CC BY
448
УДК 577.21
© д. м. музаев, А. м. румянцев, Е. В. самбук, м. В. Падкина
Санкт-Петербургский государственный университет
дрожжи ркыа pastoris используются для синтеза множества рекомбинантных белков. широкое применение этого вида дрожжей в биотехнологии обусловлено относительной простотой культивирования, дешевизной используемых сред и возможностью осуществления посттрансляционных модификаций белков. основными способами повышения выхода рекомбинантного белка являются увеличение числа копий генов, кодирующих исследуемый белок, а также коэкспрес-сия вспомогательных факторов, участвующих в фолдинге, созревании и секреции белка. необходимым условием для применения этих подходов является расширение коллекции ауксотрофных мутантов. В ходе данной работы была создана коллекция плазмид и штаммов, позволяющая осуществлять множественную интеграцию чужеродных генов в геном р. pastoris.
С ключевые слова: Pichia pastoris; рекомбинантные белки; экспрессия генов; генная инженерия.
Поступила в редакцию 19.11.2014 Принята к публикации 25.02.2015
НОВЫЕ ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS — ПРОДУЦЕНТЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ
ВВЕДЕНИЕ
Дрожжи P. pastoris широко используются для наработки самых разнообразных белков, начиная от столбнячного токсина и эпидермального фактора роста мыши и заканчивая мембранными белками, включающими ABC транспортеры, аквапорины и тетраспанины (Darby et al., 2012; Cregg et al., 2000). Исходя из опыта применения P. pastoris в биотехнологии известно, что существует приблизительно 50—75%-я вероятность удачного синтеза любого чужеродного белка в P. pastoris. При этом использование дрожжей P. pastoris открывает широкие возможности для оптимизации условий культивирования, что позволяет достигать необычайно высоких уровней продукции целевого белка (Cregg & Cereghino, 2000).
Активное использование дрожжей P. pastoris в современных биотехнологических производствах напрямую связано с особенностями их метаболизма. К преимуществам метилотрофных дрожжей можно отнести простоту культивирования, относительную дешевизну среды и возможность применения различных методик генетических манипуляций. Ещё одной особенностью этого вида дрожжей является способность осуществлять посттрансляционные модификации, характерные для белков высших эукариот.
В биотехнологии при работе с дрожжами самой сложной задачей является достижение оптимального баланса между уровнем синтеза целевого белка и жизнеспособностью штаммов-продуцентов. Применение P. pastoris открывает широчайшие возможности для оптимизации условий культивирования. Одним из способов увеличения уровня синтеза целевого белка является получение штаммов P. pastoris, несущих множественные копии чужеродного гена. Другим подходом, чаще всего используемым при работе с секреторными белками, является коэкспрессия генов, кодирующих различные вспомогательные факторы. Для успешного применения этих подходов необходимо создание коллекции плазмид, позволяющих осуществлять множественную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris, а также получение множественно-маркированных штаммов-продуцентов.
Одной из стратегий усиления экспрессии специфичного гена в P. pastoris является увеличение числа экспрессионных кассет в штамме-хозяине (Scorer et al., 1994). Для этого могут быть использованы векторы с множественными тандемными копиями гена, расположенными последовательно в экспресси-онной кассете (Brierley, 1998). Кроме того, существует возможность конструирования кассеты экспрессии на основе вектора, несущего в качестве селективного маркера один из генов устойчивости к действию антибиотиков. К числу этих маркерных генов относятся гены устойчивости к зеоцину (ZeoR) (Higgins et al., 1998), бластицидину (BlaR), генетицину (G418R) (Scorer et al., 1994; Sunga & Cregg, 2004).
Другим подходом является конструирование нескольких векторов экспрессии с различными селективными маркерами и последующая их интеграция в геном штаммов P. pastoris. При этом чаще всего применяются плазмидные векторы, которые содержат ген гистидинолдегидрогеназы HIS4 в качестве селективного маркера, и соответствующие им ауксотроф-ные штаммы.
При работе с дрожжами S. cerevisiae широко используются селективные системы на основе генов URA3 и LYS5. Использование этих генов даёт возможность проведения позитивной и негативной селекции (Littlewood, 1972).
Ген URA3 кодирует оротидин-5'-фосфатдекарбоксила-зу (EC 4.1.1.23), фермент, необходимый для биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов. Позитивная селекция основана на ауксотрофности мутантов ura3, которые не способны расти на среде без урацила. Мутанты ura3 могут быть отобраны на среде, содержащей 5-фтороротовую кислоту (ФОК). Поскольку под действием декарбокси-лазы ФОК превращается в токсическое соединение 5-ф-тороурацил, клетки дикого типа URA3 погибают на среде с ней (Sherman, 1997).
Другой ген, широко используемый в селективных системах — LYS5 кодирует фермент фосфопантетил-трансферазу (EC 2.7.8.7). Этот фермент в пути биосинтеза лизина преобразует неактивный апо-фермент аль-фа-аминодипатредуктазы в активную форму. Мутации в гене LYS5 ведут к ауксотрофности клеток по лизину. Мутантов lys5 можно отобрать на среде с-аминоадипи-новой кислотой.
В ходе данной работы были созданы экспрессионные системы дрожжей P. pastoris, основанные на ортологах генов URA3 и LYS5 дрожжей S. cerevisiae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Среды и условия культивирования штаммов
При работе с дрожжами использовали стандартные культуральные среды: богатую среду YPD, ПЕП, синтетическую минеральную среду Md (Guthrie & Fink, 1991). Штаммы дрожжей P. pastoris выращивали при 30 °С. Для культивирования бактериальных штаммов использовали среду LB. Штаммы E. coli выращивали при 37 °С.
Плазмиды
ПЦР-продукты клонировали в промежуточный вектор pTZ57R/T (Thermoscientific). В качестве основы для создания векторов для экспрессии чужеродных генов в P. pastoris использовали плазмиду pPIC9 (Invitrogen©).
Методы
Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью алгоритмов Blast и Clustal.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя реактивов (Thermoscientific). Последовательности праймеров для проведения ПЦР представлены в таблице 1.
Выделение ДНК из клеток бактерий и дрожжей, трансформацию дрожжей и бактерий и электрофорез ДНК в агарозном геле проводили в стандартных условиях (Sambrook & Russel, 2001). Гидролиз ДНК эндонукле-азами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из ага-розных гелей и лигирование фрагментов ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя использованных реактивов и наборов (Thermoscientific).
Секвенирование проводили с использованием реактивов Big Dye v3.1 и Big Dye v1.1 (Applied Biosystems) на генетическом анализаторе 3130 (Applied Biosystems). Полученные хроматограммы анализировали с помощью программ BioEdit и UniGene.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клонирование генов PpURA3 и PpLYS5
На первом этапе работы был проведен анализ баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и http://www.pichiagenome.org/, содержащих геномные последовательности дрожжей P. pastoris. Были выявлены последовательности гомологичные генам URA3 и LYS5 дрожжей S. cerevisiae: PpURA3 (P. pastoris GS-115, хромосома 3, локус PAS_chr3_0381, gene ID: 8199513), и PpLYS5 (P. pastoris GS-115, хромосома 4, локус PAS_chr4_0793, gene ID: 8200571). К выбранным последовательностям были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать указанные гены и их регуля-торные области (табл. 1). 5'-концы праймеров содержат последовательности сайтов рестрикции (PpURA3: SphI и Spei; PpLYS5: SphI и XbaI), необходимые для проведения последующего клонирования ПЦР-продуктов.
В качестве матрицы для амплификации генов PpURA3 и PpLYS5 была использована хромосомная ДНК штамма Х-33 дрожжей P. pastoris (дикий тип,
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидиов, использованных в работе_
Название Последовательность
Прямой праймер URA3 5'-ACTAGTATTCTGACATCCTTTTAGAGCAC -3'
Обратный праймер URA3 5'-ACTAGTCTGGTCAAAGAAAGCAC - 3'
Прямой праймер LYS5 5'-GCATGCAGTCACCATTTCTTCAC - 3'
Обратный праймер LYS5 5'-TCTAGATGGATGAGGTATTGGAG-3'
Lifetechnologies). Амплифицированные фрагменты генов URA3 и LYS5 были клонированы в промежуточном векторе pTZ57R/T, при этом использовали технологию ТА-клонирования, реализованную в наборе InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo scientific). Фрагменты встраивали в ген lacZ, что обеспечивало возможность использования метода бело-голубой селекции на среде с субстратом X-gal. В результате были получены генетические конструкции на основе вектора pTZ57R/T, которые содержали последовательности генов PpURA3 и PpLYS5, ограниченные сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Структура плазмид была подтверждена данными рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования.
Создание ауксотрофных штаммов P. pastoris
В нуклеотидную последовательность генов PpURA3 и PpLYS5 в составе векторов pTZ57R/ T-URA3 и pTZ57R/T-LYS5 были внесены делеции. Вектор pTZ57R/T-URA3 был обработан рестриктазой BsrGI (размер удаленного участка составил 1253 п. о.), а вектор pTZ57R/T-LYS5 рестриктазами ClaI и BsrGI (размер удаленного участка составил 418 п. о.). Фрагменты обрабатывали Pfu-полимеразой и проводили их самолигиро-
вание. Плазмиды анализировали с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования.
Полученные плазмиды pTZ57R/T-АPpura3 и pTZ57R/T-APplys5 (рис. 1) были использованы для создания штаммов P. pastoris ауксотрофных по урацилу и лизину соответственно. С помощью ПЦР по матрице данных плазмид были амплифицированы фрагменты генов Ppura3 и Pplys5, содержащие делеции. Данными фрагментами был трансформирован штамм Л-33 дрожжей P. pastoris. Для эффективного отбора трансформантов была использована негативная селекция. Штаммы, несущие делецию в гене PpURA3, отбирали по способности к росту на среде с 5-фтороротовой кислотой (ФОК) с добавлением урацила. Были отобраны клоны, характеризующиеся ауксотрофностью по урацилу (рис. 2).
Штаммы, несущие делецию в гене PpLYS5, отбирали на среде с альфа-аминоадипиновой кислотой с добавлением лизина. Были отобраны клоны, характеризующиеся ауксотрофностью по лизину (рис. 2).
Различий в скорости роста полученных штаммов P. pastoris 1-Л-33 ura3А и 2-Л-33 lys5А по сравнению с исходным штаммом Х-33 не наблюдали.
рис. 1. Плазмиды, полученные в ходе работы: pTZ57R/T- АPpura3, pTZ57R/T-АPplys5, pPIC9-his4::URA3 и pPIC9-his4::LYS5. AmpR — ген р-лактамазы, отвечающий за устойчивость к ампициллину; ori — участок начала репликации; MCS — сайт множественного клонирования
рис. 2. Рост полученных штаммов на средах различного состава
Создание векторов экспрессии на основе маркеров PpURA3 и PpLYS5
Помимо упомянутых выше ауксотрофных штаммов для экспрессии чужеродных генов в P. pastoris необходимо наличие векторов, позволяющих проводить селекцию трансформантов. В данной работе в качестве основы был выбран вектор pPIC9 (Invitrogen©), несущий ген HIS4 дрожжей P. pastoris, который обеспечивает селекцию трансформантов по восстановлению прототрофнос-ти по гистидину. В ходе работы фрагменты, содержащие последовательность гена HIS4, в составе pPIC9 замещали на последовательности генов PpURA3 и PpLYS5. Для этого при замене HIS4 на PpURA3 вектор pPIC9 был обработан рестриктазами XbaIи SphI. При этом был удален участок, содержащий ген HIS4, размером 2751 п. о. Встраиваемый фрагмент, содержащий ген PpURA3, был
получен при обработке вектора pTZ57R/T- URA3 рестриктазами SpeI и SphI, а фрагмент PpLYS5 — при обработке вектора pTZ57R/T-LYS5 рестриктазами SphI и XbaI. Далее проводили лигирование фрагментов PpURA3 или PpLYS5 с вектором pPIC9. Полученные плазмиды анализировали с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования. Таким образом, на основе вектора pPIC9 были созданы генетические конструкции, в которых исходная последовательность гена HIS4 заменена на последовательности генов PpURA3 и PpLYS5 (рис.1).
Плазмидой pPIC9-his4::URA3 трансформировали созданный ранее штамм P. pastoris 1-X-33 ura3A, а плазмидой pPIC9-his4:: LYS5 — штамм 2-X-33 lys,5A. У полученных трансформантов восстанавливалась прототрофность по урацилу и лизину соответственно (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Использование дрожжей P. pastoris в биотехнологии открывает широкие возможности для оптимизации условий синтеза рекомбинантных белков. Для повышения выхода рекомбинантного белка применяется увеличение числа копий генов, кодирующих исследуемый белок, а также коэкспрессия различных вспомогательных факторов. Одним из существенных ограничений применения данных методов является недостаточная доступность штаммов P. pastoris и соответствующих плазмид.
Созданный в ходе данной работы штамм 1-X-33 ura3A аналогичен описанным ранее штаммам P. pastoris, несущим ауксотрофность по урацилу (Cereghino et al., 2000). Получение данного штамма является необходимым этапом для создания штаммов P. pastoris, характеризующихся другими ауксотрофностями. Для этого в ходе дальнейшей работы будут использованы методы дисруп-ции генов, основанные на применении гена PpURA3 в качестве селективного маркера (Scherer & Davis, 1979).
В качестве альтернативного подхода возможно применение созданного впервые штамма 2-X-33 lys5A, поскольку использование гена PpLYS5 так же позволяет проводить позитивную и негативную селекцию.
Созданные в ходе работы плазмиды и ауксотрофные штаммы позволяют осуществлять интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris. Дальнейшее их применение позволит ещё больше расширить коллекцию селективных маркеров и ауксотрофных мутантов дрожжей P. pastoris. Полученные результаты имеют важное практическое значение, поскольку дают возможность оптимизировать синтез рекомбинантных белков за счет строгого контроля количества копий чужеродного гена или за счёт коэкспрессии генов, кодирующих различные вспомогательные факторы. Так же использование подобной коллекции открывает широкие перспективы для применения генетического анализа у дрожжей P. pastoris.
Работа поддержана грантами ведущей научной школе НШ-5115.2014.4, а также грантом СПбГУ 1.38.229.2014.
ЛИТЕРАТУРА
1. Brierley R. A. (1998) Secretion of recombinant human insulin-like growth factor (IGF-1). Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Humana Press, Totowa, NJ. V. 103: P. 149-177.
2. Cregg J. M., Cereghino J. L., Shi J. Y., Higgins D. R. (2000) Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. V 16: P. 23-52.
3. Darby R. A., Cartwright S. P., Dilworth M. V., Bill R. M. (2012) Yeast Species Shall I Choose? Sac-
charomyces cerevisiae Versus Pichia pastoris (Review). Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. V. 866: P. 11-23.
4. Guthrie C., Fink G. R. (1991) Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic Press. V. 3: P. 194-933.
5. Higgins D. R., Busser K., Comiskey J., Whittier P. S., Purcell T. J., Hoeffler J. P. (1998) Small vectors for expression based on dominant drug resistance with direct multicopy selection. Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Humana Press, Totowa, NJ. V 103: P. 41-53.
6. Littlewood B. S. (1972) A method for obtaining antibiotic-sensitive mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. V. 71 (2): P. 305-308.
7. Scorer C. A., Clare J. J., McCombie W R., Romanos M. A., Sreekrishna K. (1994) Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign gene expression. BioTechnology. V. 12: P. 181-184.
8. Sambrook J., Russel D. W (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, 3d edition. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
9. Sherman F. (1997) Yeast genetics. The encyclopedia of molecular biology and molecular medicine. V 6: P. 302-325.
10. Sunga A. J., Cregg J. M. (2004) The Pichia pastoris formaldehyde dehydrogenase gene (FLD1) as a marker for selection of multicopy expression strains of P. pastoris. Gene. V. 330: P. 39-47.
11. GenBank. Komagataella pastoris GS115. Reference genome sequence. Cited 19.12.2014. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/338?genome_ assembly_id=28698.
12. Pichia pastoris Genome Browser. Genome Database of the Pichia pastoris. Cited 19.12.2014. URL: http://www.pichiagenome.org/.
13. Lin Cereghino G. P., Lin Cereghino J., Sunga A. J., Johnson M. A.,Lima M.,Gleeson M. A. G.,Cregg J. M. (2000) New selectable marker/auxotrophic host strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris. Gene. V. 263: P. 159-169.
14. Scherer S., Davis R. W. (1979) Replacement of chromosome segments with altered DNA sequences constructed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. V. 76: P. 4951-4955.
creation of new pichia pastoris strains for recombinant protein production
Muzaev D. M, Rumyantsev A. M., Sambuk E. V.,
Padkina M.V.
C sUMMARY: Pichia pastoris yeasts are widely used as a production platform for heterologous proteins. Wide biotechnological use of these yeasts is
determined by simplicity of cultivation, cheap media and ability to provide posttranslational modifications. Basic approaches for enhancement of the recombinant protein outcome constitue increasing number of gene copies, which encode target protein, as well as co-expression of supporting factors for protein folding, processing and secretion. Development of relevant
plasmids and auxotrophic strains is essential for solving these tasks. In this study, we report plasmids and strains collection, whichwill allow to conduct integration of multiple foreign genes in P. pastoris genome
C KEY WORDS: Pichiapastoris; recombinant proteins; genes expression; gene engineering.
C Информация об авторах
Музаев Дмитрий Михайлович — магистр, кафедра генетики и биотехнологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: dmmuzaev@yandex.ru.
Румянцев Андрей Михайлович — магистр, кафедра генетики и биотехнологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: rumyantsev-am@mail.ru.
Самбук Елена Викторовна — д. б. н., профессор, кафедра генетики и биотехнологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: esambuk@mail.ru.
Muzaev Dmitriy Mikhaylovich — master, Dept. Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9. Russia. E-mail: dmmuzaev@yandex.ru.
Rumyantsev Andrey Mikhaylovich — master, Dept. Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9. Russia. E-mail: rumyantsev-am@mail.ru.
Sambuk Elena Viktorovna — Dr. Sci. Biol, professor, Dept. Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9. Russia. E-mail: esambuk@mail.ru.
Падкина Марина Владимировна — д. б. н., профессор, кафедра генетики и биотехнологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: mpadkina@mail.ru.
Padkina Marina Vladimirovna — Dr. Sci. Biol, professor, Dept. Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9. Russia. E-mail: mpadkina@mail.ru.
