CC BY
18
УДК 577.158.54
ПОВЫШЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ
СВЕТЛЯКОВ Lucióla mingrelica САЙТ-НАПРАВЛЕННЫМ
МУТАГЕНЕЗОМ НЕКОНСЕРВАТИВНЫХ ОСТАТКОВ
ЦИСТЕИНА 62 и 146
Г.Ю. Ломакина, Ю.А. Модестова, Н.Н. Угарова
(кафедра химической энзимологии; e-mail: lomakina@enz.chem.msu.ru)
Методом сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы люциферазы светляков L. mingrelica с единичными заменами Cys62Ser и Cys146Ser. Мутации не повлияли на каталитическую активность фермента и спектры флуоресценции. Определены константы скорости быстрой (Ä1) и медленной (k2) стадии термоинактивации для исходного и мутант-ных ферментов при 37°С в отсутствие и в присутствии 12 мМ дитиотреитола (ДТТ). Показано увеличение стабильности мутантных форм люциферазы в несколько раз по сравнению с исходным ферментом - в присутствии ДТТ константа k2 для исходного фермента снижается в три раза, а для мутантных форм константы k1 и k2 практически не изменяются. Сделан вывод о том, что остатки Cys62 и Cys146 играют заметную роль в процессе инактивации люциферазы и их замены на Ser приводят к стабилизации фермента.
Люцифераза светляков - фермент, относящийся к подклассу оксигеназ класса оксидоредуктаз, катализирующий окисление D-люциферина (LH2) кислородом
2+
воздуха в присутствии АТР и ионов Mg [1]. Это один из самых высокоспецифичных биокатализаторов и эффективных преобразователей энергии биохимической реакции в световую энергию, что обусловливает широкое биоаналитическое применение этого фермента [2]. Для люцифераз характерно наличие свободных реакционно-способных SH-групп остатков цисте-ина. Люциферазы из разных источников содержат от 4 до 13 свободных SH-групп, причем чем их больше, тем менее стабильным является фермент [3, 4]. Например, люцифераза светляков P. pyralis содержит 4 SH-группы и является более стабильной, чем люциферазы рода Lucióla, содержащие 7-8 SH-групп. Еще менее стабильны люциферазы из ямайских жуков-щелкунов семейства Elateridae, в состав которых входят 13 SH-групп. Люциферазы содержат 3 абсолютно консервативных остатка Cys, которые не входят в состав активного центра, хотя могут заметно влиять на активность. Так, мутант с заменой всех четырех остатков Cys на Ser в молекуле люциферазы P. pyralis сохранил лишь 6% активности, а мутанты с единичными заменами теряли 20-60% активности [5, 6]. В то же время единичные замены консервативных остатков Cys82, Cys260, Cys393 на Ala в лю-циферазе светляков L. mingrelica практически не повлияли на каталитические свойства и стабильность фермента [7]. По-видимому, значительные различия в
стабильности люцифераз обусловлены количеством неконсервативных остатков Cys, особенно тех, SH-группы когорык находятся вблизи или на поверхности белковой глобулы и более доступны для окисления. Титрованием SH-групп показано, что вблизи поверхности молекулы люциферазы светляков P. pyralis находится один остаток цистеина [8], а в люциферазе L. mingrelica - три [9]. Следует отметить, что добавки дитиотреитола (ДТТ) замедляют инактивацию фермента, что свидетельствует об участии SH-групп остатков Cys в этом процессе. Поэтому можно ожидать, что замена остатков Cys на более устойчивые к окислению аминокислотные остатки приведет к повышению стабильности люциферазы.
Цель данной работы состояла в выяснении возможности повышения термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica путем единичных замен остатков Cys цистеина 62 и 146 методом сайт-направленного мутагенеза.
Материалы и методы
Использовали аденозин-5'-трифосфат (АТР), дитио-трейтол (ДТТ) ("ICN", США), D-люциферин, полученный по методу [10], олигонуклеотиды (ЗАО "Син-тол", Россия), рестриктазы NheI ("Fermentas", Канада), BamHI ("Boehringer Mannheim", Германия), T4 DNA лигазу, DNA полимеразы Pfu и Pfu Turbo, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов ("СибЭнзим", Россия). Для культивирования клеток использовали среду LB с ампициллином. Для выщеления плазмид из
клеток E. coli и элюции фрагментов ДНК из агароз-ного геля использовали наборы Qiagen.
Получение мутантных форм люциферазы L. mingrelica. Сайт-направленный мутагенез проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя плазмиду pLR, несущую ген люциферазы светляков L. mingrelica, и следующие олигонуклео-тиды: 5'-GATATTACATCTCGTTTAGCTGAGGCC ATG-3' (для получения фермента с заменой Cys62Ser) и 5'-CCACGATTCTATGGAAACTTTTATTAAG-3' (для получения фермента с заменой Cys146Ser). Компетентные клетки E. coli штамм LE 392 трансформировали соответствующей плазмидой и использовали для наработки и очистки препаративных количеств фермента по методу [7]. Высокоочищенный фермент хранили при -70°С в рабочем буфере (0,05 М Трис-ацетат, содержащий 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, рН 7,8). Степень чистоты ферментов определяли с помощью SDS-электрофореза по Лэммли в 12%-м полиакриламидном геле с использованием ячейки Miniprotean II ("Bio-Rad", США) с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Концентрацию белка определяли по оптической плотности раствора при 280 нм (0,75 ед. опт. пл. соответствует раствору, содержащему 1 мг/мл белка люциферазы).
Определение активности люциферазы. Активность фермента определяли по величине максимальной интенсивности биолюминесценции при насыщающих концентрациях субстратов (1 мМ АТР и 0,3 мМ LH2) на люминометре "FB 12 Femtomaster" ("Zylux Corp", США) [7]. Константы Михаэлиса для люци-ферина и ATP определяли, варьируя концентрации субстратов в пределах 0,04-0,4 мМ АТР при 1 мМ LH2
и 4-40 мкМ LH2 при 4 мМ АТР при концентрации
8 2
фермента 5-10 М. Расчет констант Km проводили с помощью программы Origin 6.0.
Изучение термоинактивации люциферазы светляков. Растворы исходной люциферазы и ее
—8 —7 —6
мутантных форм (концентрации 10 , 10 и 10 М) в рабочем буфере помещали в микропробирки (по 30 мкл в каждую) и инкубировали при 37°С в присутствии или в отсутствие 12 мМ ДТТ. Через определенные промежутки времени отдельные микропробирки вынимали из термостата и помещали в лед, где хранили вплоть до измерения активности. По экспериментальным данным строили кинетические кривые зависимости активности люциферазы от длительности инкубирования фермента при 37°С, обработка которых позволила найти константы скорости инактивации фермента.
Спектры собственной флуоресценции люциферазы регистрировали на спектрофлуориметре "LS 50B" ("Perkin Elmer", Англия) при концентрации фермента 10 М в рабочем буфере.
Результаты и их обсуждение Получение мутантых люцифераз и изучение их физико-химических свойств. Молекула люцифе-разы светляков L. mingrelica содержит восемь остатков Cys, из них три являются консервативными (82, 260, 393) и пять — неконсервативными (62, 86, 146, 164, 284) (рис. 1). Анализ пространственной структуры молекулы показал, что остатки Cys62 и Cys146 расположены на поверхности белковой глобулы и имеют гидрофильное микроокружение, поэтому для замены был выбран устойчивый к окислению серин, имеющий гидрофильные свойства и близкий к остатку Cys по размеру. Мутантные плазмиды, кодирующие замены Cys62Ser и Cys146Ser, были получены методом ПЦР на основе плазмиды pLR, несущей ген люциферазы светляков L. mingrelica. Были использованы олигонуклеотиды длиной 27—28 пар оснований с заменой одного нуклеотида TGT на TCT. Штамм E. coli LE392 был использован для хранения плазмид и экспрессии люциферазы. Исходный фермент и его мутантные формы были очищены хроматографичес-
Рис. 1. Пространственная структура люциферазы светляков Luciola mingrelica
0 10 20 30 40
t, мин
Рис. 2. Кинетические кривые термоинактивации иcxoднoй люциферазы светляков L. mingrelica при З7°С в отсутствие дитиотреитола. Концентрация фермента, M: 1 — 10—6, 2 — 107, 3 — 108 (другие условия те же, что в табл. 1)
ки. Bыxoд активного фермента во вcex cлyчaяx составил 45—60 мг в расчете на 1 л питательной среды. Чистота препаратов по данным белкового электрофореза составляла 90—95%. Было показано, что удельная активность мутантного фермента с заменой Cys62Ser равна активности иcxoднoгo фермента, а активность мутантного фермента с заменой Cys146Ser оказалась в 1,5 раза выше. Константы Mиxaэлиca по обоим субстратам для иcxoднoй и му-ташные люцифераз совпали в пpeдeлax погрешности: кт,LH2 = 20±З мки и Кт АГР = 0,18±0,04 мM. Taким образом, данные мутации не повлияли на сродство фермента к субстратам. Это можно объяснить тем, что остатки Cys62 и Cys146 удалены от активного центра фермента более чем на 30 и не оказывают заметного влияния на его конформацию. Спектры собственной флуоресценции (^макс = 340 нм) иcxoднoй люциферазы и ее мутантные форм также практически не отличались друг от друга. Следовательно, мутации остатков Cys62 и Cys146 не привели к изменению микроокружения остатка Trp419, расположенного вблизи активного центра.
Инактивация люциферазы светляков при 37°C. Tepмoинaктивaция иcxoднoй люциферазы и ее
мутантные форм была изучена при З7°С при разные
—6 —8
кoнцeнтpaцияx фермента (10—10 M) в присутствии и в отсутствие Д^. Кинетические кривые инактивации описываются двумя экспонентами, соответствующими быстрой и медленной стадиям инактивации (рис. 2, 3). Taкoй вид кинетически кривые и наличие на ниx точки излома в пoлyлoгapифмичecкиx коорди-нaтax xapaктepны для oлигoмepныx ферментов, к которым относится люцифераза светляков [11-13]. Рассчитанные из экспериментальные данные константы
скорости быстрой (к^ и медленной (к2) стадии инактивации исходного фермента (табл. 1) зависят от концентрации фермента - чем выше его концентрация, тем фермент стабильнее. При высокой концентрации фермента (10-6 М) излом на кинетической кривой менее выражен, что объясняется, по-видимому, существованием в этих условиях более стабильных олиго-мерных форм фермента. При этом константы к1 и к2 близки и для исходной и для мутантных форм люци-феразы. При снижении концентрации фермента до 10 М и ниже значения констант к1 и к2 увеличиваются как для исходной, так и для мутантных люцифераз. Глубина инактивации фермента на быстрой стадии тем больше, чем ниже его исходная концентрация. Обычно это связывается с диссоциацией оли-гомерного фермента на субъединицы, имеющие более
з J-■-.-.-.-■
0 10 20 30 40 50
t, мин
3 -I-■-.-■-■-■
0 10 20 30 40 50
t, мин
= 2 -
3 \-,-,-,-,-.
0 10 20 30 40 50
t, мин
Рис. 3. Кинетические кривые термоинактивации при 37°С исходной люциферазы светляков L. mingrelica (à) и ее мутантных форм с заменами Cys62Ser (б) и Cys146Ser (в) в отсутствие (1) и в присутствии 12 мМ дитиотреитола (2). Концентрация фермента 10 7 M (другие условия те же, что в табл. 1)
Т а б л и ц а 1
Константы скорости термоинактивации исходной люциферазы светляков L. mingrelica и ее мутантных форм при 37°С в отсутствие ДТТ при различных концентрациях фермента (условия: 0,05 М Трис-ацетатный буферный раствор, содержащий 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, рН 7,8)
Концентрация фермента, М Исходный фермент Мутантные формы люциферазы с заменами:
Cys62Ser Cys146Ser
-1 к1, мин -1 к2, мин -1 к1, мин -1 к2, мин -1 к1, мин -1 к2, мин
10-6 0,05±0,01 0,016±0,005 0,06±0,02 0,020±0,006 0,04±0,01 0,012±0,003
10_7 0,34±0,02 0,074±0,003 0,10±0,01 0,016±0,005 0,06±0,01 0,016±0,004
10-8 0,39±0,04 0,070±0,009 0,16±0,03 0,034±0,009 0,07±0,02 0,015±0,003
Т а б л и ц а 2
Константы скорости термоинактивации исходной люциферазы светляков L. mingrelica и ее мутантных форм при 37°С в отсутствие и в присутствии 12 мМ дитиотреитола (концентрация фермента l0-7 М, другие условия те же, что в табл. 1)
Фермент В отсутствие ДТТ В присутствии ДТТ
-1 к , мин 1 -1 к , мин 2 -1 к , мин 1 -1 к , мин 2
Исходный 0,34±0,02 0,074±0,003 0,33±0,03 0,023±0,006
Cys 62Ser 0,10±0,01 0,016±0,005 0,04±0,02 0,010±0,005
Cys146Ser 0,06±0,01 0,016±0,004 0,05±0,02 0,015±0,003
низкую ферментативную активность [13]. При этом при низких концентрациях люциферазы константы к1 и к2 для мутантных форм оказались в 4-5 раз меньше по сравнению с исходным ферментом, а период полупревращения активного фермента (т1/2) на медленной стадии инактивации возрос с 9 мин для исходного фермента до 43 мин для мутантных форм фермента. Таким образом, мутации Cys62Ser и Cys146Ser привели к заметному повышению стабильности фермента на обеих стадиях инактивации.
Как известно, ДТТ защищает SH-группы в молекулах ферментов от окисления и тем самым предотвращает инактивацию, обусловленную окислением SH-групп. Чтобы сравнить влияние ДТТ на стабильность исходной и мутантных люцифераз, были получены кинетические кривые инактивации при концентрации фермента 10 M в присутствии и в отсутствие 12 мМ ДТТ (рис. 3). Рассчитанные константы инак-
тивации на быстрой и медленной стадиях представлены в табл. 2. Для исходного фермента в присутствии ДТТ константа инактивации к1 не изменяется, а константа к2 снижается в три раза (рис. 3, а и табл. 2). Следовательно, добавки ДТТ стабилизируют исходную люциферазу только на второй стадии инактивации. По-видимому, в отсутствие ДТТ константа к2 представляет собой сумму констант денатурации и инактивации фермента за счет окисления SH-групп остатков Cys, а в присутствии ДТТ _ константу денатурации. Таким образом, окисление SH-групп остатков Cys вносит ощутимый вклад в инактивацию люцифе-разы на медленной стадии. Для мутантной люцифе-разы с заменой Cys62Ser присутствие ДТТ привело к снижению константы инактивации к1 в 2 раза, но почти не изменило константу к2 (рис. 3, б и табл. 2). Для мутантной люциферазы с заменой Cys146Ser присутствие ДТТ не повлияло на обе константы инакти-
вации, k1 и k2 (рис. 3, в и табл. 2). Следовательно, единичные замены остатков Cys на Ser привели к тому, что оба мутантных фермента оказались нечувствительными к присутствию ДГТ При этом константы k2 для исходного фермента в присутствии ,ЩТ стали близки к константам k2 мутантных форм люциферазы. Taким образом, мутантные ферменты с заменами Cys62Ser и Cys146Ser как в присутствии, так и в отсутствие ^TT являются более стабильными по сравнению с исходным ферментом. Полученные результаты свидетельствуют об участии остатков Cys62 и Cys146 в окислительной инактивации люци-феразы. По-видимому, эти остатки важны для поддержания активной конформации люциферазы, и окисление SH-групп этих остатков приводит к ее нарушению. Замена остатков Cys на Ser привела к стабилизации локальной конформации молекулы, тем самым
СПИСОК ЛИTEPATУPЫ
1. De Luca M. //Adv. Enzymol. 1976. 44. P. 37.
2. Угapoвa H.H., Бpoвкo Л.Ю., Кутузова Г.Д.// Биохи-мия.1993. 58. С. 1351.
3. Devine T.N., Kutuzova G.D., Green VA. et al. // Biochim.
Biophys. Acta. 1993. 1173. P. 121.
4. Branchini B.R., Southworth T.L., Murtiashaw M.H. et al. //
Biochemistry. 2004. 43. P. 7255.
5. Ohmiya Y., TsujiF.I. // FEBS Lett. 1997. 404. P. 115.
6. Kumita J.R., Jain L., Safroneeva E., Woolley G.A. // Biochem.
Biophys. Res. 1. Commun. 2000. 267. P. 394.
7. Дeмeнmьeвa E.H., Кутузова Т.Д., Жeлeзнoвa E.E.,
Лундовских H.A., Угapoвa H.H. // Биохимия. 1996. 61. С. 152.
обеспечив сохранение ферментативной активности при 37°С. Элиминирование поверхностных остатков Cys, SH-группы которыгс экспонированы в растворитель, привело к снятию эффекта окислительной инактивации фермента на второй, медленной, стадии. Кроме того, замена слабо гидрофобныгс остатков Cys62 и Cys146, расположенный в гидрофильном микроокружении, на гидрофильный остаток Ser, по-видимому, способствовала образованию более компактной и стабильной конформации молекулы, которая является более стабильной и на первой стадии инактивации фермента.
Таким образом, остатки цистеина 62 и 146 играют заметную роль в инактивации люциферазы как на первой, так и на второй стадии инактивации фермента, и их замены на серин привели к стабилизации фермента в несколько раз.
8. Alter S.C., DeLucaM. // Biochemistry. 1986. 25. P. 1599.
9. Бровко Л.Ю., УгароваH.H. // Биохимия. 1980. 45. С. 794.
10. Талебаровская И.К., Каткова В.А., Рыжова В.В., Щего-лев А.А., БерезинИ.В. //Авт. св. № 1192324. 1983.
11. Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова H.H. // Биохимия. 1982. 47. С. 760.
12. ЛундовскихИ.А., ДементьеваЕ.И., УгароваH.H. // Вести. Моск. уи-та. Сер. 2. Химия. 2000. 41. С. 362.
13. Полторак О. М., Чухрай Е. С., Торшин И. Ю. // Биохимия. 1998. 63. С. 360.
Поступила в редакцию 23.11.07
THE THERMOSTABILITY ENHANCEMENT OF FIREFLY LUCIFERASE Luciola mingrelica BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS OF NON-CONCERVATIVE RESIDIES Cys62 AND Cys146 G.Yu.Lomakina, Yu.A.Modestova, N.N.Ugarova
(Division of Chemical Enzymology)
Mutant forms of L.mingrelica firefly luciferase with point mutations Cys62Ser and Cys146Ser were prepared by site-directed mutagenesis. Mutations were not influenced the catalytic and spectral properties of the enzyme. Fast (k1) and slow (k2) inactivation rate constants at 37°C for wild type enzyme and its mutants with or without DTT were determined. Several times increase of mutant forms thermostability on both stages of the inactivation was shown. For wild type enzyme three-fold decrease of k2 value in the presence of DTT was shown while k1 and k2 values for mutant forms were not changed. Thus it was concluded the significance of Cys62 and Cys146 residues in the L.mingrelica firefly luciferase inactivation process and their replacements to Ser resulted in the enzyme stabilization.
