Особенности штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Сибири Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

4ШШ №12 (2161) ЗНиСО

51

УДК 616.98:578.833.26

о ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

сБ ЕВРОПЕЙСКОГО ГЕНОТИПА, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ СИБИРИ

-эт С.Е. Ткачев1, И.В. Козлова2 3, Ю.П. Джиоев2 3, Е.К. Дорощенко2,

^^ О.В. Лисак2, О.В. Сунцова2, Д. Ружек4 5

^ 1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

гЪ 2ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, г. Иркутск

3ГБОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет, г. Иркутск "Институт паразитологии биологического центра Академии наук Республики Чехия, Ческе-Будеевице, Республика Чехия 5НИИ ветеринарии, Брно, Республика Чехия

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №14-15-00615)

При молекулярно-генетическом анализе 13 штаммов ВКЭ европейского генотипа, выделенных на территории Западной и Восточной Сибири, были выявлены две группы, отличающихся генетически друг от друга, и имеющих высокий уровень гомологии последовательностей гена E внутри каждой группы. Тем не менее, для ряда штаммов наблюдалась гетерогенность биологических свойств внутри одной группы.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, европейский генотип, Сибирь.

S.E. Tkachev, I.V. Kozlova, Yu.P. Dzhioev, E.K. Doroshchenko, O.V. Lisak, O.V. Suntcova, D. Ruzhek□ FEATURES OF THE STRAINS OF THE VIRUS OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS OF THE EUROPEAN GENOTYPE REVEALED IN THE TERRITORY OF SIBERIA □ Institute of chemical biology and fundamental medicine of the Siberian Branch of the Russian Academy of Science, Novosibirsk; FSBI «NTs PZSRCh» of the Siberian Branch of Russian Academy of Medical Science, Irkutsk; GSBEI HPE Irkutsk state medical university, Irkutsk; Institute of parasitology of the biological center of Academy of Sciences of the Czech Republic, Cheske-Budeevitsa, Czech Republic; Scientific research institute of veterinary science, Brno, Czech Republic.

After the molecular-genetic analysis of 13 strains of Western genotype of TBEV isolated in Western and Eastern Siberia, there were revealed two groups of strains differing genetically from each other and having a high level of Egene sequences homology within each group. Nevertheless, the heterogeneity of biological properties for some strains within a group was observed. Key words: tick-borne encephalitis virus, Western genotype, Siberia.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-1500615)

В настоящее время выделяют три основных генотипа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): 1) дальневосточный; 2) европейский (или западный); 3) сибирский [1]. Каждый из генотипов вируса обладает собственным ареалом, в пределах которого отмечается его доминирование. Тем не менее, было обнаружено, что ВКЭ европейского генотипа имеет обширнейший ареал — от Европы до Азии. Так, по всей видимости, восточной границей распространения данного субтипа является Южная Корея [2, 3]. На территории России крайней восточной границей ареала европейского генотипа ВКЭ является территория Восточной Сибири (Иркутская область) [4]. С помощью методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и секвенирования фрагментов генома ВКЭ на территории Сибири были выявлены 13 штаммов европейского генотипа. Пять из них были изолированы на территории Западной Сибири (Алтайский край), восемь — на территории Восточной Сибири (Иркутская область) [4].

Целью данной работы являлось сравнение генетических и биологических характеристик штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Западной и Восточной Сибири.

Материалы и методы. В работе использовали 13 штаммов из коллекции ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, г. Иркутск, выделенных на террито-

рии Западной (5 штаммов) и Восточной Сибири (8 штаммов). Штаммы из Западной Сибири (Республика Алтай) были выделены из клещей Ixodes persulcatus (штаммы Змеиногорск-1, Змеиногорск-З, Змеиногорск-5, Змеиногорск-7, Змеиногорск-9). Из Восточной Сибири (Иркутская область) три штамма были изолированы от клещей Ixodes persulcatus (126-71; 163-74; 262-74), четыре штамма от мелких млекопитающих (118-71 и 134-71 из Spermophilus undulatus, 272-75 из Microtus gregalis, 898-84 из Myodes rutilus) и один штамм (1G-98) из крови человека, переболевшего лихорадочной формой КЭ.

Образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из суспензий мозга зараженных ВКЭ белых мышей наборами «РИБО-преп» («Амплипрайм», Москва), использовали для получения к ДНК наборами «РевертаL» («АмплиСенс», ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). ПЦР проводили с праймерами, соответствующими последовательности гена Е ВКЭ западного генотипа. Определение последовательностей полученных продуктов ПЦР проводили с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 3500 (Applied Biosystems, США). Молекулярно-генетический анализ последовательностей осуществляли с использованием программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) и MEGA 5 [5].

Нейровирулентность штаммов оценивали путем интрацеребрального титрования вируссодер-

52

ЗНиСО pm №12 (2С1)

жащей суспензии. При титровании на животных титры вируса определяли по методу Рида и Менча [6] и выражали в lg ЛД50/мл. Для оценки титров вируса при подкожном введении мышей заражали экстраневрально. Индекс инвазивности (ИИ) оценивали как разницу титров вируса при церебральном и подкожном заражении мышей, выраженную в lg ЛД50/мл. Значение ИИ в пределах 1,0—2,5 свидетельствовало о высоких инвазивных свойствах штамма, способности преодолевать гематоэнцефалический барьер, достигать центральную нервную систему и размножаться в ней. Значение ИИ > 3 соответствовало сниженной ин-вазивной активности штамма.

Для определения способности штаммов ВКЭ к репродукции при супраоптимальной температуре (rct42) использовали метод титрования вируса на культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), инкубированных при 37 или 42 °С, на 6-й день после заражения. Определение lg ТЦД50/мл проводили по методу Рида и Менча [Reed, Muench, 1938]. Rct42 -признак определяли по разнице титров вируса при 37 и 42 °С; высокое значение признака (+) соответствовало разнице титров вируса < 2,0 lg; среднее значение (±) — от 2,1 до 3,0 lg; (—), соответственно, при > 3,1 lg.

Изучение бляшкообразующей активности (S-признак) проводили путем заражения клеток СПЭВ штаммами ВКЭ, прошедшими не более 4 пассажей через мозг белых мышей. После трехкратного клонирования в культуре клеток СПЭВ наблюдалась деструкция клеток. Бляшки появлялись на 3—4-е сутки, учет проводили на 5-е сутки после заражения, когда бляшки увеличивались в размере и становились более отчетливыми.

Результаты. Анализ расшифрованных последовательностей гена E показал, что исследуемые штаммы ВКЭ разделяются на две группы, соответствующие ареалам их выделения, при этом внутри каждой из групп наблюдался высокий уровень гомологии последовательностей гена E (> 99 %). При построении дендрограммы было также показано, что штаммы, выделенные на территории Западной и Восточной Сибири, формируют отдельные кластеры. Группа штаммов из Западной Сибири показала высокий уровень гомологии (99 %) со штаммами Абсеттаров [GenBank KJ000002.1] (выделен в Карелии в 1951 г.), Kumlinge A52 [GU183380] (Финляндия, 1952), Kumlinge 25-03 [GU183379] (Финляндия, 2003), Est3476 [GU183383] (Эстония, 2000), Joutseno [GU183381] (Финляндия, 1960). Группа, содержащая штаммы из Восточной Сибири, демонстрировала высокий уровень гомологии (99 %) со штаммом 84.2 [HM120875], выделенным ранее на территории Алтая (Западная Сибирь), и 98 % гомологии с другими 17 штаммами ВКЭ, выделенными на территории Финляндии, Эстонии и других стран Европы.

Была проведена оценка некоторых феноти-пических свойств штаммов европейского генотипа ВКЭ, выявленных на территории Восточной Сибири. Штаммы 1G-98 и 898-84 обладали высокой церебральной и периферической активностью. Так, титры вируса при интрацеребральном заражении составили 8,72 и 9,32 lg ЛД50/мл соответственно при подкожном заражении — 6,35

и 6,9 lg ЛД50/мл. Штаммы обладали хорошими инвазивными свойствами, что свидетельствует "— об их способности преодолевать гематоэнцефа-лический барьер. При заражении молодых белых ^ мышей штаммами ВКЭ европейского субтипа в -у среднем процент летальности составил 95,9 %, lj средняя продолжительность жизни — 5,5 дней. ^^ Определение размера бляшек в культуре клеток е СПЭВ показало гетерогенность изученных штаммов по данному маркеру. Штаммы 134-71 и 27275 формировали мелкие и среднего размера (d = 1,5 — 2,0 мм) бляшки, в то время как штаммы 11871 и 898-84 формировали крупные бляшки (d = 3,5 — 5,0 мм). Для пяти штаммов были определены генетические маркеры rct37 и rct42. Четыре из изученных штаммов хорошо размножались на культуре клеток СПЭВ как при температуре 37 °С, так при 42 °С, что свидетельствует об их хороших адаптивных способностях.

Обсуждение. На сегодняшний день в базе данных GenBank депонированы нуклеотидные последовательности гена Е 181 штамма (или изо-лятов РНК) ВКЭ европейского генотипа, выделенных на территории 18 европейских стран, а также Южной Кореи. В нашей работе мы впервые определили последовательности гена E 13 штаммов ВКЭ европейского генотипа, выделенных в Западной и Восточной Сибири, с последующим молекулярно-генетическим анализом.

Были выявлены две группы штаммов, кластеризующихся по месту выделения, причем внутри каждой из групп наблюдался высокий уровень гомологии (> 99 %) нуклеотидных последовательностей, что, вероятно, свидетельствует о крайне высокой консервативности последовательности гена E у ВКЭ европейского генотипа вне зависимости от источника выделения (клещи, мелкие млекопитающие, кровь человека). Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными. Так, при анализе последовательностей геномов штаммов ВКЭ, выделенных в Центральной Европе, была показана стабильность генома европейского генотипа [7]. Также, при сравнительном анализе кодирующей части полногеномных последовательностей ВКЭ из GenBank, было обнаружено, что штаммы европейского генотипа, по сравнению с представителями дальневосточного и сибирского генотипов, характеризуются наиболее высокими уровнями гомологии как нуклео-тидных, так и аминокислотных последовательностей внутри одного генотипа, т. е. наименьшим уровнем различий [4]. Более того, следует отметить, что представители каждой из выявленных групп исследуемых штаммов ВКЭ с территорий Западной или Восточной Сибири обладали высокой степенью гомологии со штаммами, выделенными на территории Западной Европы, что также может служить доказательством высокой консервативности последовательности гена E.

ВКЭ европейского генотипа имеет обширный ареал и циркулирует в экосистемах, значительно различающихся, в том числе и основными переносчиками, и резервуарными хозяевами. Основным переносчиком европейского генотипа ВКЭ считались клещи I. ricinus, но, по всей видимости, в Азиатской части России его переносчиком может служить и I. persulcatus. Ранее на тер-

ЦШШ №12 (261) ЗНиСО

53

г-Ь

ритории Европы ВКЭ европейского генотипа был изолирован из Myodes glareolus, Apodemus sylvaticus, Sciurus vulgaris, а на территории Южной Кореи выделен из Apodemus agrarius. В нашей работе на территории Восточной Сибири штаммы ВКЭ европейского генотипа были впервые изолированы из Spermophilus undulatus, Microtus gregalis и Myodes rutilus.

Тем не менее, несмотря на высокий уровень гомологии последовательностей гена E, наблюдается гетерогенность биологических свойств для ряда штаммов даже внутри одной группы, которые, вероятно, связаны с различиями в других областях генома. В связи с этим большой научный интерес представляет сравнительный анализ генетических и биологических свойств штаммов ВКЭ европейского субтипа, изолированных в удаленных друг от друга точках ареала, существенно отличающихся биоценотической структурой природных очагов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of TBEV from Europe and Asia // J. Gen. Virol. 1999. V. 80. P. 179—185.

2. Kim S.Y, Yun S.M., Han M.G., Lee I.Y., Lee N.Y., Jeong Y.E., Lee B.C., Ju Y.R. Isolation of tick-borne encephalitis viruses

УДК б14.449:578.833.2б]:313.13(470.53-25)

from wild rodents, South Korea // Vector Borne Zoonotic Dis. 2008. V. 8, № 1. P. 7—13.

3. Yun S.M., Kim S.Y., Han M.G., Jeong Y.E., Yong T.S., Lee C.H., Ju Y.R. Analysis of the envelope (E) protein gene of tickborne encephalitis viruses isolated in South Korea // Vector Borne Zoonotic Dis. 2009. V.9, №3. P. 287—293.

4. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Plyusnin A., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Zlobin V.I. Genotyping and characterization of the geographical distribution of tick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes // Journal of Medical Virology. 2010. V. 82. P. 965—976.

5. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28, № 10. P. 2731—2739.

6. Reed L., Muench H.A. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints // Am. J. Hyg. 1938. № 27. P. 493—497.

7. Weidmann M., Frey S., Freire C.C., Essbauer S., Rrn;hek D., Klempa B., Zubrikova D., Vögerl M., Pfeffer M., Hufert F.T., Zanotto P.M., Dobler G. Molecular phylogeography of tickborne encephalitis virus in central Europe // J. Gen. Virol. — 2013. V. 94, Pt. 9. P. 2129—2139._

Контактная информация:

Ткачев Сергей Евгеньевич,

тел.: (383) 363-51-37,

е-mail: sergey.e.tkachev@gmail.com

Contact information: Tkachev Sergey, phone: (383) 363-51-37, e-mail: sergey.e.tkachev@gmail.com

ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ПО СНИЖЕНИЮ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ В ПЕРМСКОМ КРАЕ

П.З. Шур1, В.А. Фокин1, Д.М. Шляпников1, М.Ю. Девятков2 'ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», Пермь 2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае»

Приводятся результаты оценки эффекта проведения акарицидных обработок, вакцинопро-филактики на заболеваемость клещевым энцефалитом, а также расчет экономических потерь, связанных с заболеваемостью клещевым энцефалитом в Пермском крае, и экономического эффекта противоэпидемических мероприятий.

Ключевые слова: клещевой энцефалит, оценка риска, экономическая эффективность.

P.Z. Shur, V.A. Fokin, D.M. Shlyapnikov, M.Yu. Devyatkov □ JUSTIFICATION OF EFFECTIVENES OF ANTI EPIDEMIC MEASURES FOR TICK-BORNE ENCEPHALITIS INCIDENCE REDUCTION IN PERM REGION □ FBSI «Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies», Perm; FBHI «Federal Center of Hygiene and Epidemiology in Perm Region», Perm

Article contains results of effectiveness assessment of acaricide treatment and preventive vaccination, and economic losses estimation associated with tick-borne encephalitis incidence in Perm region as well as anti epidemic measures economic effectiveness evaluation. Key words: tick-borne encephalitis, health risk assessment, economic effectiveness.

Территория Пермского края является высоко активным очагом трансмиссивных природно-очаговых инфекций. Заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) в Пермском крае с начала ее официальной регистрации (1939 г.) достоверно превышает показатели заболеваемости по Российской Федерации в годы максимальной напряженности эпидемического процесса в 10—12 раз, в межэпидемический период — в 3—4 раза [1—4].

Изучение путей заражения населения Пермского края вирусом КЭ выявило следующую роль «клещевого» и алиментарного факторов, суммарная доля которых в разные годы составляла от 90 до 95 % (остальные больные отмечали частое пребывание в лесу, что не исключало

возможности воздействия «клещевого» фактора). В 1970—1979 гг. (87,0 ± 1,3) %, а в 1980—1989 гг. (91,0 ± 1,3) % больных связывали свое заболевание с присасыванием или удалением ползающих клещей, в то время как в 1959—1969 гг. их доля была ниже и составляла (76,9 ± 3,5) % (1 = 2,71; 1 = 3,78; р < 0,05). Одновременно несколько снизилось количество заболеваний, связанных с употреблением молока: если в 1959—1969 гг. эта группа больных составляла (11,5 ± 1,9) %, то в 70-е и 80-е гг. она снизилась до (3,9 ± 0,8) % и (3,0 ± 0,4) % соответственно (1 = 3,69; 1 = 4,39; р < 0,05). Выявленные тенденции сохранились и в настоящее время: (86,5 ± 2,1) % больных связывают свое заболевание с «клещевым» факто-