Сравнительный анализ генетических кластеров конверсии 2,4,5-т бактерий родов Burkholderia и Rhodococcus Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.25.5:577.121.2

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КЛАСТЕРОВ КОНВЕРСИИ 2,4,5-Т БАКТЕРИЙ РОДОВ БиЯКИОШЕША И RИODOCOCCUS

© А. И. Сагитова1*, Н. В. Жарикова1, Т. Р. Ясаков1, В. В.Коробов1, А. С. Ерастов2, Е. Г. Галкин2, Е. Ю. Журенко1, Т. В. Маркушева1

1 Институт биологии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 69.

2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел./факс: +7 (347) 284 31 05. *Етай: tvmark@anrb.ru

С использованием системы праймеров к консервативным областям гена tftA Вurkholderia sp. Ы38-УЫ3—2Ш выявлено сходство генов а-субъединиц 2,4,5-Т-оксигеназы, катализирующей первую реакцию конверсии 2,4,5-Т, приводящую к образованию 2,4,5-трихлорфенола, у штаммов-деструкторов 2,4,5-ТВurkholderia sp. Ы38-УЫ3—2Ши Rhodococcus гиЬгореНт^ш 5D.

Ключевые слова: ПЦР, оксигеназа, актиномицеты, хлорфеноксикислоты.

В ряде исследований было показано, что широко распространенные в природных экосистемах бактерии рода Rhodococcus характеризуются оригинальными катаболическими возможностями, которые позволяют представителям этого таксона конвертировать разнообразные по химической структуре углеводороды, включая ароматические, поли- и гетероциклические и их производные — га-логенированные фенолы, полихлорбифенилы и др. Сочетание уникальных ферментных систем родококков с устойчивостью их клеток к неблагоприятным условиям среды позволяет считать именно актинобактерии одной из перспективных групп, на основе которой могут быть созданы эффективные биопрепараты, направленные на реме-диацию окружающей среды.

Отмечено, что разнообразие метаболических путей у родококков обусловлено большим размером геномов. В последнее время сведения об особенностях организации генетических механизмов конверсии токсичных и труднодоступных соединений у представителей рода Rhodococcus все чаще играют роль решающего фактора в отборе культур, пригодных для практики.

Цель настоящей работы — выявить особенности строения генетических кластеров конверсии 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) штамма Rhodococcus rubropertinctus 5D.

Объекты исследований

Объектом исследования служил штамм гамма-подкласса протеобактерий R. rubropertinctus 5D, выделенный авторами работы в ходе скрининга деструкторов в смешанных популяциях почвенных микроорганизмов промзоны г. Уфы [1]. Для сравнительных экспериментов использовался штамм Burkholderia sp. M38-VN3—2W, предоставленный К. ЙюЬ

Методы исследований

Препараты геномной ДНК бактерий R. т-bropertinctus 5D и Burkholderia sp. M38-VN3-2W

получали путем лизиса клеток нагреванием до 95 °С.

При выполнении ПЦР-анализа применялась следующая система праймеров: tftA_F: 5' -ACATTCGACGGGAATTGGAA - 3' , tftA_R: AGGATTGAAGAAATCCTGATA - 3' [2]. В реакционную смесь при получении ПЦР-продуктов вносили: 67 mM Tris-HCl (pH 8.3), 17 mM (NH4)2SO4, 0.001% Tween 20, 2.5 mM MgCk, 25 пмоль каждого праймера, 2 мМ dNTP — 1.0 мкл и 1.25 единиц Taq-полимеразы (Sigma), ДНК-матрицу — 1 мкл; H2O — до 10 мкл. Накопленение ПЦР-продуктов проводили в амплификаторе TC 2720 (Applied biosystems, США) в следующем режиме: 1) 94.0 °С - 2:00, 2) 94.0 °С - 1:00, 3) 50.0 °С - 1:00, 4) 72.0 °С - 1:00, 5) 30 циклов 2 - 3 - 4 этапов, 6) 72.0 °С - 2:00, 7) конец программы.

Размеры фрагментов ДНК измеряли относительно маркеров (Fermentas, Литва) в формате программы Gel Analysis. Документацию результатов фракционирования амплификатов осуществляли в проходящем световом потоке трансиллюминатора (Vilber Louvermat, Франция) при длине волны 260280 нм.

Результаты исследований

Известно, что способность бактерий рода Rho-dococcus к деградации разнообразных ароматических соединений обусловлена наличием в их клетках большого набора оксигеназ [3]. Так, с участием 2,4,5-Т оксигеназы происходит реакция образования 2,4,5-трихлорфенола (2,4,5-ТХФ) из 2,4,5-трихлорфеноскиуксусной кислоты (2,4,5-Т). Данная реакция является первой и ключевой в описанном типе метаболизме гербицида 2,4,5-Т у штамма Burkholderia phenoliruptrix AC1100 (ATCC 53867) (ранее Pseudomonas cepacia AC1100). Реакция осуществляется с участием оксигеназы, образованной а- и ß-субъединицами с молекулярными массами 49 кДа и 24 КДа, соответственно. Полипептиды кодируются генами tftA и tftB (tftA1 и tftA2) и имеют N-

868

БИОЛОГИЯ

концевые аминокислотные последовательности, обладающие высокой степенью сходства с таковыми у диоксигеназ, гидроксилирующих ароматические кольца [4, 5]. В дополнение к 2,4,5-Т оксигена-зе для осуществления реакции необходимо присутствие NADH, O2 и редуктазной системы. В экспериментах in vitro отмечено, что данная реакция у B. phenoliruptrix AC1100 невозможна без активности фермента, выделяющегося совместно с 2,4,5-Т ок-сигеназой, и который, по-видимому, является ре-дуктазой [2, 4, 5].

В ходе настоящего исследования проведен ПЦР-анализ генов а-субъединицы 2,4,5-Т оксигена-зы штамма-деструктора 2,4,5-Т R. rubropertinctus 5D, выявленного авторами в ходе изучения биоразнообразия почвенных микроорганизмов, подвергавшихся комплексному воздействию факторов химического производства феноксигербицидов на территории Уфимского промузла. Сравнение проводилось с применением предложенной Huong N. L. с соавторами системы праймеров к консервативным областям гена tftA, принадлежащего кластеру деструкции 2,4,5-Т штамма Burkholderia sp. M38-VN3—2W, выделенного из образцов почв центральной части Вьетнама, подвергнутой широкомасштабному воздействию 2,4-Д и 2,4,5-Т во время военных действий [2].

Результаты фракционирования ПЦР-продуктов, полученных в экспериментах, позволили выявить амплификаты длиной 500 п.н. как в образце исследуемой геномной ДНК R. rubropertinc-tus 5D, так в образце препарата ДНК Burkholderia sp. M38-VN3—2W, примененного в качестве положительного контроля. Приведенное выше свидетельствует в пользу того, что в геноме R. rubroper-tinctus 5D присутствует гомолог гена tftA Burkholderia sp. M38-VN3-2W.

Как указано выше, из работы Huong N. L. с соавторами следует, что ген tftA, входящий в кластер tftAB Burkholderia sp. М38 VN3-2W, детерминирует реакцию, определяющую начальные стадии катаболизма молекул 2,4,5-Т, приводящую к образованию 2,4,5-трихлорфенола, окисляющегося в дальнейшем до хлорфенола 4-монооксигеназой, контролируемой генами tftCD [2]. Принимая во внимание полученные данные, можно полагать, что такие же этапы конверсии способны выполнять клетки R. rubropertinctus 5D.

Оценивая новизну полученных результатов, следует отметить, что ранее генетические особенности штаммов-деструкторов 2,4,5-Т рода Rhodo-coccus не были исследованы. Из 10-ти разнообразных проб почвы, отобранных по всей территории Вьетнама, Huong N. L. с коллегами выделили 353 деструктора 2,4-Д и 2,4,5-Т, при этом авторами отмечено, что большинство штаммов относится к родам Burkholderia (43.3%), Sphingomonas (40.2%) и Ralstonia (15.3%), в то время как штаммы рода Rhodococcus, не обнаруживались [2]. При изучении

техногенной экосистемы Уфимского промузла авторами настоящего исследования кроме штамма R. rubropertinctus 5D, были обнаружены деструкторы фенола и его хлорированных производных, включая 2,4-Д и 2,4,5-Т, родов Agromyces, Arthrobacter, Bacillus, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Steno-trophomonas и Xanthomonas [6-12].

В других работах среди представителей рода Rhodococcus были выявлены деструкторы фенола. Установлено, что культура Rhodococcus sp. AQ5NOL 2 утилизировала фенол через мета-путь расщепления ароматического кольца. Кроме фенола данный штамм разлагал дизельное топливо, 2,4-динитрофенол и р-крезол [13]. Описан штамм R. erythropolis, способный расти на феноле [14], а также культура Rhodococcus sp. Chr-9, утилизирующая фенол и пиридин [15].

Таким образом, на примере штаммов R. ru-bropertinctus 5D и Burkholderia sp. M38-VN3-2W обнаружено сходство в организации генетического кластера, контролирующего конверсию 2,4,5-Т в клетках грамположительных актиномицетов рода Rhodococcus и грамотрицательных бактерий рода Burkholderia, относящихся к разным экосистемам.

Полученные данные вносят вклад в понимание особенностей строения геномов бактерий современной биосферы и могут быть использованы в разработках микробиологических методов очистки окружающей среды от загрязнителей ароматического ряда.

Работа выполнена при содействии гранта программы Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития».

ЛИТЕРАТУРА

1. Жарикова Н. В., Журенко Е. Ю., Коробов В. В., Ясаков Т. Р., Анисимова Л. Г., Маркушева Т. В., Абрамов С. Н. Выделение и анализ биодеградационного потенциала нового природного штамма-деструктора хлорфеноксикислот рода Rhodococcus // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. №5(2). C. 169-171.

2. Huong N. L., Itoh K., Suyama K. Diversity of 2,4-Dichloro-phenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid - Degrading bacteria in Vietnamese Soils // Microbes Environ. 2007. V. 22. No. 3. P. 243-256.

3. Larkin M. J. Kulakov L. A. Allen C. C. Diodegradation and Rhodococcus - masters of catabolic versality // Current Jpin-ion in Biotechnology. 2005. V. 16. No. 3. Р. 282-290.

4. Xun L., Wagnon K. Purification and properties of component B of 2,4,5-trichlorophenoxyacetate oxygenase from Pseudomonas cepacia AC1100 // Applied and Environmental Microbiology. 1995. V. 61. No. 9. P. 3499-3502.

5. Hübner A, Clyde E. Danganan, Xun L., Chakrabarty A. M., Hendrickson W. Genes for 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid metabolism in Burkholderia cepacia AC1100: characterization of the tftC and tftD genes and locations of the tft operons on multiple replicons // Applied and Environmental Microbiology. 1998. V. 64. No. 4. P. 2086-2093.

6. Журенко Е. Ю., Коробов В. В., Жарикова Н. В., Ясаков Т. Р., Анисимова Л. Г., Маркушева Т. В. Особенности структуры микробиоты техногенной экосистемы Северного промузла РБ: бактерии-деструкторы фенола и 2,4-дихлорфенола // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. .№5(2). C. 172-174.

7. Федорова А. А., Коробов В. В., Журенко Е. Ю., Жарикова Н. В., Ясаков Т. Р., Анисимова Л. Г., Маркушева Т. В. Особенности ассимиляции 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты Bacillus subtilis 16 // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1(38). С. 182-183.

8. Коробов В. В., Журенко Е. Ю., Маркушева Т. В. Ремедиа-ция среды от хлорароматических гербицидов культурой Arthrobacter globiformis // Известия Оренбургского Государственного Аграрного Университета. 2013. №2(40). С. 218-219.

9. Коробов В. В., Жарикова Н. В., Анисимова Л. Г., Ясаков Т. Р., Кусова И. В., Журенко Е. Ю., Галкин Е. Г., Маркушева Т. В. Agromyces sp. IBRB-34DCP - новый штамм-деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. Т. 15. №3 С. 1320-1322.

10. Коробов В. В., Маркушева Т. В., Кусова И. В., Журенко Е. Ю., Галкин Е. Г., Жарикова Н. В., Гафиятова Л. Р. Штамм бактерий Serratia marcescens В-6493 - деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола // Биотехнология. 2006. №2. С. 63-65.

11. Маркушева Т. В., Журенко Е. Ю., Жарикова Н. В., Коробов В. В., Ясаков Т. Р., Анисимова Л. Г. Штаммы-деструк-

торы хлорфеноксикислот гамма - подкласса протеобакте-рий // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. №5(2). C. 194-195.

12. Жарикова Н. В., Журенко Е. Ю., Коробов В. В., Ясаков Т. Р., Анисимова Л. Г., Маркушева Т. В. Биоразнообразие бактерий-деструкторов хлорированных феноксикислот // Вестник оренбургского государственного университета. 2009. №6. C. 121-123.

13. Arif N.M., Ahmad S.A., Syed M.A., Shukor M.Y. Isolation and characterization of a phenol-degrading Rhodococcus sp. strain AQ5NOL 2 KCTC 11961BP // J. Basic Microbiol. 2013. No. 53(1). P. 9-19.

14. Kolouchovа I, Schreiberovа O, Masаk J, Sigler K, Rezanka T. Structural analysis of mycolic acids from phenol-degrading strain of Rhodococcus erythropolis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Folia Microbiol (Praha). 2012. No. 57(6). P. 473-483.

15. Sun JQ, Xu L, Tang YQ, Chen FM, Liu WQ, Wu XL. Degradation of pyridine by one Rhodococcus strain in the presence of chromium (VI) or phenol // J. Hazard Mater. 2011. V. 191. No. 1-3. P. 62-68.

Поступила в редакцию 02.07.2014 г.

870

БИОЛОГИЯ

COMPARATIVE ANALYSIS OF 2,4,5-T CONVERSION GENETIC CLUSTERS OF RHODOCOCCUS AND BURKHOLDERIA BACTERIAL GENERA

© ^ I. Sagitova1*, N. V. Zharikova1, ^ R. Yasakov \ V. V. Коrobov1, А. S. Erastov2, Е. G. Galkin2, K Yu. Zhurenko1, Т. V. Маrkusheva1

1Institute of Biology USC RAS 69 Octyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

2Institute of organic chemistry USC RAS 71 Octyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

Phone: +7 (347) 284 31 05.

* Email: tvmark@anrb.ru

Many species of wide distributed in natural ecosystems gram-positive Actinomycetes are characterized by original catabolic features that allow members of this taxon to convert aromatic hydrocarbons including their halogenated derivatives. The combination in Rhodococcus cells unique enzyme systems with resistance to adverse environmental conditions opens the opportunities to offer the members of this bacterial genus as one of the most promising group for the development of effective environment remediation in the technosphere. Unfortunately, the experimental data are scarce for most of actinomycetes destructors. We focused our attention on the features of the Rhodococcus genes, determining 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) conversion. The special primers system to the conservative tftA gene regions tftA F: 5 '- CATTCGACGGGAATTGGAA - 3', tftA R: 5 '-AGGATTGAAGAAATCCTGATA - 3' had been used for PCR analysis [Huong NL, 2007]. The results revealed the similarity of a-subunits 2,4,5-T oxygenase genes, catalyzing the first reaction of 2,4,5-T conversion in R. rubropertinctus 5D and Burkholderia sp. M38-VN3-2W cells. The received data can be applied for the new strains destructors in vitro design.

Keywords: PCR, oxygenase, actinomycetes, chlorophenoxyacetic acid.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Zharikova N. V, Zhurenko E. Yu., Korobov V V, Yasakov T. R., Anisimova L. G., Markusheva T. V., Abramov S. N. Izvestiya Samar-skogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2011. Vol. 13. No. 5(2). Pp. 169-171.

2. Huong N. L., Itoh K., Suyama K. Microbes Environ. 2007. Vol. 22. No. 3. Pp. 243-256.

3. Larkin M. J. Kulakov L. A. Allen C. C. Current Jpinion in Biotechnology. 2005. Vol. 16. No. 3. Pp. 282-290.

4. Xun L., Wagnon K. Applied and Environmental Microbiology. 1995. Vol. 61. No. 9. Pp. 3499-3502.

5. Hübner A, Clyde E. Danganan, Xun L., Chakrabarty A. M., Hendrickson W. Applied and Environmental Microbiology. 1998. Vol. 64. No. 4. Pp. 2086-2093.

6. Zhurenko E. Yu., Korobov V V., Zharikova N. V., Yasakov T. R., Anisimova L. G, Markusheva T. V. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2011. Vol. 13. No. 5(2). Pp. 172-174.

7. Fedorova A. A., Korobov V V., Zhurenko E. Yu., Zharikova N. V., Yasakov T. R., Anisimova L. G., Markusheva T. V Vestnik Ural'skoi meditsinskoi akademicheskoi nauki. 2011. No. 4/1(38). Pp. 182-183.

8. Korobov V. V., Zhurenko E. Yu., Markusheva T. V Izvestiya Orenburgskogo Gosudarstvennogo Agrarnogo Universiteta. 2013. No. 2(40). Pp. 218-219.

9. Korobov V V, Zharikova N. V., Anisimova L. G., Yasakov T. R., Kusova I. V., Zhurenko E. Yu., Galkin E. G, Markusheva T. V Agro-myces sp. IBRB-34DCP - novyi shtamm-destruktor fenola i 2,4-dikhlorfenola Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2013. Vol. 15. No. 3 Pp. 1320-1322.

10. Korobov V V, Markusheva T. V, Kusova I. V., Zhurenko E. Yu., Galkin E. G, Zharikova N. V, Gafiyatova L. R. Biotekhnologiya. 2006. No. 2. Pp. 63-65.

11. Markusheva T. V, Zhurenko E. Yu., Zharikova N. V, Korobov V V., Yasakov T. R., Anisimova L. G. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2011. Vol. 13. No. 5(2). Pp. 194-195.

12. Zharikova N. V, Zhurenko E. Yu., Korobov V V., Yasakov T. R., Anisimova L. G., Markusheva T. V. Vestnik orenburgskogo gosudarstvennogo universiteta. 2009. No. 6. Pp. 121-123.

13. Arif N.M., Ahmad S.A., Syed M.A., Shukor M.Y. J. Basic Microbiol. 2013. No. 53(1). Pp. 9-19.

14. Kolouchova I, Schreiberova O, Masak J, Sigler K, Rezanka T. Folia Microbiol (Praha). 2012. No. 57(6). Pp. 473-483.

15. Sun JQ, Xu L, Tang YQ, Chen FM, Liu WQ, Wu XL. J. Hazard Mater. 2011. Vol. 191. No. 1-3. Pp. 62-68.

Received 02.07.2014.