ПЕЧАТНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГЛЮКОЗООКСИДАЗОЙ И $\gamma $-АМИЛАЗОЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И КРАХМАЛА В БРОДИЛЬНЫХ СРЕДАХ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 3. С. 265-275 Химия

УДК 602.4:547.455.623:007.573.6

Печатные электроды, модифицированные глюкозооксидазой и 7-амилазой для определения глюкозы и крахмала в бродильных средах *

С. С. Каманин, Л. С. Скворцова, В. А. Арляпов

Аннотация. Разработаны модифицированные печатные электроды на основе ферментов глюкозооксидазы и 7-амилазы, иммобилизованных в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина для определения содержания глюкозы и крахмала в бродильных средах. Изучены их основные аналитические и метрологические характеристики. С помощью разработанных модифицированных печатных электродов был проведен анализ образцов бродильной массы. Статистический анализ полученных результатов показал, что значения содержаний глюкозы и крахмала, определяемые с помощью модифицированных электродов, и полученные референтными методами, незначимо различаются между собой.

Ключевые слова: биосенсоры, печатные электроды, глюкозооксидаза, 7-амилаза, бычий сывороточный альбумин, брожение.

Введение

Спиртовое брожение используется в процессе производства алкогольной продукции и в технологии хлебопечения. В спиртовом производстве исходным сырьем для брожения служат крахмалсодержащие продукты картофель, кукуруза, рожь, просо и др. Количество крахмала в исходном сырье и динамика его расходования в процессе брожения являются одними из ключевых показателей эффективности протекания брожения [1]. Перспективным подходом для анализа крахмала является применение биосенсорных технологий [2]. Исследования в области биосенсорной детекции открывают широкие возможности для разработки биоаналитических систем, отличающихся невысокой стоимостью [3, 4].

* Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», госконтракт № 16.740.11.0766, соглашение № 14.B37.21.0561.

Примером таких систем могут служить биосенсоры на основе электродов, изготовленных методом трафаретной печати (печатные электроды). Такие электроды миниатюрны, многофункциональны, выпускаются высоким тиражом, что позволяет создавать продукцию с низкой себестоимостью. Они находят применение в пищевой промышленности (в том числе и в спиртовом производстве для мониторинга ферментативных процессов), при выполнении клинических анализов, в решении задач судебно-медицинской экспертизы, и т. д. [5]. Преимущества этой технологии позволили глюкометрам на основе печатных электродов стать приборами индивидуального пользования и доминировать на рынке биосенсоров [6].

Наибольший интерес представляет возможность создания биферментной биосенсорной системы на основе глюкозооксидазы и амилазы, которая позволит проводить мониторинг протекания бродильного процесса и анализ качества крахмалсодержащего сырья. Несмотря на перспективы, открывающиеся при разработке такой аналитической системы, примеров использования амилаз в литературе достаточно мало. Так, в работе [7] биосенсор для определения крахмала был изготовлен путем фиксации биорецепторного элемента на кончике кислородного электрода типа Кларка. Для получения биорецепторного элемента использовались 7 амилаза, мутаротаза, глюкозоксидаза и каталаза, которые были совместно иммобилизованы на гидролизованной нейлоновой сетке и на активированной коллагеновой мембране. Полученные биосенсоры использовали для определения крахмала в образцах бродильной массы. Примером использования амилазы в разработке печатных биосенсоров являются одноразовые печатные электроды для одновременного определения крахмала и глюкозы [8]. Их конструкция включала в себя два рабочих электрода, один из которых был модифицирован глюкозооксидазой, а другой — а амилазой. Верхняя граница линейного диапазона определяемых содержаний составила 0,4% (вес/объем) крахмала и 20 мМ глюкозы. В работе [9] 7 амилаза и глюкозоксидаза использовалась для создания модифицированного печатного электрода для одновременного определения мальтозы и глюкозы в смеси. В качестве медиатора использовался 1,1-диметанолферроцен. Верхняя граница линейного диапазона определяемых содержаний составила 40 мМ глюкозы и 20 мМ мальтозы. Описанные выше лабораторные модели биосенсоров обладают невысокими аналитическими и метрологическими характеристиками и не могут быть использованы как прототипы при создании промышленных образцов биосенсоров для детекции крахмала.

Исходя из вышесказанного, представляется актуальной разработка биосенсорной системы на основе печатных электродов модифицированных глюкозооксидазой и амилазой для определения содержания глюкозы и крахмала в бродильной массе.

Материалы и методы

Биосенсорные измерения. Сигнал регистрировали, используя печатный медиаторный электрод, на поверхности которого располагали рецепторный элемент. В качестве преобразователя использовали потенциостат EmStat (PalmSens, Нидерланды): рабочий потенциал для берлинской лазури 0 мВ, для ферроцена +350 мВ; объем кюветы 4 мл; натрий-калиевый фосфатный буфер рН=6,8, концентрация солей 33 мМ; перемешивание магнитной мешалкой 200 об/мин; ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (5-50 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 1000-5000 мкл) (Ленпипет, Россия). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) для электродов на основе ферментов являлась амплитуда изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов. Измеряемым параметром для электродов на основе клеток являлся тангенс угла наклона кривой зависимости силы тока от времени. После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 3-4 минут.

Изготовление печатных электродов, модифицированных амилазой и глюкозооксидазой. Для получения модифицированного биферментного печатного электрода в микропробирку помещали 7 мг БСА (Sigma), 100 мкл фосфатного буфера (рН=6,8, 33 мМ) и перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли по 10 мг глюкозооксидазы (Sigma) и 7-амилазы (Sigma), перемешивали и добавляли 15 мкл 25%-ного глутарового альдегида (Sigma). Полученную смесь перемешивали ещё раз, отбирали 3 мкл и быстро переносили на электрод. Время полимеризации составляло от 30 до 60 минут. Полученный рецепторный элемент, перед использованием промывали в буферном растворе в течение 5 мин. Модифицированные печатные электроды на основе глюкозооксидазы готовили аналогично за исключением добавления 7-амилазы в смесь для модификации.

Определение содержания крахмала поляриметрическим методом. Содержание крахмала в пробах определяли поляриметрическим методом с помощью поляриметра кругового марки СМ-3 (ЗОМЗ, Россия) с кюветой с длиной оптического пути 100 мм. Анализ проводили по стандартной методике [10].

Определение содержания глюкозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение содержания глюкозы в образцах бродильных масс, отобранных на разных стадиях процесса брожения, проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе марки «HP 1100» («Hewlett Packard», США) с использованием детектора рефрактометрического типа по стандартной методике [11].

Модельный процесс брожения и получение сброженной массы.

Образец пшеничной муки растворяли в теплой дистиллированной воде, после чего колбу нагревали в термостате до 90oC. В полученную массу добавляли ферментный препарат Termamyl (Novozymes A/S) и ставили обратно в термостат при перемешивании на 2 часа. После колбу охлаждали до 60oC и добавляли фермент SAN Super 360L (Novozymes A/S), и оставляли в термостате на 2 часа при постоянном перемешивании. После этого охлаждали колбу до 30oC, добавляли дрожжевой препарат и ставили в термостат на 72 часа для брожения. Пробы отбирали через 2, 12, 48 и 72 часа после добавления ферментных препаратов, после отбора их сразу же помещали в морозильную камеру для прекращения процесса брожения.

Результаты и обсуждение

Существуют амилазы различных типов — а, в и 7. Наиболее подходящей для использования в аналитических целях является 7-амилаза, так как она расщепляет а-1,4-, а-1,6- и а-1,3-гликозидные связи [12], что способствует наиболее полному гидролизу крахмала до глюкозы, количество которой можно определить путем регистрации количества пероксида водорода, выделяющегося при протекании реакции превращения глюкозы в глюконовую кислоту, катализируемой глюкозооксидазой. Для иммобилизации глюкозооксидазы и 7-амилазы был использован метод включения в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА). Получаемая после сшивания молекул БСА глутаровым альдегидом матрица обеспечивает хорошую диффузию субстратов и метаболитов и формирует благоприятное для иммобилизованных объектов белковое окружение [13].

Основные характеристики разработанных модифицированных печатных электродов. Для определения чувствительности и диапазона определяемых концентраций были построены градуировочные зависимости ответа биосенсора от содержания глюкозы и крахмала в измерительной кювете (рис.1).

Рецепторные элементы на основе ферментов являются биорецепторами каталитического типа, т. е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями. Градуировочная зависимость, приведенная на рис. 1, хорошо описывается уравнением Хилла (коэффициенты корреляции для электродов, модифицированных глюкозооксидазой и смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы 0,9921 и 0,9927 соответственно):

„ _ Дтах[^

_ КМ + № ■

800

600

400

200

0

л——? 1000

<

г X Ж

а боо

1 о

X X

о А.

+ Й 400 ш

Ф ш щ

4 о у

4 200 у

0

О 10 20

Содержание глюкозы в кювете, мМ

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Содержание крахмала в кювете, г/л

Рис. 1. Градуировочные зависимости ответа сенсора от содержания субстрата в измерительной кювете: а — для электродов, модифицированных глюкозооксидазой, б — для электродов, модифицированных 7-амилазой и глюкозооксидазой

Для печатного электрода, модифицированного глюкозооксидазой уравнение выглядит следующим образом:

И = 0 78 •]1’73 (2)

0 , 00111,73 + [£]1,73'

В случае печатного электрода, модифицированного смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы уравнение имеет следующий вид:

И 0,75 • [3]2’33 (3)

0, 592,33 + [3]2,33 • 1 ;

Для снижения ошибок анализа все измерения проводились в области линейного участка градуировочной кривой. За верхнюю границу линейного участка принимали константу Михаэлиса, К’м [14]. Константы Михаэлиса, рассчитанные по уравнению (1), составили 0,59±0,02 г/л для крахмала и 1,10±0,03 мМ для глюкозы.

Исходя из полученной градуировочной зависимости, проводили оценку чувствительности полученных модифицированных электродов. Коэффициент чувствительности определяли как тангенс угла наклона линейного участка градуировочной кривой в координатах концентрация субстрата — ответ сенсора. Рассчитанные таким образом коэффициенты чувствительности составили 310±8 нА/мМ и 640±20 нА/г-л для электродов, модифицированных глюкозооксидазой и смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы соответственно ,(рис. 2).

Нижнюю границу определяемых содержаний определяли с заданной степенью точности, характеризуемой предельно допустимой величиной относительного стандартного отклонения (СтгП). Для нахождения Сн определяли ряд значений (С) при различных содержаниях субстратов в кювете, по полученным значениям были построены зависимости относительного стандартного отклонения (С) от содержания субстрата,

А 400 - А

< /1

* 300 у/

о.

о

X

3 200

&

у' ь

О

100 -

0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Содержание глюкозы в кювете, мМ

0,0 0,2 0,4

Содержание крахмала в кювете, г/л

Рис. 2. Линейный участок градуировочной зависимости ответа сенсора от содержания субстрата в измерительной кювете: а — для электродов, модифицированных глюкозооксидазой, б — для электродов, модифицированных смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы

имеющие вид убывающей кривой. По ним находили содержание субстрата, начиная с которого величины (С) становятся меньше, чем заданное предельное значение (Стіп)=0,33. Вид зависимости от содержания

глюкозы и крахмала в кювете представлен на рис.3.

0 5 10 15 20 25 30 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Содержание глюкозы в кювете, мМ Содержание крахмала в кювете, г/л

а б

Рис. 3. Зависимость стандартного отклонения от содержания субстрата в кювете: а — для электродов, модифицированных глюкозооксидазой, б — для электродов, модифицированных смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы

Нижняя граница определяемых содержаний крахмала составила 0,03 г/л, для глюкозы этот параметр составил 0,05 мМ. Таким образом, диапазон определяемых содержаний крахмала с помощью печатных электродов, модифицированных смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы, составил 0,03-0,59 г/л. Модифицированный печатный электрод на основе глюкозооксидазы имеет диапазон определяемых содержаний глюкозы 0,05-1,1 мМ.

Была проведена оценка операционной и долговременной стабильности полученных модифицированных электродов. За операционную стабильность

принимали стандартное отклонение ответа сенсора при проведении серии последовательных измерений в пробах с одинаковым содержанием крахмала. Относительное стандартное отклонение при проведении 20 последовательных измерений с использованием электрода, модифицированного глюкозооксидазой, составило 3%, для печатного электрода, модифициованного смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы этот показатель составил 6%.

Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени. Долговременную стабильность определяли путём ежедневного измерения величины ответа биосенсора на основе разработанных модифицированных электродов на пробу с определенным содержанием субстрата, соответствующим середине линейного диапазона градуировочной зависимости каждого модифицированного электрода. Полученная зависимость ответа биосенсора от времени функционирования электрода представлена на рис. 4.

Рис. 4. Долговременная стабильность модифицированного печатного электрода: а — для электродов, модифицированных глюкозооксидазой, б — для электродов, модифицированных смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы

Долговременную стабильность модифицированных печатных электродов описывает параметр t^50, который характеризует время, необходимое для снижения ответа биосенсора до уровня 50% от максимального. Не рекомендуется использовать сенсоры после того, как уровень ответов биосенсора будет ниже 50% от наблюдавшегося максимума [15]. Для печатных электродов, модифицированных глюкозооксидазой, t^50 составил 6 дней, для электродов, модифицированных 7-амилазой и глюкозооксидазой, 4 дня.

В табл. 1 представлены основные характеристики полученных модифицированных печатных электродов.

Проведено сравнение характеристик полученных модифицированных электродов с литературными данными. Разработанные печатные электроды на основе смеси 7-амилазы и глюкозооксидазы способны определять

Таблица 1

Сравнение характеристик полученных рецепторных элементов

Иммобилизованный фермент 7 — Амилаза + + глюкозооксидаза Глюкозооксидаза

Чувствительность 640±20 нА/г-л 310±8 нА/мМ

Нижняя граница определяемых содержаний 0,03 г/л 0,05 мМ

Верхняя граница определяемых содержаний 0,59±0,01 г/л 1,10±0,03 мМ

Долговременная стабильность, сут. 4 6

Операционная стабильность (п = 20), % 6 3

Экспрессность, мин 3 1

более низкие содержания крахмала, чем их печатные аналоги с двумя рабочими электродами [8], и в то же время они обладают более широким диапазоном определяемых содержаний крахмала, чем описанные в литературе биосенсоры, имеющие в своей основе электрод типа Кларка [7]. Модифицированные печатные электроды на основе глюкозооксидазы обладают более широким диапазоном определяемых концентраций и схожей операционной стабильностью по сравнению с аналогичными печатными электродами, модифицированными глюкозооксидазой, иммобилизованной в мембрану перфторсульфоната, сшитого глутаровым альдегидом [16].

Анализ реальных образцов. На заключительном этапе работы была проведена апробация разработанных модифицированных электродов на образцах бродильной массы, полученной в результате протекания модельного процесса брожения. В качестве референтного метода были выбраны поляриметрия, как стандартный метод определения крахмала и высокоэффективная жидкостная хроматография, как распространенный метод определения углеводов. Для того, чтобы учесть влияние присутствия глюкозы в бродильной массе на уровень ответа биосенсора, содержащего 7-амилазу и глюкозооксидазу, при проведении измерений из его ответа вычитали ответ биосенсора на основе глюкозооксидазы. Результаты представлены в табл.2.

Статистический анализ полученных результатов с использованием модифицированного теста Стьюдента показал, что значения содержаний глюкозы и крахмала, определяемые с помощью модифицированных электродов, и полученные референтными методами, незначимо отличаются между собой.

Таблица 2

Анализ образцов бродильной массы

Образец Содержание глюкозы (печатные электроды), М Содержание глюкозы (ВЭЖХ), М Содержание крахмала (печатные электроды), г/л Содержание крахмала (поляримет-рия), г/л

Бродильная масса 2 ч 0,071±0,005 0,074±0,003 37±2 38±1

Бродильная масса 12 ч 0,21±0,01 0,223±0,005 23±1 23,6±0,7

Бродильная масса 48 ч 0,19±0,01 0,214±0,002 17,3±0,7 18,0±0,4

Бродильная масса 72 ч 0,162±0,006 0,156±0,003 9,1±0,6 9,3±0,3

Выводы

Разработаны модифицированные печатные электроды на основе берлинской лазури и ферментов глюкозооксидазы и 7-амилазы,

иммобилизованных в гель поперечно-сшитого БСА для определения содержания глюкозы и крахмала в бродильных средах. Определены

основные аналитические и метрологические характеристики разработанных

модифицированных печатных электродов. Показано, что диапазон определяемых содержаний составил 0,05-1,1 мМ глюкозы для печатных электродов, модифицированных глюкозооксидазой (чувствительность 310 нА/мМ) и 0,03-0,59 г/л крахмала для печатных электродов, модифицированных смесью 7-амилазы и глюкозооксидазы (чувствительность 640 нА/г-л).

С использованием разработанных модифицированных печатных электродов был проведен анализ образцов бродильной массы, отобранных на разных этапах процесса брожения. Статистический анализ полученных результатов показал, что значения содержаний глюкозы и крахмала,

определяемые с помощью модифицированных электродов, и полученные референтными методами, незначимо различаются между собой.

Разработанные модифицированные печатные электроды могут служить основой для создания биосенсоров с высокими аналитическими и метрологическими характеристиками, которые могут применяться при мониторинге бродильных процессов и для определения содержания компонентов бродильных масс и продуктов брожения.

Список литературы

1. Ковалевский К.А. Технология бродильных производств. Киев: Фирма

«ИНКОС», 2004. 340 с.

2. Terry L.A., White S.F., Tigwell L.J. The application of biosensors to fresh produce and the wider food industry // J. Agric Food Chem. 2005. V. 53. № 5. P. 1309-16.

3. Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах / В.А. Арляпов [и др.] // Сенсорные системы. 2011. T. 25. № 4. C. 352-360.

4. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Многоканальный биосенсор для определения содержания глюкозы, метанола и этанола при их совместном присутствии // Биотехнология. 2008. № 5. C. 84-91.

5. Newman J., Setford S. Enzymatic biosensors // Molecular Biotechnology. 2006. V. 32. № 3. P. 249-268.

6. Newman J.D., Turner A.P.F. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 20. № 12. P. 2435-2453.

7. Vrbova E., Peckova J., Marek M. Biosensor for Determination of Starch // Starch -Starke. 1993. V. 45. № 10. P. 341-344.

8. Hu T., Zhang X.-E., Zhang Z.-P. Disposable screen-printed enzyme sensor for simultaneous determination of starch and glucose // Biotechnology Techniques. 1999. V. 13. № 6. P. 359-362.

9. Simultaneous determination of maltose and glucose using a screenprinted electrode system / F.Ge [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 1998. V. 13. № 3-4. P. 333-339.

10. Зерно и продукты его переработки. Метод определения крахмала. Минск: Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 2000. 4 c.

11. Association of Official Analytical Chemists. Official methods of analysis / Helrich K. Arlington, Virginia: Association of Official Analytical Chemists, 1990. P. 71.

12. Priest F.G. Extracellular Enzyme Synthesis in the Genus Bacillus // Bacteriological Reviews. 1977. V. 41. № 3. P. 711-753.

13. Immobilization of enzymes and cells. 2nd изд. Totowa (N.J.): Humana press, 2006. 449 p.

14. Биосенсоры и биотопливные элементы: учебное пособие для студентов / О.Н. Понаморева [и др.]. Тула: Изд-во ТулГУ, 2012. 207 c.

15. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D.R. Thevenot [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2001. V. 16. № 1-2. P. 121-31.

16. Prussian Blue and enzyme bulk-modified screen-printed electrodes for hydrogen peroxide and glucose determination with improved storage and operational stability / F. Ricci [et al.] // Analytica Chimica Acta. 2003. V. 485. № 1. P. 111-120.

Каманин Станислав Сергеевич (s.s.kamanin@gmail.com), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Скворцова Любовь Сергеевна (lsskvortsova@gmail.com), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Арляпов Вячеслав Алексеевич (v.a.arlyapov@gmail.com), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Screen-printed electrodes modified with glucose oxidase and Y-amylase for determination of glucose and starch in fermentation media

S. S. Kamanin, L. S. Skvortsova, V. A. Arlyapov

Abstract. The modified screen-printed electrodes based on glucose oxidase and 7-amylase immobilized in a gel of cross-linked bovine serum albumin for determination of glucose and starch in fermentation media were developed. Their basic analytical and metrological characteristics were studied. The developed modified screen-printed electrodes were applied to fermentation mass samples analysis. Statistical analysis of the obtained results showed out that the values of glucose and starch content, determined by the modified electrodes and by reference methods, do not significantly differ from each other.

Keywords: biosensors, screen-printed electrodes, glucose oxidase, 7-amylase, bovine serum albumin, fermentation.

Kamanin Stanislav (s.s.kamanin@gmail.com), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.

Skvortsova Lyubov (lsskvortsova@gmail.com), student, department of chemistry, Tula State University.

Arlyapov Vyacheslav (v.a.arlyapov@gmail.com), candidate of chemical sciences, assistant professor, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 14-09.2013