Научная статья на тему 'Характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Западной и Восточной Сибири'

Характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Западной и Восточной Сибири Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
75
34
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВИРУС КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА / TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS / ЕВРОПЕЙСКИЙ ГЕНОТИП / WESTERN GENOTYPE / СИБИРЬ / SIBERIA

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Ткачев Сергей Евгеньевич, Козлова Ирина Валерьевна, Джиоев Юрий Павлович, Верхозина Марина Михайловна, Дорощенко Елена Константиновна

При молекулярно-генетическом анализе 13 штаммов ВКЭ европейского генотипа, выделенных на территории Западной и Восточной Сибири, были выявлены две группы, отличающихся генетически друг от друга, и имеющих высокий уровень гомологии последовательностей гена E внутри каждой группы. Тем не менее, для ряда штаммов наблюдалась гетерогенность биологических свойств внутри одной группы.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Ткачев Сергей Евгеньевич, Козлова Ирина Валерьевна, Джиоев Юрий Павлович, Верхозина Марина Михайловна, Дорощенко Елена Константиновна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The molecular-genetic analysis of 13 strains of Western genotype TBEV isolated in Western and Eastern Siberia, demonstrated two groups of strains differed genetically from each other and had a high level of E gene sequences homology within each group. Nevertheless, the heterogeneity of biological properties for some strains within a group was observed.

Текст научной работы на тему «Характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Западной и Восточной Сибири»

Молекулярно-генетические исследования

ffl

УДК 616.98:578.833.26

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЕВРОПЕЙСКОГО ГЕНОТИПА, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ЗАПАДНОЙ И ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

С.Е. Ткачев1, И.В. Козлова2,3, Ю.П. Джиоев2-3, М.М. Верхозина4, Е.К. Дорощенко2, О.В. Лисак2,

Т.В. Демина5, О.В. Сунцова2, В.И. Злобин3, А.И. Парамонов2, А.Ю. Тикунов1, А.В. Ляпунов2,

Н.В. Тикунова1, Д. Ружек6,7 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Российская Федерация, 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8; Тел.: (383) 363-51-50

2ФГБУ "НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН

Российская Федерация, 664003, Иркутская обл, Иркутск, г, Тимирязева, 16; grs_24@mail.ru 3ГБОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет 664003, г. Иркутск, ул. Красного восстания, E-mail: administrator@ismu.baikal.ru 4ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области» 664047, г. Иркутск, Октябрьский район, ул. Трилиссера, д. 51. Тел.: +7 (3952) 22-82-04 5Иркутская государственная сельскохозяйственная академия 664038, Иркутская обл., Иркутский р-он, п. Молодежный. Тел.: +7 (3952) 237-330 6Институт паразитологии биологического центра Академии наук Республики Чехия, Ческе-Будеевице, Республика Чехия 7НИИ ветеринарии, Брно, Республика Чехия

При молекулярно-генетическом анализе 13 штаммов ВКЭ европейского генотипа, выделенных на территории Западной и Восточной Сибири, были выявлены две группы, отличающихся генетически друг от друга, и имеющих высокий уровень гомологии последовательностей гена E внутри каждой группы. Тем не менее, для ряда штаммов наблюдалась гетерогенность биологических свойств внутри одной группы.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, европейский генотип, Сибирь.

CHARACTERISTICS OF STRAIN OF THE VIRUS OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS OF EUROPEAN GENOTYPE REVEALED IN THE WEST AND EAST SIBERIA

The molecular-genetic analysis of 13 strains of Western genotype TBEV isolated in Western and Eastern Siberia, demonstrated two groups of strains differed genetically from each other and had a high level of E gene sequences homology within each group. Nevertheless, the heterogeneity of biological properties for some strains within a group was observed.

Keywords: tick-borne encephalitis virus, Western genotype, Siberia

В настоящее время выделяют три основных генотипа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): 1) дальневосточный; 2) европейский (или западный); 3) сибирский [1]. Каждый из генотипов вируса обладает собственным ареалом, в пределах которого отмечается его доминирование. Тем не менее, было обнаружено, что ВКЭ европейского генотипа имеет обширнейший ареал - от Европы до Азии. Так, по всей видимости, восточной границей распространения данного субтипа является Южная Корея [2,

3]. На территории России крайней восточной границей ареала европейского генотипа ВКЭ является территория Восточной Сибири (Иркутская область) [4]. С помощью методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и секвенирования фрагментов генома ВКЭ на территории Сибири было выявлено 13 штаммов европейского генотипа. Пять из них были изолированы на территории Западной Сибири (Алтайский край), восемь - на территории Восточной Сибири (Иркутская область) [4].

ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)

Целью данной работы являлось сравнение генетических и биологических характеристик штаммов вируса клещевого энцефалита европейского генотипа, выявленных на территории Западной и Восточной Сибири.

Материалы и методы. В работе использовали 13 штаммов из коллекции ФГБУ "НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, г. Иркутск, выделенных на территории Западной (5 штаммов) и Восточной Сибири (8 штаммов). Штаммы из Западной Сибири (Республика Алтай) были выделены из клещей Ixodes persulcatus (штаммы Змеиногорск-1, Змеиногорск-З, Змеиногорск-5, Змеиногорск-7, Змеиногорск-9). Из Восточной Сибири (Иркутская область) три штамма были изолированы от клещей Ixodes persulcatus (126-71; 163-74; 26274), четыре штамма от мелких млекопитающих (118-71 и 134-71 из Spermophilus undulatus, 272-75 из Microtus gregalis, 898-84 из Myodes rutilus) и один штамм (1G-98) из крови человека, переболевшего лихорадочной формой КЭ.

Образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из суспензий мозга зараженных ВКЭ белых мышей наборами «РИБО-преп» («Ам-плипрайм, Москва), использовали для получения кДНК наборами "РевертаК' ("АмплиСенс", ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). ПЦР проводили с праймерами, соответствующими последовательности гена Е ВКЭ западного генотипа. Определение последовательностей полученных продуктов ПЦР проводили с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 3500 (Applied Biosystems, США). Молекулярно-генетический анализ последовательностей осуществляли с использованием программ BLAST (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/) и MEGA 5 [5].

Нейровирулентность штаммов оценивали путем интрацеребрального титрования ви-руссодержащей суспензии. При титровании на животных титры вируса определяли по методу Рида и Менча [6] и выражали в lg ЛД50/мл. Для оценки титров вируса при подкожном введении мышей заражали экстраневрально. Индекс инва-зивности (ИИ) оценивали как разницу титров вируса при церебральном и подкожном заражении мышей, выраженную в lg ЛД50/мл. Значение ИИ в пределах 1-2,5 свидетельствовало о высоких ин-вазивных свойствах штамма, способности преодолевать гематоэнцефалический барьер, достигать центральную нервную систему и размножаться в ней. Значение ИИ >3 соответствовало сниженной инвазивной активности штамма.

Для определения способности штаммов ВКЭ к репродукции при супраоптимальной темпера-

туре (rct42) использовали метод титрования вируса на культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), инкубированных при 37°С или 42°С, на 6 день после заражения. Определение lg ТЦД50/ мл проводили по методу Рида и Менча [Reed, Muench, 1938]. Rct42 - признак определяли по разнице титров вируса при 37° и 42°С; высокое значение признака (+) соответствовало разнице титров вируса <2,0 lg; среднее значение (±) - от 2,1 до 3,0 lg; (-), соответственно, при >3,1 lg.

Изучение бляшкообразующей активности (S-признак) проводили путем заражения клеток СПЭВ штаммами ВКЭ, прошедшими не более четырех пассажей через мозг белых мышей. После трехкратного клонирования в культуре клеток СПЭВ наблюдалась деструкция клеток. Бляшки появлялись на 3-4-е сутки, учет проводили на 5-е сутки после заражения, когда бляшки увеличивались в размере и становились более отчетливыми.

Результаты. Анализ расшифрованных последовательностей гена E показал, что исследуемые штаммы ВКЭ разделяются на две группы, соответствующие ареалам их выделения, при этом внутри каждой из групп наблюдался высокий уровень гомологии последовательностей гена E (>99 %). При построении дендрограммы было также показано, что штаммы, выделенные на территории Западной и Восточной Сибири, формируют отдельные кластеры. Группа штаммов из Западной Сибири показала высокий уровень гомологии (99 %) со штаммами Абсеттаров [GenBank KJ000002.1] (выделен в Карелии в 1951 г.), Kumlinge A52 [GU183380] (Финляндия, 1952), Kumlinge 25-03 [GU183379] (Финляндия, 2003), Est3476 [GU183383] (Эстония, 2000), Joutseno [GU183381] (Финляндия, 1960). Группа, содержащая штаммы из Восточной Сибири, демонстрировала высокий уровень гомологии (99 %) со штаммом 84.2 [HM120875], выделенным ранее на территории Алтая (Западная Сибирь), и 98 % гомологии с другими 17 штаммами ВКЭ, выделенными на территории Финляндии, Эстонии и других стран Европы.

Была проведена оценка некоторых феноти-пических свойств штаммов европейского генотипа ВКЭ, выявленных на территории Восточной Сибири. Штаммы 1G-98 и 898-84 обладали высокой церебральной и периферической активностью. Так, титры вируса при интрацеребральном заражении составили 8,72 и 9,32 lg ЛД50/мл, соответственно, при подкожном заражении - 6,35 и 6,9 lg ЛД50/мл. Штаммы обладали хорошими инвазивными свойствами, что свидетельствует об их способности преодолевать гематоэнцефали-ческий барьер. При заражении молодых белых мышей штаммами ВКЭ европейского субтипа

Молекулярно-генетические исследования

в среднем процент летальности составил 95,9 %, средняя продолжительность жизни - 5,5 дней. Определение размера бляшек в культуре клеток СПЭВ показало гетерогенность изученных штаммов по данному маркеру. Штаммы 134-71 и 272-75 формировали мелкие и среднего размера 0=1,5-2,0 мм) бляшки, в то время как штаммы 118-71 и 898-84 формировали крупные бляшки 0=3,5-5,0 мм). Для пяти штаммов были определены генетические маркеры гС;37 и гС;42. Четыре из изученных штаммов хорошо размножались на культуре клеток СПЭВ как при температуре 37еС, так при 42еС, что свидетельствует об их хороших адаптивных способностях.

обсуждение. На сегодняшний день в базе данных GenBank депонированы нуклеотидные последовательности гена Е 181 штамма (или изолятов РНК) ВКЭ европейского генотипа, выделенных на территории 18 европейских стран, а также Южной Кореи. В нашей работе мы впервые определили последовательности гена Е 13 штаммов ВКЭ европейского генотипа, выделенных в Западной и Восточной Сибири, с последующим молекулярно-генетическим анализом.

Были выявлены две группы штаммов, кластеризующихся по месту выделения, причем внутри каждой из групп наблюдался высокий уровень гомологии (>99 %) нуклеотидных последовательностей, что, вероятно, свидетельствует о крайне высокой консервативности последовательности гена Е у ВКЭ европейского генотипа вне зависимости от источника выделения (клещи, мелкие млекопитающие, кровь человека). Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными. Так, при анализе последовательностей геномов штаммов ВКЭ, выделенных в Центральной Европе, была показана стабильность генома европейского генотипа [7]. Также, при сравнительном анализе кодирующей части полногеномных последовательностей ВКЭ из GenBank, было обнаружено, что штаммы европейского генотипа,

по сравнению с представителями дальневосточного и сибирского генотипов, характеризуются наиболее высокими уровнями гомологии как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей внутри одного генотипа, т.е. наименьшим уровнем различий [4]. Более того, следует отметить, что представители каждой из выявленных групп исследуемых штаммов ВКЭ с территорий Западной или Восточной Сибири обладали высокой степенью гомологии со штаммами, выделенными на территории Западной Европы, что также может служить доказательством высокой консервативности последовательности гена E.

ВКЭ европейского генотипа имеет обширный ареал и циркулирует в экосистемах, значительно различающихся, в том числе, и основными переносчиками и резервуарными хозяевами. Основным переносчиком европейского генотипа ВКЭ считались клещи I. ricinus, но, по всей видимости, в Азиатской части России его переносчиком может служить и I. persulcatus. Ранее, на территории Европы ВКЭ европейского генотипа был изолирован из Myodes glareolus, Apodemus sylvaticus, Sciurus vulgaris, а на территории Южной Кореи выделен из Apodemus agrarius. В нашей работе, на территории Восточной Сибири штаммы ВКЭ европейского генотипа были впервые изолированы из Spermophilus undulatus, Microtus gregalis и Myodes rutilus.

Тем не менее, несмотря на высокий уровень гомологии последовательностей гена E, наблюдается гетерогенность биологических свойств для ряда штаммов даже внутри одной группы, которые, вероятно, связаны с различиями в других областях генома. В связи с этим большой научный интерес представляет сравнительный анализ генетических и биологических свойств штаммов ВКЭ европейского субтипа, изолированных в удаленных друг от друга точках ареала, существенно отличающихся биоценотической структурой природных очагов.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of TBEV from Europe and Asia // J. Gen. Virol. - 1999. - V. 80. - P. 179-185.

2. Kim S.Y., Yun S.M., Han M.G., Lee I.Y., Lee N.Y., Jeong Y.E., Lee B.C., Ju Y.R. Isolation of tick-borne encephalitis viruses from wild rodents, South Korea // Vector Borne Zoonotic Dis. - 2008. - V. 8, № 1. - P. 7-13.

3) Yun S.M., Kim S.Y., Han M.G., Jeong Y.E., Yong T.S., Lee C.H., Ju Y.R. Analysis of the envelope (E) protein gene of tick-borne encephalitis viruses isolated in South Korea // Vector Borne Zoonotic Dis. - 2009. - V. 9, №3. - P. 287-293.

4. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Plyusnin A., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Zlobin V.I. Genotyping andcharacterization ofthe geographical distributionoftick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes // Journal of Medical Virology. - 2010. - V. 82. -P. 965-976.

5. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution // Mol. Biol. Evol. - 2011. - V. 28, №10. - P. 2731-2739.

ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)

6. Reed L., Muench H.A. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints // Am. J. Hyg. - 1938. - № 27. - P. 493-497.

7. Weidmann M., Frey S., Freire C.C., Essbauer S., Rmhek

D., Klempa B., Zubrikova D., Vцgerl M., Pfeffer M., Hufert F.T., Zanotto P.M., Dobler G. Molecular phylogeography of tick-borne encephalitis virus in central Europe // J. Gen. Virol. - 2013. - V. 94, Pt. 9. - P. 2129-2139.

ткачев Сергей Евгеньевич - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Е-таИ: sergey.e.tkachev@gmail.com;

Козлова ирина Валерьевна - д-р мед. наук, руководитель лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ, г. Иркутск; доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России.

джиоев Юрий Павлович - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ, г. Иркутск; ведущий научный сотрудник, руководитель лаборатории НИИ Биомедицинских технологий Иркутского государственного медицинского университета.

Верхозина Марина Михайловна - канд. биол. наук, биолог микробиологической лаборатории вирусологического отделения ПЦР-лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области».

Дорощенко Елена Константиновна - канд. биол. наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ, г. Иркутск.

Лисак оксана Васильевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗС РЧ, г. Иркутск.

демина татьяна Васильевна - д-р биол. наук, профессор Иркутской государственной сельскохозяйственной академии. Сунцова Ольга Владимировна - канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗС РЧ, г. Иркутск.

Злобин Владимир игоревич - академик РАН, д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России; директор НИИ Биомедицинских технологий Иркутского государственного медицинского университета.

Парамонов Алексей игоревич - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики ФГБНУ НЦ ПЗС РЧ, г. Иркутск.

тикунов артем Юрьевич - канд. биол. наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск.

Ляпунов александр Валерьевич - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций ФГБНУ НЦ ПЗС РЧ, г. Иркутск.

тикунова нина Викторовна - д-р биол. наук, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск.

ружек даниел - д-р медицины, заведующий кафедрой вирусологии, руководитель исследовательской группы по новым вирусным инфекциям Ветеринарного исследовательского института Академии наук Чешской Республики.

© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 3 октября 2014 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.