CC BY
66
0
ИССЛЕДОВАНИЯ / Формирование характеристик мяса
Полиморфизм ДНК-маркеров,
ассоциированных с качеством мяса у свиней трехпородного скрещивания
И. М. Чернуха, доктор техн. наук,
ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В. М. Горбатова Россельхозакадемии
О. А. Шалимова, доктор биол. наук, В. И. Крюков, доктор биол. наук, Н. Г. Друшляк, канд. биол. наук, М. В. Радченко, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный Университет»
Одним из актуальных направлений формирования оптимальных характеристик мяса является маркерная селекция и генетический мониторинг, предусматривающие использование ДНК-маркеров, ассоциированных с уровнем проявления хозяйственно-ценных признаков и наследственных заболеваний [1].
^ В условиях увеличения производства и потребления продукции свиноводства особое внимание должно уделяться ее качеству [2]. Специалисты ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова на основании предпочтений покупателей и мясоперерабатывающих предприятий разработали требования, предъявляемые к качеству мясного сырья. Наиболее важными из них являются:
- гарантированная безопасность;
- предубойная масса до 100 кг;
- выход мышечной ткани свыше 60%;
- низкая доля сырья с пороками PSE и DFD;
- доля внутримышечного жира от 1,0 до 5,5%;
- площадь мышечного глазка свыше 35 см2;
- высокие органолептические показатели [3].
В мясном скотоводстве определяющими факторами являются откормочные и мясные качества животных, к важнейшим из которых относится: скороспелость, среднесуточный прирост, уровень расхода корма и выход мышечной ткани.
Цель настоящей работы состоит в генотипировании свиней
трехпородного скрещивания ландрас х йоркшир х дюрок (ЛхИхД) канадской селекции, выращенных на свинокомплексе ОАО «Агрофирма «Ливенское мясо» по локусам, ассоциированным с генами, влияющими на рост животных и качество мяса.
В задачи исследования входит изучить у трехпородных гибридов ЛхИхД:
— полиморфизм гена риа-нодинового рецептора (RYR1);
— полиморфизм гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP);
— полиморфизм гена рецептора меланокортина 4 (MC4R).
Материалы и методы исследований.
В качестве исходного материала использовали кровь от 130 свиноматок и хряков в возрасте 8-10 месяцев. ДНК выделяли с помощью набора DIAtom™ DNA Prep100 («Биоком», Россия). Генотипирование осуществляли методом ПЦР-ПДРФ (полимеразно-цепной реакции полиморфизма длин рестрик-ционных фрагментов) в соответствии с ранее описанными методиками [4]. Амплификацию проводили с помощью набора реагентов GenPak PCR Core («Биоком», Россия) в термоцик-лере MyCycler (BioRad США).
УДК: 637.5'64.05:636.082.12
Ключевые слова: свиньи, гибриды, ландрас, йоркшир, дюрок, ПЦР, ДНК-диагностика, полиморфизм, RYR1, H-FABP, MC4R, качество мяса.
Результаты и их обсуждение.
В связи с повышенным спросом потребителей на мясную свинину в свиноводстве используют селекционные программы, направленные на разведение животных с сильным развитием спинной части и окорока и с одновременным уменьшением содержания жира в туше. Однако оказалось, что селекция на «мяс-ность» сопровождается определенными негативными последствиями и, в первую очередь, связана с нежелательной повышенной чувствительностью свиней к стрессам, что снижает качество свинины и формирует появление специфического порока, получившего название PSE (pale - бледный, soft - мягкий, exudative - экссудативный) [5].
Fujii J. с соавт. (1991) выявили точковую мутацию в риа-нодин-рецепторном гене, возникающую в результате замены цитозина на тимин в позиции 1843 нуклеотидной последовательности, что приводит к синтезу в 615 позиции полипептидно цепи рианодин-рецепторного белка аргинина вместо цестеина. Это является предполагаемой причиной возникновения стрессчув-ствительности, крайним проявлением которой является гипертермический синдром. Живот-
30
ВСё О МЯСЕ № 2 апрель 2013
Формирование характеристик мяса / ИССЛЕДОВАНИЯ
iЕР
ные, имеющие генотип NN, являются устойчивыми к стрессам, генотип nn - стрессчувствитель-ными, гетерозиготы с генотипом Nn являются носителем гена стрессчуствительности [6,7].
Методом ПЦР-ПДРФ нами получен специфический фрагмент RYRl-гена свиней, представляющий собой нормальные доминантные алели, либо аллели, в которых возможна искомая рецессивная мутация. Полученные амплификаты подвергли рестрикции эндонуклеазой Hindi. При помощи маркера были определены длины фрагментов рестрикции: два фрагмента, состоящих из 149 и 123 пар нук-леотидов (п.н.), представляют генотип NN, три фрагмента в 272, 149 и 123 п.н. соответствуют гетерозиготному генотипу Nn (рис. 1). Рецессивных гомозиготных генотипов nn (один фрагмент рестрикции 272 п.н.) не обнаружили.
Проведенными исследованиями установлено, что у трех-породных гибридов ЛхЙ>Д не был выявлен стрессчувствитель-ный генотип - nn гена RYR1, гетерозиготная форма генотипа Nn встречалась с частотой 1,54%, а гомозиготный генотип доминантной формы встречается у 98,46% животных.
Небольшое количество гетерозиготных и отсутствие рецессивных гомозиготных носителей является следствием гетерозиса, поскольку свиньи породы дюрок обладают высокой устойчивостью к стрессам. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Sieczkowska H. и соавт. (2009), установившими отсутствие гетерозиготных и рецессивных гомозиготных генотипов по гену RYR^ популяции трехпородных гибридов ЛхЙхД датской селекции [8].
Согласно правилам менделев-ского наследования половина потомков, полученных от скрещивания гетерозиготных животных по гену RYR1 с нормальными гомозиготными животными, будут иметь гетерозиготный генотип. При скрещивании гетерозиготных хряков с гетерозиготными свиньями наряду с гомозиготным
доминантными и гетерозиготными потомками будут появляться гомозиготные рецессивные особи nn примерно в соотношении 1:2:1. Все это будет способствовать сохранению и увеличению уровня встречаемости мутантного аллеля гена RYR1 в следующих поколениях животных. При этом в условиях производства в промышленных хозяйствах, в отличие от племенных, целесообразно использовать животных не только с генотипом NN, но и с генотипом Nn, что будет способствовать получению мяса с высокими качественными и органолептиче-скими показателями. Животные со стрессчувствительным генотипом nn должны подлежать выбраковке.
Одним из важных показателей качества мяса является содержание внутримышечного жира, под которым понимают сумму внутриклеточных, межклеточных и межволоконных жировых компонентов. Содержание внутримышечного жира определяет такой показатель как мраморность мяса. По мнению ряда исследователей, одним из наиболее перспективных генов, оказывающих влияние на содержание внутримышечного жира в тушах свиней, является ген H-FABP [9, 10]. Его биологиче-
ская особенность заключается в кодировании белков, участвующих в липидном обмене, основная функция которых - связывание длинных цепочек жирных кислот и перенос их внутри клетки к различным органеллам. Таким образом, в процессе ли-пидного обмена происходит жироотложение между волокнами мышечной ткани, что способствует увеличению мраморности мяса [11].
Gerbens и соавт. (1999) выявили три аллели (A, D и H) гена H-FABP, обусловливающие три класса полиморфизма, и установили, что аллель d (рецессивный аллель) ассоциирована с повышенным содержанием внутримышечного жира [12].
В то же время, Nechtelberger и соавт. (2001), Ovilo и соавт. (2002), Urban и соавт. (2002) показывают отсутствие достоверных корреляций между содержанием внутримышечного жира, темпов роста и генотипами по H-FABP [13,14,15].
Фрагменты, полученные при ПЦР-ПДРФ анализе полиморфизма гена H-FABP, «разрезаны» и разделены в агарозном геле с помощью эндонуклеазы HaeIII. Для D аллеля характерно присутствие двух фрагментов: 683 и 117 пн. У аллеля d присутствуют три фрагмента - 405, 278
Рисунок 1. Электрофореграммы ПЦР-ПДРФ генотипирования по локусу RYR1 (М - маркер молекулярного веса)
Рисунок 2. Электрофореграммы ПЦР-ПДРФ генотипирования по локусу H-FABP(M - маркер молекулярного веса)
№ 2 апрель 2013 ВСЁ О МЯСЕ
31
0
ИССЛЕДОВАНИЯ / Формирование характеристик мяса
и 117 пн. У гетерозиготных животных Dd присутствуют все 4 фрагмента - 683, 405, 278 117п.н. (рис. 2).
Проведенные нами генетические исследования гибридных свиней Л * Й х Д выявили относительно высокую частоту встречаемости предпочтительного генотипа dd - 40% (рис. 3). Животные с этим генотипом, по данным Gerbens и соавт. (2001), отличаются повышенной мраморностью мяса по сравнению со свиньями с генотипами Dd и DD [16]. Это можно использовать в качестве селекционного параметра при селекции свиней по содержанию внутримышечного жира.
Сгласно нашим исследованиям, частота встречаемости гомозиготных и гетерозиготных особей гена H-FABP у свиней трехпородного скрещивания Л *Й * Д составила 29% и 31%, соответственно. По данным Арсиенко Р. Ю. (2003) животные с генотипом DD характеризуются более высокими темпами роста по сравнению с гетерозиготными и рецессивными гомозиготными особями, что объяснимо повышенным отложением жира в туше [17].
Полиморфизм гена мелано-кортина рецептора-4 (MC4R) связан с показателями энергии роста свиней. Ген MC4R локализован в хромосоме 1 (SSC1) q22-q27, его полиморфизм обусловлен точечной мутацией G^A в позиции 1426, в связи с чем происходит аминокислотная замена Asp298Asn в МС4-рецепторе. Изменение первичной структуры МС4-рецептора нарушает процессы регулирования секреции клеток жировой ткани. Это влечёт за собой нарушение липидного обмена и отражается на процессе формирования признаков, характеризующих откормочные и мясные качества свиней [18].
Гомозиготные свиньи с генотипом AA достигают рыночного веса на три дня быстрее, чем свиньи генотипа GG. В то же время свиньи с генотипом GG отличаются более высокой конверсией корма и в их тушах
Рисунок 3. Частота встречаемости генотипов гена H-FABP, %
на 8% меньше сала [19].
Методом ПЦР-ПДРФ нами получен специфический фрагмент гена MC4R. Для А аллеля характерно отсутствие сайта узнавания рестриктазы TaqI поэтому фрагмент, полученный при ПЦР остаётся неизменным - 226 п.н. У аллеля G есть сайт узнавания - ре-стриктаза «режет» ПЦР фрагмент на две части - 156 п.н. и 70 п.н., поэтому у гомозигот GG в геле два фрагмента - 156 и 70 п.н., а гомозигот АА один фрагмент - 226 п.н., и у гетерозиготных животных (АG) в геле обнаруживаются три фрагмента: 226, 156 и 70 п.н. (рис.4).
ПЦР-ПДРФ генотипирова-нием установлено, что частота распространения гетерозиготного генотипа AG составляет 47,69% (рис.5). Исследованиями Гетманцевой Л. В. (2012) установлено, что трех-породные гибриды ЛхЙхД генотипа AG отличаются меньшей толщиной шпика на 13,2%, большей массой задней трети полутуши на 3,45%, площадью «мышечного глазка» на 10,5%,
убойным выходом на 1,36% и выходом мышечной ткани на 2,2% по сравнению с аналогами генотипа АА [20]. Следовательно, тестируемые животные характеризуются высокими откормочными и мясными качествами.
Частота распространения генотипа АА у протестированных гибридов Л хЙх Д составила 20%, а генотипа GG -32,31%. Таким образом, производитель может формировать специализированные линии, выбирая генотип, связанный с быстрым ростом (АА) или генотип, связанный с «постным и эффективным приростом» (GG). Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Максимова Г. В. и соавт. (2011), определивших генотипическую структуру стада гибридов Л хЙ х Д в ЗАО «Русская свинина» Ростовской области [21]. Однако необходимо отметить, что в исследованной популяции трехпород-ных гибридов присутствует более высокий процент животных с генотипом GG. Это объясняется использованием раз-
Рисунок 4. Электрофореграммы ПЦР-ПДРФ генотипирования по локусу MC4R (М - маркер молекулярного веса)
32
ВСЁ О МЯСЕ № 2 апрель 2013
Формирование характеристик мяса / ИССЛЕДОВАНИЯ
iЕР
ных селекционных стратегии в ОАО «Агрофирма «Ливенское мясо» и ЗАО «Русская свинина».
Выводы.
Проведенные нами генетические исследования свинеИ трехпородного скрещивания ландрас х Иоркшир х дюрок, выращенных на свинокомплексе ОАО «Агрофирма «Ли-венское мясо» позволили:
— выявить высокиИ генетический потенциал стрессу-стоИчивости, оцененныИ по маркеру RYR1, у 98,46%, протестированных животных го-мозиготныИ генотип доминант-ноИ формы;
— установить значительную (40%) долю предпочтительного рецессивного генотипа dd по гену H-FABP в исследуемоИ популяции животных;
— выполнить оценку генетического потенциала скороспелости и постности с использованием маркера MC4R. Частота встречаемости желательного генотипа AG составила 47,69%.
Проведенные исследования свидетельствуют о необходимо-
Рисунок 5. Частота встречаемости генотипов гена MC4R, %
сти использования в селекции свинеИ ДНК-диагностики по генам RYR1, H-FABP, MC4R в качестве дополнительного критерия отбора животных с более высокими откормочными и мясными показателями.
Контакты:
Друшляк Наталья Геннадьевна
+7(4862) 47-5171
Крюков Владимир Иванович
+7(4862) 47-5171
Радченко Михаил Васильевич
+7(4862) 47-5171
Чернуха Ирина Михайловна
+7(495) 676-7211
Шалимова Оксана Анатольевна
+7(4862) 47-51-71
Литература
1. Зиновьева Н.А., Кленовицкий П.М., Гладырь Е.А., Никишов А.А. Современные методы генетического контроля селекционных процессов и сертификация племенного материала в животноводстве: Учеб. пособие. М.: РУДН, 2008. 329 с.
2. Лисицын А.Б., Татулов Ю.В., Чернуха И.М., Миттельштейн Т.М. Мировая практика формирования качества мясного сырья и требования к нему перерабатывающей промышленности // Мясная индустрия. 2001. №9. С. 6-9.
3. Лисицын А.Б. Требования к качеству свинины для промышленной переработки. Перспективы росийско-канадского сотрудничества // Все о мясе. 2011. №4. С. 8-11.
4. Крюков В.И., Пикунова А.В., Друшляк Н.Г. Использование ДНК-маркеров в селекции свиней // Вестник Орел ГАУ. 2011. №1. С. 36-40.
5. Рыжова Н.В. Полиморфизм гена RYR1 в популяциях свиней мясной пород: дис. на соиск. учен. степ. канд. биолог. наук. - п. Лесные Поляны, Московской обл., 2001. 125 с.
6. Fuji i J., Kinya O., Zorzato F., Leon S., Khanna V.K., Weiler J.E. Identification of a Mutation in Porcine Ryanodine Receptor Associated with Malignant Hyperthermia // Science. 1991 V. 253. P. 448-451.
7. Рыжова Н.В., Калашникова Л.А. Ген RYR1 и продуктивность свиней мясных пород // Животноводство России. 2003. № 9. С. 46-47.
8. Sieczkowska H., Kocwin-Podsiadla M., Krz§cio E., Antosik K., Zybert A. Quality and technological properties of meat from Landrace-Yorkshire x Duroc and Landrace-Yorkshire x Duroc-Pietrain fatten-ers // Pol. J. Food Nutr. Sci. 2009. V. 59. №.4. Р. 329-333.
9. Gerbens F. Genetic control of intramuscular fat accretion in pigs.The role of heart and adipocyte fatty acid-binding proteins: dissertation for the degree of the doctrine of Medical Sciences // Nijmegen. 2000. 173 p.
10. Зиновева Н.А., Гладырь Е.А. Диагностика полиморфизма гена H-FABP как генетического маркера мясных качеств свиней // Современные достижения и проблемы биотехнологии с.-х. животных: матер. II Междунар. науч. конф., 19-20 нояб. 2002. Дубровицы, 2002. С. 45-50.
11. Chmurzynska A. The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): Function, structure and polymorphism // J Appl Genet. 2006. Vol. 47. № 1. P. 39-48.
12. Gerbens F., van Erp A.J., Harders F.L., Verburg F.J., Meuwissen T.H., Veerkamp J.H., Pas M. F. Effect of genetic variants of the heart fatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs // J. Anim. Sci. 1999. V.77. Р. 846-852.
13. Nechtelberger D., Pires V., Soolknet J., Stur I., Brem G., Mueller M., Mueller S. Intramuscular fat content and genetic variants at fatty acidbinding protein loci in Austrian pigs // J. Anim. Sci. 2001. V.79(11). Р. 2798-2804.
14. Ovilo C., Oliver A., Noguera J.L., Clop A., Barragan C., Varona L., Rodriguez С., Того M., Sanchez A., Perez-Enciso M., Silio L. Test for positional candidate genes for body composition on pig chromosome 6 // Genet Sel. Evol. 2002. V. 34(4). Р. 465-479.
15. Urban Т., Mikolasova R., Kuciel J., Ernst M., Ingr I. A study of associations of the H-FABP genotypes with fat and meat production of pigs // J. Appl. Genet. 2002. V. 43(4). Р. 505-509.
16. Gerbens F., Verburg F.J., Van Moerkerk H.T., Engel В., Buist W., Veerkamp J.H., Те Pas M.F. Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs // J. Anim. Sci. 2001. V. 79(2). Р. 347-354.
17. Арсиенко Р.Ю. Полиморфизм гена белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), и его влияние на хозяйственно-полезные признаки свиней: дис. на соиск. учен. степ. канд. биолог. наук: 03.00.23. п. Дубровицы, Московской обл., 2003. 97 с.
18. Kim K. S., Larsen N.J., Rothshild M.F. Rapid communication: Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene // J. Anim. Sci. 2000. Vol. 78. P. 791-792.
19. Изучить генетический полиморфизм КРС и свиней Орловской области с целью выявления маркерных генов хозяйственно ценных признаков, хромосомных нарушений, наследственных и инфекционных заболеваний: отчет о НИР (заключ.) / ФГБОУ ВПО Орел ГАУ; рук. и отв. исп. Крюков В.И.; исполн.: Друшляк Н.Г., Пикунова А.В., Манюхин Я.С. [и др.]. Орел, 2012. 143с. - Библиограф. 129-143.
20. Гетманцева Л.В. Влияние полиморфизма генов MC4R, IGF2 и POU1F1 на продуктивные качества свиней: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. с-х. наук: 06.02.07. п. Персиановский, 2012. 28 с.
Максимов Г.В., Гетманцева Л.В. Влияние гена MC4R на мясную продуктивность свиней // Главный зоотехник. 2011. №10. С. 9-13.
№ 2 апрель 2013 ВСЁ 0 МЯСЕ 33
