество работ по увеличению термостабильности люцифераз светляков с помощью случайного и сайт-специфического мутагенеза [6, 7]. Наиболее эффективным оказался метод направленной эволюции - улучшение требуемой характеристики фермента с помощью множества последовательных циклов случайного мутагенеза. Для люциферазы P. pennsylvanica таким способом был получен мутант, который даже при 65° лишь незначительно инактивировался за 5 ч [8]. Авторы применяли весьма сложную многостадийную схему отбора мутантов. Но простота регистрации биолюминесценции люциферазы in vivó и способность клеток
E. coli выдерживать повышенные температуры в принципе позволяют проводить простой нелетальный скрининг колоний клеток по термостабильности эксп-рессируемого фермента.
Цель данной работы состояла в изучении возможности повышения термостабильности люциферазы светляков с помощью случайного мутагенеза с последующим скринингом in vivo.
Материалы и методы
Использованные вещества и растворы. Использовали аденозин-5'-трифосфат (ATP), дитиотреитол (ДТТ), бычий сывороточный альбумин (БСА) ("Sigma", США), D-люциферин, полученный по методу [9], олигонуклеотиды ("Синтол", Россия). Для проведения реакции мутагенеза и клонирования требуемых фрагментов ДНК использовали ферменты TaqSE ДНК-полимеразу фага ("СибЭнзим", Россия), Taq ДНК-полимеразу, T4 ДНК-лигазу ("Силекс", Россия) и ряд рестриктаз фирм "СибЭнзим" (Россия), "Fermentas " (Литва) и "Boehringer Mannheim" (Германия). Для выделения плазмид из клеток E. coli и элюции фрагментов ДНК из агарозного геля использовали наборы фирмы "Qiagen" (Германия).
Случайный мутагенез участка гена между сайтами рестрикции XhoI и BglII (785 пар оснований) проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) пониженной точности (error prone PCR) [10]. В качестве прямого и обратного праймеров использовали соответственно
5'-GTATTCAGCTCGAGAAAAGGCTTACC-3' и
5'-GCTTGTGGTTTCTTAAGAATTTCTCTAATTAC-3'.
Реакционная смесь (50 мкл) содержала 10 мМ Трис-HCl (pH 8,3 при 25°С), 50 мМ KCl, 7 мМ MgCl2, 0,2 мМ MnCl2, 0,2 мМ dATP, 0,2 мМ dGTP, 1 мМ dCTP, 1 мМ dTTP, 20 пмоль каждого праймера, ~2 фмоль плазмиды pLR3 [11] (содержащей ген лю-циферазы светляков Lucióla mingrelica), 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. ПЦР проводили на амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Россия) при следующих условиях: 1 мин при 95°С, затем 25 циклов, каждый из которых включал 1 мин при 94°С, 1,3 мин при 53°С и 1 мин при 72°С; после этого инкубировали еще 10 мин при 72°С. Продукт ПЦР очищали с помощью электрофореза в 1%-й агарозе с последующим выделением из геля. Затем полученный фрагмент обрабатывали рестриктазами XhoI и BglII, очищали от низкомолекулярных продуктов рестрикции с помощью электрофореза, выделяли из геля и лигиро-вали в расщепленную по этим же сайтам плазмиду pLR3. Штамм E. coli XL1blue трансформировали полученной лигазной смесью, и клетки рассеивали на чашки Петри со средой LB, содержавшей 0,1 мг/мл ампициллина. При случайном мутагенезе желательно, чтобы на мутируемом участке в среднем была замена одной аминокислоты (2-3 замены нуклеотидов) [10], что обычно соответствует 50-60% активных клонов [12] в получаемой библиотеке. В данном методе частоту мутагенеза контролировали концентраци-2+
ей Mn , и при выбранных условиях наблюдалось 5570% активных мутантов люциферазы.
Скрининг библиотеки мутантов по термостабильности проводили, инкубируя чашки с колониями трансформированных клеток в течение 40 мин при повышенной температуре (37-55°С), что приводило к инактивации in vivo недостаточно стабильных форм люциферазы. Затем проводили фотографическую регистрацию биолюминесценции колоний in vivo, как описано в [11]. Оптимальным был скрининг рассева не более 2 тысяч колоний на чашке Петри (90 мм). Колонии, сохранявшие заметно более высокую яркость по сравнению с основной массой, переносили на чашки Петри со средой LB, содержавшей 0,1 мг/мл ампициллина. Для сравнения на эти же чашки переносили несколько колоний варианта люциферазы, ген которого использовали в качестве матрицы в текущем цикле мутагенеза. Клетки выращивали в течение ночи при 37°С. Проводили регистрацию биолюминесценции in vivo: для одной реплики - после вы-
ращнвання клеток, для другой - после инкубации при повышенной температуре в течение 40 мин.
Получение вектора для экспрессии люциферазы. Для наработки и очистки люциферазы сконструировали вектор pETL7. Сначала с помощью ПЦР с обратным мутагенным праймером
5'-GTGGTCGACTGGGCCCGATTGTGGTTTCTTAAGAATTTC-3'
получили фрагмент гена люциферазы, в котором были изменены три последние аминокислоты, после которых без разрыва рамки считывания добавлен сайт рестрикции Sali. Рестрикцией продукта ПЦР получили фрагмент BamHI-SalI. Рестрикцией плазмиды pLR3 получили фрагмент NheI-BamHI. После очистки оба фрагмента лигировали в вектор pET23b ("Novagen", США), разрезанный по сайтам NheI и XhoI. Липкие концы сайтов SalI и XhoI совместимы, и после лигирования оба сайта исчезают. Полученная в результате плазмида pETL7 содержала ген люциферазы, в котором по сравнению с нативным ферментом с N-конца добавлена последовательность MASK, а C-концевая последовательность AKM заменена на последовательность SGPVEHHHHHH. C-концевая 6хН18-последователь-ность позволяет производить очистку люциферазы с помощью металло-хелатной хроматографии. Кроме того, в концевом участке, кодирующем последовательность SGP, был добавлен новый сайт рестрикции ApaI, что позволяет клонировать в эту плазмиду концевую часть гена люциферазы.
Высокоочищенный фермент дикого типа и мутант получали на основе вектора pETL7. Ген мутанта для этого предварительно переклонировали из pLR3 в pETL7. Фермент экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3)CodonPlus, выделяли и очищали по методике, описанной в [11]. Концентрацию люциферазы определяли по оптической плотности раствора при 280 нм (0,75 ед. оптической плотности соответствует раствору, содержащему 1 мг/мл люциферазы).
Активность люциферазы определяли по величине максимальной интенсивности биолюминесценции при насыщающих концентрациях субстратов (1 мМ ATP и 0,3 мМ LH2) на люминометре FB 12 ("Zylux", США) [11]. Константы Михаэлиса для люциферина и ATP определяли, варьируя концентрации субстратов в пределах, соответствующих 0,4-7 величин Km. Расчет Km проводили с помощью программы Origin 7.5 по методу нелинейной регрессии с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен.
Изучение необратимой термоинактивации лю-циферазы. Готовили раствор фермента (0,01 мг/мл) в охлажденном в снегу буферном растворе TB1 (50 мМ трис-ацетат, pH 7,8, 20 мМ MgSO4, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл БСА), если не оговорено иное. В ряде экспериментов использовали буфер TB2 (50 мМ Na-фос-фат, pH 7,8, 410 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл БСА). В случае сравнительно медленной инактивации, когда период полуинактивации был более часа, инкубировали 1,0-1,5 мл раствора фермента в твердотельном термостате "Гном" ("ДНК-технология", Россия) при заданной температуре. В случае быстрой термоинактивации предварительно разливали по 50 мкл раствора фермента в 7-8 тонкостенных микропробирок (0,5 мл), а затем инкубировали в водяном термостате. Через определенные промежутки времени отбирали пробы по 50 мкл, инкубировали в снегу не менее 15 мин, а затем определяли активность фермента.
Спектры биолюминесценции регистрировали на люминесцентном спектрометре LS 50B ("Perkin-Elmer", США) в режиме "биолюминесценция" при ширине щели 10 нм в соответствии с условиями, описанными в [11].
Результаты и их обсуждение
Случайный мутагенез и отбор термостабильных мутантов. Так как для идентификации термостабильных мутантов использовали процедуру скрининга, не требовавшую разрушения клеток колоний E. coli, то это избавляло от необходимости получать реплики колоний, что заметно упрощало и ускоряло процесс отбора. Используемая схема ограничена способностью клеток E. coli выживать при повышенной температуре за время инкубации. Начиная с ~60°С клетки гибнут в течение 1-2 мин, т.е. при более высокой температуре использование реплик необходимо. Случайный мутагенез проводили на участке гена, кодирующем 130-391 из 548 аминокислотных остатков люциферазы. Провели четыре последовательных цикла мутагенеза, в каждом последующем цикле в качестве матрицы использовали наиболее стабильный мутант из предыдущего цикла. В качестве исходной формы для мутагенеза был взят мутант S118C [11], немного более стабильный, чем исходная люцифера-за. В ходе первого цикла был проведен скрининг ~800 колоний после роста при 37°С и обнаружено три клона с повышенной яркостью. Во втором, третьем и четвертом циклах условия и результаты были следующие: температура инкубации перед скринингом 50,
50 и 55°С; примерное число колоний 900, 580 и 1400; число найденных термостабильных мутантов 3, 3, 1 соответственно. Мутант 4TS, полученный после четвертого цикла мутагенеза, превосходил по стабильности in vivo все предыдущие мутанты: свечение его колоний сохранялось после 80 мин инкубации при 55°С, в то время как другие мутанты полностью инактивировались.
Секвенирование полученных мутантов показало, что мутант 4TS содержит 7 новых замен: после первого цикла мутагенеза появились замены Thr213Ser, Ser364Cys; после второго - Lys156Arg, Ala217Val; после третьего - Cys146Ser, Glu356Lys; после четвертого - Arg211Leu. Судя по порядку добавления замен, литературным данным и расположению остатков в структуре фермента, за увеличение термостабильности преимущественно ответственны только 4 замены: Arg211Leu, Ala217Val, Glu356Lys и Ser364Cys. Для мутаций Ala217Val [13] и Glu356Lys [6, 14] известно, что они значительно увеличивают термостабильность лю-цифераз светляков. Мутации Ser364Cys и Arg211Leu увеличивают термостабильность, по-видимому, за счет замены погруженной в белковую глобулу полярной группы на гидрофобную. Остаток Lys156 находится на поверхности белковой глобулы и окружен молекулами воды, поэтому его замена на близкий по свойствам Arg не должна существенно влиять на стабильность фермента. Замена внутреннего остатка Thr213 на близкий по свойствам Ser также, по-видимому, не является стабилизирующей. Ранее было показано [15], что замена поверхностной группы Cys146Ser заметно уменьшает окислительную инактивацию, что увеличивает стабильность фермента при 37°С в 1,5-4,7 раза в зависимости от условий, так что она также может давать вклад в стабилизацию 4TS.
Влияние мутаций на свойства люциферазы. Люцифераза дикого типа (WT) и мутант 4TS были получены в высокоочищенном виде. Их основные каталитические и биолюминесцентные характеристики приведены в таблице.
Показано, что рост термостабильности сопровождается повышением удельной активности мутанта в 1,9 раза. Уменьшение в восемь раз Km по ATP для мутанта 4TS свидетельствует о значительно большем сродстве фермента к ATP. С практической точки зрения это может способствовать более низкому пределу обнаружения ATP [4]. На рис. 1 приведены спектры биолюминесценции WT и 4TS при разных значениях pH и температуры. При стандартных реакционных условиях (pH 7,8; 25°С) у мутанта заметно
Физико-химические свойства люциферазы светляков Lucióla mingrelica дикого
типа (WT) и мутанта 4TS
Фермент Удельная активность, % Km, мкМ Максимум спектра биолюминесценции (полуширина), нм Время полуинактивации при 42°C, мин
lh2 АТР pH 7.8 pH 6.0
WT 100 71±5 330±60 566 (78) 616 (80) 9±0,3
4TS 190 60±5 41±8 573 (92) 609 (91) 592±20
Рис. 1. Спектры биолюминесценции люциферазы дикого типа (WT ) и мутанта 4TS: (а) при 25°C, pH 7,8 (1 - WT; 3 - 4TS) и рН 6,0 (2 - WT, 4 - 4TS) ; (б) при pH 7,8 и температуре 10, 25, 42°С (1, 2, 3 - WT; кривые 4, 5, 6 - 4TS соответственно)
20 30
Время, ч
Рис. 2. Кинетические кривые термоинактивации WT (1 и 2) и 4Т8 (3 и 4) в буферном растворе ТВ1 при 37°С (1 и 3) и 42°С(2 и 4)
Рис. 3. Зависимость константы скорости термоинактивации от температуры в координатах Аррениуса для WT (1 и 2) и 4Т8 (3 и 4) в буферных растворах ТВ1 (1 и 3) и ТВ2 (2 и 4)
Рис. 4. Кинетические кривые термоинактивации WT (1 и 2) и 4Т8 (3 и 4) при 45°С в буферных растворах ТВ1 (1 и 3) и ТВ2 (2 и 4)
возрастает доля "красного излучателя" в спектре по сравнению с WT (рис. 1, а), что приводит к ушире-нию и смещению максимума спектра биолюминесценции. Интересно, что несмотря на это при понижении рН сдвиг в красную область у мутанта происходит медленнее, чем у WT (рис. 1, а).
Сравнение спектров при температуре 10-42°С (рис. 1, б) показывает, что увеличение красной биолюминесценции у мутанта по сравнению с WT обусловлено более быстрым возрастанием доли этой компоненты спектра при повышении температуры. В работах [7, 14] показано, что повышение термостабильности мутантов часто сопровождается понижением чувствительности спектра к изменению рН и сдвигом максимума биолюминесценции в зеленую область, что объясняется уменьшением конформационной подвижности активного центра. Изучение термостабильного мутанта 4Т8 показывает, что в общем случае эти свойства независимы.
Кинетика термоинактивации исходной и мутантной люцифераз была изучена при 37-55°С в трис-ацетат-ном буферном растворе ТВ1, который близок по составу к буферу, применяемому на практике в АТР-метрии. Для сравнения термоинактивация была изучена в ^-фосфатном буфере ТВ2, который использовался в ряде работ по мутагенезу [6, 14] и значительно стабилизировал люциферазу.
При всех значениях температуры наблюдается инактивация по первому порядку за исключением 37°С в ТВ1, где у мутанта наблюдается короткий этап ускоренной (на 20%) инактивации, а затем переход на более медленную стадию (рис. 2). На рис. 3 показана зависимость константы термоинактивации (&ин) от температуры в координатах Аррениуса.
Результаты показывают, что мутации привели к значительной стабилизации люциферазы (рис. 2, 3). При 42°С в буферном растворе ТВ1 мутант стабильнее WT в 65 раз: время полуинактивации (¿1/2) возрастает с 9 до 592 мин (рис. 2). Как показано на рис. 3, при дальнейшем повышении температуры различие в стабильности постепенно сокращается (до 6 раз при 50°С). Буферный раствор ТВ2 вызывает существенную стабилизацию как исходной, так и мутантной люциферазы (рис. 3). Степень стабилизации также уменьшается с повышением температуры. В целом можно отметить, что степень стабилизации при конкретной температуре в изучаемом интервале тем выше, чем выше начальная стабильность (рис. 4). Поэтому в растворе ТВ2 наблюдается и более высокий стабилизирующий эффект мута-
ций, например при 45°С стабильность 4Т8 в ТВ2 выше стабильности в 155 раз (/1/2 возрастает с 12,7 до 2000 мин), в то время как стабильность 4Т8 в ТВ1 выше стабильности WT только в 16 раз (?1/2 возрастает с 2,8 до 44 мин) (рис. 4). Обычно люци-феразы используются в диапазоне температур от комнатной до 37°С. При этой температуре мутант Работа выполнена при финансовой
4TS через двое суток все еще сохраняет 70% активности, т. е. его стабильность достаточна для большинства практических применений.
Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000). поддержке РФФИ (проект 08-04-00624).
CnHCOK ËfflEPATyPbl
1. De LucaM. // Adv.Enzymol. 1976. 44. P. 37.
2. Seliger H.H., McElroy W.D. // Arch Biochem Biophys. 1960. 88. P. 136.
3. Ando Y., Niwa K., Yamada N., Enomoto T., Irie T., Kubota H., Ohmiya Y., AkiyamaH. // 1. Nature Photon. 2008. 2. P. 44.
4. LundinA. // Methods Enzymol. 2000. 305. P. 346.
5. Viviani V.R., Ohmiya Y. // Photoproteins in Bioanalysis. Weinheim. Wiley-VCH. 2006. P. 49.
6. White P.J., Squirrell D.J., Arnaud P., Lowe C.R., Murray J.A. // Biochem J. 1996. 319. P. 343.
7. Law G.H., Gandelman O.A., Tisi L.C., Lowe C.R., Murray J.A. // Biochem J. 2006. 397. P. 307.
8. Hall M.P., Gruber M.G., HannahR.R., Jennens-Clough M.L., Wood K. V. // Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for 21st Century. Chichester, Wiley. 1998. P. 200.
9. Талебаровская И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B., Щеголев A.A., Березин И.В. // Авт. св. № 1192324. 1983.
10. Cirino P.C., Mayer K.M., Umeno D. // Methods Mol. Biol. 2003. 231. P. 3.
11. Кокшаров M.И., Угарова H.H. // Биохимия. 2008. 74. С. 1071.
12. Shafikhani S., Siegel R.A., Ferrari E., Schellenberger V. // Biotechniques. 1997. 23. P. 304.
13. Kajiyama N., Nakano E. // Biochemistry. 1993. 32. P. 13795.
14. Kitayama A., Yoshizaki H., Ohmiya Y., Ueda H., Nagamune T. // Photochem Photobiol. 2003. 77. P. 333.
15. Ломакина Г. Ю., Модестова Ю.А., Угарова H.H. // Вести. Моск. уи-та. Сер. 2. Химия. 2008. 63. C. 63.
Поступила в редакцию 25.09.08
THE THERMOSTABILITY ENHANCEMENT OF Luciola mingrelica FIREFLY LUCIFERASE BY RANDOM MUTAGENESIS
M.I. Koksharov, N.N. Ugarova
(Divisiont of Chemical Enzymology)
Firefly luciferase has a wide range of applications in a number of areas of biotechnology and molecular biology, but its application is often limited by the rapid inactivation at elevated temperatures. After four consecutive rounds of random mutagenesis we obtained a Luciola mingrelica firefly luciferase mutant with significantly increased thermostability. Amino acid substitutions obtained also resulted in an increase of specific activity and lowered a Michaelis constant for ATP 8-fold, which shows higher catalytic efficiency of the mutant. Random mutagenesis was shown to be a highly efficient approach for increasing luciferase stability.
Key words: firefly luciferase, Luciola mingrelica, random mutagenesis, thermostability, bioluminescence spectra.
Сведения об авторах: Кокшаров Михаил Иванович - аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (mkoksharov@enz.chem.msu.ru); Угарова Наталья Николаевна — главный научный сотрудник кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, доктор химических наук, профессор (nugarova@gmail.com).
