CC BY
63
УДК:579.841.579.222.3
НОВЫЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ-ДЕСТРУКТОР 2,4,5-ТРИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
©2011 Т.Р. Ясаков1, Е.Е. Куликов2, A.B. Летаров2, Е.Ю. Журенко1, В.В. Коробов1, Н.В. Жарикова1, Л.Г. Анисимова1, P.P. Гарафутдинов3, Т.В. Маркушева1
Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва 3Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа
Поступила 19.08.2011
В статье приведены культурально-морфолотические и физиолото-биохимические характеристики нового бактериального штамма-деструктора 2,4,5-Т рода Pseudomonas, выделенного из смешанных популяций почвенных микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства.
Ключевые слова: 2,4,5-Т, штаммы-деструкторы, Pseudomonas sp. 34Т.
Известно, что представители рода Pseudomonas имеют широкое распространение в биосфере, включая почвенный покров и воду. Псевдомонады обладают удивительной жизнеспособностью, имеются указания на то, что бактерии рода Pseudomonas способны участвовать в конверсии синтетических соединений. Так в литературе описан ряд штаммов рода Pseudomonas, осуществляющих утилизацию бифенилов и их хлорированных производных [9]. Среди представителей рода Pseudomonas обнаружены штаммы, способные осуществлять деструкцию летучих органических соединений [2], ПАУ [5-7], ДЦТ [1, 3, 8]. Вместе с тем, имеется мало данных об участии псевдомонад в деградации молекул пестицидов, и, в частности, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты, обладающей высокотоксичными и канцерогенными свойствами. Отсутствие сведений об особенностях процессов конверсии галогенсодержащих ксенобиотиков ароматического ряда во многом ограничивает возможности использования псевдомонад в качестве действующих элементов технологий защиты окружающей среды.
Цель настоящей работы - выявить культураль-но-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма-деструктора 2,4,5-Т рода Pseudomonas.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся природный изолят 34Т, выделенный из образца почвенных по-
Ясаков Тимур Рамилевич, канд. биол. наук, e-mail: yasakovt@gmail.com; Куликов Евгений Евгеньевич, канд. биол. наук, e-mail: eimienius@gmail.com; Летаров Андрей Викторович, канд. биол. наук, e-mail: letarov@gmail.com; Журенко Евгения Юрьевна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Коробов Владислав Викторович, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Жарикова Наталья Владимировна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Анисимова Лилия Георгиевна, e-mail: anisimovalilya@gmail.com; Гарафутдинов Равиль Ринатович, канд. биол. наук, e-mail: phmab@mail.ru; Маркушева Татьяна Вячеславовна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru.
пуляций микроорганизмов Северного промышленного узла г. Уфы.
Определение морфометрических характеристик клеток осуществляли с помощью электронной атомно- силовой микроскопии на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия).
Сканирование вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантиле-веров CSG01 фирмы NT-MDT с радиусом кривизны зонда 10 нм.
Фотографические изображения колоний были получены в режимах макросъемки в проходящем и отраженном свете.
Классификацию культуры проводили согласно принципам фенотипической дифференциации бактерий 9-го издания руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997).
Секвенирование ПЦР-продуктов последовательности гена 16S рРНК производили на автоматическом секвенирующем устройстве Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов в прямом и обратном направлениях согласно рекомендациям производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение индивидуальных морфологических и морфометрических характеристик клеток, а также исследование структуры их популяции показало, что культура 34Т была представлена клетками палочковидной формы (рис. 1 В и С).
На мясопептонном агаре культура образовывала блестящие, гладкие колонии белого цвета с неровным краем и слизистой консистенцией (рис. 1 А). На рисунке 1 (В и С) клетки штамма 34Т видны в скоплении. Размер клеток составляет 1,0-2,0 х 0,30,5 мкм. Из рис. 1В видно, что клетки обладают жгутиками. Окраска клеток по Граму отрицательная.
Для культуры был характерен аэробный рост. Оптимальный диапазон температуры варьировал от +22°С до +41°С. При +4°С, а также в интервале
Проблемы прикладной экологии
температур от +45 °С до +50°С, рост практически отсутствовал. При рН 5,7 наблюдался умеренный
рост, а оптимум значений рН для роста составлял 6,8-7,0.
Филогенетическое положение штамма определялось на основе анализа последовательности гена
16S рРНК. Согласно результатам сравнения, осуществленного в формате программы MEGA4, было сделано заключение о том, что штамм принадлежит к филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas (рис. 2).
Рис. 1. Вид отдельной колонии бактериальной культуры 34Т на поверхности агаризированной среды (МПА) (А); АСМ-изображения клеток штамма 34Т (фрейм 10.5x10.5 мкм) (В, С).
оо |— Pseudomonas cormgafa DSM 72287
■Г
я
у/
PxtfAdnmnr.ax kihnmxix !3fd7T
Pseudomonas tiriye'yalenxis CFBP 1126l'T - ♦
- Ps. frederiksbergensis DSM 15022j
Pseudomonas cor.geians DSM 1492S-7
.001 Pszuiävrn'jms lren:ae CFBP il 117 — Pzzuäom cnas cntzroraph ЭШ19603T юс- Pseudomonas chlzroraphis DSM 6598
too
Pseudomonas cedrina CFML 96 1957 PseMomonas csdf.na DSM 14ST
_I— Pseudomonas mzhm IpA-z,
icTM- Pzeiidom on as m ост DSM 1264 77
-IT
0.С05
Рис. 2. Филогенетическое положение штамма 34Т согласно результатам сравнительного анализа последовательности гена 16S рРНК.
Прим. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклео-тидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).
Последовательность гена 16S рРНК штамма 34Т образовывала кластер с тремя представителями рода Pseudomonas. Уровень гомологии генов 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов составлял около 99%. Наиболее близкими типовыми видами являлись Pseudomonas ihivervalensis CFBP 1126IT (99,2%), Pseudomonas cormgata DSM 7228T (99%) и Pseudomonas kilonensis DSM 13647T (99%). Принимая во внимание то, что последовательности ге-
на 16S рРНК этих штаммов имели гомологию равную или превышающую 99%, было сделано заключение о том, что точное видовое типирование оказывается затруднительным вследствие одинаково высокой взаимной гомологии последовательностей 16S рРНК штаммов Pseudomonas ihivervalensis CFBP 11261Т, Pseudomonas corrugata DSM 7228T и Pseudomonas kilonensis DSM 13647T. Согласно no-
лученным данным изучаемый изолят был класси- зования 2,4,5-Т в качестве единственного источни-
фицирован как штамм Pseudomonas sp. 34Т. ка углерода и энергии в периодической культуре
Проведено исследование динамики накопления (рис. 3). биомассы Pseudomonas sp. 34Т в условиях исполь-
о
о о
о
CK
со
SÉ
о CD Т
о
-Г 100
-- 80
А -- 60
40
- 20
0
со
I—
со о.
I—
о ю
о
CK
со о.
I— X CD
о
4 5 6 7 8 9 Время культивирования, сутки
Рис. 3. Динамика накопления биомассы и утилизации молекул 2,4,5-Т штаммом Pseudomonas sp. 34Т в периодической культуре.
Прим.: -■- -концентрация 2,4,5-Т, -х- - оптическая плотность.
Из рис. 4 видно, что фаза логарифмического роста культуры Pseudomonas sp. 34Т занимала около трех суток. Об этом свидетельствует возрастающий показатель значения оптической плотности, достигший 0,77 ОЕ. В это же время происходил активный процесс деструкции 2,4,5-Т: штамм утилизировал более 37,8% субстрата. Далее, почти на протяжении 3 суток, следовала фаза стационарного роста. Деградация 2,4,5-Т проходила постепенно в течение 9 суток, при этом было утилизировано 59,7% субстрата.
Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», гранта «Биоразнообразие и динамика генофондов», гранта Роснауки «Поддержка сети ЦКП, мероприятие 5.2» и программы У.М.Н.И.К.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bhat М.А., Ishida T., Horiike К. et al. Purification of 3,5-dichlorocatechol 1,2-dioxygenase, a nonheme iron dioxygenase and a key enzyme in the biodégradation of a herbicide, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), from Pseudomonas cepacia CSV90 // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300 (2). P. 738-746.
Анализ исследований, касающийся биологической деградации 2,4,5-Т, показал, что к настоящему времени было выделено несколько штаммов, принимавших участие в биологической деградации 2,4,5-Т, а именно: Brevibacterium sp., Pseudomonas cepacia, Nocardioides simplex 3E [4].
Принимая во внимание эти данные, следует сделать вывод о том, что в результате настоящих исследований был выделен новый штамм деструктор 2,4,5-Т Pseudomonas sp. 34Т
2. Chen Y.M., Lin T.F., Huang С. et al. Degradation of phenol and TCE using suspended and chitosan-bead immobilized Pseudomonas putida // J. Hazard. Mater. 2007. V. 148 (3). P. 660-670.
3. Jacobsen C.S., Pedersen J.C. Mineralization of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) in soil inoculated with Pseudomonas cepacia DBOl(pROlOl), Alcaligenes eutrophus AEO106(pRO 101) and Alcaligenes eutrophus JMP134(pJP4): effects of inoculation level and substrate concentration // Biodegradation. 1992. V. 2 (4). P. 253-263.
4. Kielbane J.J., Chatterzee D.K., Chakrabarty A. Detoxication of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid from contaminated soil by Pseudomonas cepacia //Appl. Environ. Microbiology. 1983. V. 45. № 5. P. 1697-1700.
Проблемы прикладной экологии
5. Li Q., Wang X., Yin G. et al. New metabolites in dibenzofuran cometabolic degradation by a biphenyl-cultivated Pseudomonas putida strain B6-2 // Environ. Sei. Technol. 2009. V. 43 (22). P. 8635-8642.
6. Pathak H., Kantharia D., Malpani A., Madamwar D. Naphthalene degradation by Pseudomonas sp. HOB1: in vitro studies and assessment of naphthalene degradation efficiency in simulated microcosms // J. Hazard. Mater. 2009. V. 166 (2-3). P. 1466-1473.
7. Puntus I.F., Filonov A.E., Akhmetov L.I. et al. Phenanthrene degradation by bacteria of the genera Pseudomonas and Burkholderia in model soil systems // Mikrobiologiia. 2008. V. 77 (1). P. 11-20.
Santacruz G., Bandala E.R., Torres L.G. Chlorinated pesticides (2,4-D and DDT) biodégradation at high concentrations using immobilized Pseudomonas fluorescens II J. Environ. Sei. Health B. 2005. V. 40 (4). P. 571-583.
Sondossi M., Sylvestre M., Ahmad D. Effects of Chlorobenzoate Transformation on the Pseudomonas testosteroni Biphenyl and Chlorobiphenyl Degradation Pathway // Appl. Environ. Microbiology. 1992. V. 58. № 2. P. 485-495.
NEW BACTERIAL STRAIN - DEGRADER OF 2,4,5-TRICHLOROPHENOXYACETIC ACID
© 2011 T.R. Yasakov1, E.E. Kulikov2, A.V. Letarov2, E.Yu. Zhurenko1, V.V. Korobov1, R.R. Garafutdinov3, N.V. Zharikova1, L.G. Anisimova1, T.V. Markusheva1
institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa 2Winogradsky Institute of Microbiology RAS, Moscow institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa
In the present article cultural, morphological, physiological and biochemical properties of the new bacterial 2,4,5-T degrader of the Pseudomonas genera have been investigated. The strain was isolated from the samples of soil microorganisms which have been exposed by factors of the petrochemical industry.
Keywords: 2,4,5-T, degrader, Pseudomonas sp. 34T.
Yasakov Timur Ramilevich, Candidate of Biology, e-mail: yasakovt@gmail.com; Kulikov Evgeny Evgen 'evich, Candidate of Biology, e-mail:eumenius@gmail.com; Letarov Audrey Viktorovich, Candidate of Biology, e-mail: letarov@gmail.com; Zhurenko Eugene Yur'evna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Korobov Vladislav Viktorovich, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Zharikova Natalia Vladimi-rovna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Anisimova Lilya Georgievna, e-mail: anisimovalilya@gmail.com; Garafutdinov Ravil Rinatovich, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Markusheva Tatiana Vyacheslavovna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru
