CC BY
47
МЕТОДОЛОГИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ
ГЕНЕТИКИ
Э01: 10.178Ш/еео£еп16250-59
КЛОНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ РРШ2 И РРРйП
ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А РАвГОИ/в, ОЦЕНКА ИХ АКТИВНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ
© М.А. Цыганков, М.В. Падкина
ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Для цитирования: Цыганков М.А., Падкина М.В. Клонирование промоторов генов РрКАЯ2 и РрРЮН дрожжей Р1сЫараз1ог1з, оценка их активности и эффективности использования для экспрессии гетерологичных генов // Экологическая генетика. — 2018. — Т. 16. — № 2. — С. 50 — 59. 10.1781б/ееоееп16250-59.
Поступила в редакцию: 26.04.2018 Принята к печати: 25.06.2018
'Ш Дрожжи РкМа раз^пз успешно используют в биотехнологии, с их помощью синтезированы различные соединения. Промоторы — ключевой фактор продуктивности системы экспрессии, так как они определяют уровень транскрипции гетерологичного гена. Целью нашей работы было изучение промоторных областей генов РрКАК2 и РрРЭИ и оценка возможности их применения для эффективной экспрессии гетерологичных генов. Активность промоторов оценивали с помощью системы на основе структурного гена кислой фосфатазы дрожжей БассНаготусвз свгви181ав — РН05. Чтобы выяснить влияние сверхпродукции собственного и гетерологичного белка на активность изучаемых промоторов, мы использовали штаммы-продуценты белка протеиндисульфидизомеразы Р. pastoris и дельтазеина кукурузы. Для оценки эффективности применения изучаемых промоторов для экспрессии гетерологичных генов мы проэкспрессировали под их контролем ген, кодирующий интерферон-альфа 16 человека. С помощью биоинформатических методов определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов. В результате работы мы показали, что изучаемые промоторы оказалась слабее промотора гена А0Х1, но повышают свою активность в ответ на продукцию гетерологичных белков и могут быть использованы для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Р. pastoris.
"Ш Ключевые слова: Pichia pastoris; экспрессия гетерологичных генов; промотор КАЯ.2; промотор РЭП.
CLONING OF PPKAR2 AND PPPDI1 GENES PROMOTERS FROM YEAST PICHIA PASTORIS, AN EVALUATION OF THEIR ACTIVITY AND EFFICACY
FOR THE HETEROLOGOUS GENES EXPRESSION
© M.A. Tsygankov, M.V. Padkina
Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
For citation: Tsygankov MA, Padkina MV Cloning of PpKAR2 and PpPDIl genes promoters from yeast Pichia pastoris, an evaluation of their activity and efficacy for the heterologous genes expression. Ecological genetics. 2018;16(2):50-59. doi: 10.17816/ecogen16250-59.
Received: 26.04.2018 Accepted: 25.06.2018
& Background. Yeast Pichia pastoris is successfully used in biotechnology, with their help synthesized various compounds. Promoters are a key factor in the productivity of an expression system, since they determine the expression level of a heterologous gene. The aim of our work was to study the promoter regions of the PpKAR2 and PpPDIl genes and to evaluate their use for effective expression of heterologous genes. Materials and Methods. To evaluate the activity of promoters, we used a reporter system based on the structural gene of acid phosphatase of yeast Saccharomyces cerevisiae — PHO5. To determine the effect of overproduction of native and heterologous protein on the activity of the promoters under study, we used the producer strains of P. pastoris protein disulfide isomerase and maize delta-zein. To evaluate the effectiveness of the use of the promoters under study for the expression of heterologous genes, we have expressed under their control a gene encoding human interferon-alpha16. Results. The promoters of the yeast genes — PpKAR2 and PpPDIl were cloned. Their activity was compared with the promoter of the PpAOXl gene in the native strains, as well as in strains with overproduction of native and heterologous proteins. Under the control of these promoters, the gene encoding human interferon-alpha 16 is expressed. Conclusion. The promoters studied were weaker than the promoter of the AOX1 gene, but increase their activity in response to the production of heterologous proteins and can be used to express hete-rologous genes.
& Keywords: Pichia pastoris; heterologous gene expression; KAR2 promoter; PDI1 promoter.
ВВЕДЕНИЕ
Дрожжи Pichia pastoris успешно используют для экспрессии гетерологичных генов, с их помощью синтезированы различные гетерологичные белки, уровень продукции которых выше, чем во многих других микробных системах [ 1 ]. Список белков, успешно синтезированных в P. pastoris, постоянно расширяется, несколько биофармацевтических продуктов были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для использования в медицине, и более 70 продуктов находятся на поздней стадии разработки [2]. В процессе создания системы экспрессии гетерологичного гена всегда встает вопрос о выборе промотора. Промоторы — ключевой фактор продуктивности системы экспрессии, так как он определяет уровень экспрессии гетерологичного гена [3]. Одними из наиболее часто применяемых промоторов P. pastoris являются индуцибельный промотор гена алкогольоксидазы-1 — PAOX1 и конститутивный промотор гена глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (PGAP) [4]. Достоинства промотора PAOX1 заключаются в его высокой активности и возможности регулировать экспрессию гетерологичного гена. В связи с опасностью использования на производстве такого ядовитого и опасного индуктора, как метанол, проводится работа по получению вариантов промотора, которые можно индуцировать без применения метанола при сохранении высокой активности [5]. Так, был получен штамм с делециями структурных генов Amig1 ^.mig2^.nrg1, отвечающих за катаболитную репрессию PAOX1, и сверхпродукцией активатора транскрипции МИ1р, у которого активность PAOX1 на среде с глицерином составляла 77 % его активности на среде с метанолом [6]. Аналогичный подход показал эффективность и при работе с конститутивным промотором PGAP [7]. Одновременно с модификацией известных промоторов идет поиск новых промоторов, которые можно использовать для экспрессии гетерологичных генов [8—11]. На сегодняшний день
увеличение ассортимента промоторов, пригодных для биотехнологии, а также изучение их регуляции является актуальной задачей. Примерами промоторов, которые могут быть применены в биотехнологии, служат промоторы генов PpKAR2 и PpPDI1.
PpKAR2 — ген, который кодирует шаперон Kar2p/BiP эндоплазматического ретикулума (ЭР). Основная функция Kar2p — стабилизация несвернутых белков и поддержание их в растворимом состоянии, а также направление неправильно собранных полипептидных цепей в цитоплазму для мечения убиквитином с последующей деградацией в протеасоме [12]. Кроме того, Kar2p участвует в ответе клетки на несвернутый белок (UPR — unfolded protein response). В дрожжах S. cerevisiae, как и в клетках млекопитающих, синтез этого шаперона при тепловом шоке кратковременно повышается, хотя и при нормальных условиях он синтезируется на высоком базальном уровне [13]. В нормальных условиях белок Kar2p/BiP ассоциирован с N-концевым доменом трансмембранного белка Ire 1 p, C-концевой домен которого локализован в цитоплазме и обладает киназной и нуклеазной активностью [14]. При накоплении несвернутых белков в ЭР комплекс Kar2p — Ire1p диссоциирует, это вызывает полимеризацию Ire1p в мембране ЭР, трансфосфорилирование цитоплазматического C-кон-цевого домена Ire1p, что приводит к появлению эндори-бонуклеазной активности Ire 1 p. Активированный Ire 1 p катализирует удаление интрона мРНК HAC1 и инициирует синтез активатора транскрипции генов, промоторы которых содержат UPRE-последовательность, в первую очередь генов шаперонов и фолдаз (рис. 1). Стоит отметить, что в дрожжах P. pastoris несплайсированный вариант мРНК HAC1 не был обнаружен [14].
PpPDI1 — структурный ген протеиндисульфидизо-меразы (Pdi 1 p). Этот белок есть у микроорганизмов, растений и животных. Ген конститутивно экспрессиру-ется в большинстве тканей и органов, Pdi 1 p является
Unfolded protein
Неправильно свернутый белок
Folded protein
Правильно свернутый белок
(jj^ UPR target genes
I PPDU] | PDI1 |
Активированная Irel Неактивная Irel киназа и РНКаза киназа и РНКаза
Active Ire1 kinase Inctive Ire1 kinase and RNase and RNase
Рис. 1. Схема ответа клетки дрожжей S. cerevisiae на накопление несвернутого белка в эндоплазматическом ретикулуме [14, с изм.]
Fig. 1. Scheme of response of S. cerevisiae yeast cell to accumulation of non-folded protein in ER [14, with changes]
одним из основных белков в ЭР [15]. В его функции входит формирование, восстановление и изомеризация дисульфидных связей в синтезируемых белках. Кроме того, он выполняет функции шаперона [16].
При синтезе гетерологичных белков повышается уровень экспрессии как гена PpKAR2, так и гена PpPDIl [12]. С другой стороны, известно, что сверхэкспрессия этих генов может повышать продукцию гетерологичных белков [17, 18], в частности интерферонов [19].
Целью нашей работы было изучение промоторных областей генов PpKAR2 и PpPDIl и оценка возможности их использования для эффективной экспрессии гетерологичных генов. Активность промоторов мы оценивали при помощи репортерной системы на основе структурного гена кислой фосфатазы (КФ) дрожжей Saccharomyces cerevisiae — PHO5 [20]. Чтобы выяснить влияние сверхпродукции собственного и гетеро-логичного белка на активность изучаемых промоторов, мы применяли штаммы-продуценты белков PpPdi 1 p и дельтазеина кукурузы. Для оценки эффективности изучаемых промоторов для экспрессии гетерологичных генов мы проэкспрессировали под их контролем ген, кодирующий интерферон-альфа16 человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Плазмиды
Генетические конструкций создавали при помощи плазмид pPIC9, pPICZaA (Invitrogen) и плазмид, полученных ранее, — pPIC9-PHO5 [20] и pPIC9-IFNa16 [21], в которых структурные гены кислой фосфатазы PHO5 и интерферона-альфа16 человека HuIFNa16 находятся под контролем промотора PAOX1.
Штаммы
На этапе конструирования плазмид и их амплификации использовали штамм DH5a Escherichia coli (F'/endAl hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nalr) relAl D(lacZYA-argF) U169 deoR [f80dlacD(lacZ)Ml5]). Для получения дрожжевых штаммов нужного генотипа применяли штамм P. pastoris GS115 (his4) (Invitrogen) (his4 — мутация, приводящая к потребности в гисти-дине). Также использовали ранее полученные штаммы P. pastoris — GS-AOX1PHO5 [20], GS-AOX1PDI1 [19], в которых гены PHO5 и PpPDIl находятся под контролем промотора PAOX1.
Полимеразная цепная реакция
Для амплификации промоторов генов PpPDIl и PpKAR2 использовали следующие праймеры:
• прямой AatII-PpPDI 1 — 5'-TCAATAGACGTCAACACGAACACTGTAAATAG-3',
• обратный PpPDI 1-BamHI — 5'-AGTAGTGGATCCTCTTATAGATAGGAAGAAG-3'.
• прямой AatII-PpKAR2 — 5'-TTTAGAGACGTCAAGACTTGAGATGGACATG-3'.
• обратный PpKAR2-BamHI — 5'-CTATGTGGATCCTCTTGAGTGTTGGAATTG-3'.
В обоих случаях прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы AatII, а обратный праймер — для рестриктазы BamHI. Подчеркнуты сайты узнавания рест-риктаз. В качестве матрицы применяли хромосомную ДНК штамма GS115. Для амплификации гена дельтазеина кукурузы использовали прямой праймер F-BstI-dZein — 5'-CGGGATTCGAAACGATGGCAGCCAAGATG-3'. обратный праймер R-dZein-NotI — 5'-ATAATAGCGGCCGCGAATGCAGCACCAAC-3'. Прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы BstBI, а обратный праймер — для рестриктазы NotI. В качестве матрицы была выбрана кДНК, полученная из суммарной РНК кукурузы при помощи набора MMLV RT kit (Евроген). Суммарную РНК выделяли из листьев кукурузы сорта «Лакомка сахарная» реагентом для выделения суммарной РНК — ExtractRNA (Евроген). Применяли методики, рекомендованные производителем.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в приборе T100 ThermalCycler (BIO-RAD) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95 °C в течение 45 с, отжиг праймеров в течение 90 с при температуре 55 °C (для амплификации промотора PKAR2), 45 °C (для амплификации промотора PPDI1 и гена дельтазеина), полимеразная реакция при 72 °C в течение 120 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72 °C в течение 5 мин. Всего 35 циклов.
Выделение ДНК
Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов PlasmidMiniprep (Евроген) по методике, рекомендованной производителем. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей проводили по методике Smash & Grab [22].
Трансформация
Трансформацию дрожжей плазмидными векторами выполняли методом электропорации по описанной ранее методике [23]. Трансформацию бактерий проводили по стандартной методике [24].
Бактериальные штаммы культивировали в среде Лу-риа-Бертани [24]. Для отбора трансформантов, устойчивых к ампициллину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 50 мг/л, для отбора трансформантов, устойчивых к зеоцину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 25 мг/л. Штаммы E. coli выращивали при 37 °C.
Для отбора дрожжевых трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину, использовали среду, содержащую на 1 литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глюкозу — 10 г (среда YPD) и антибиотик 150 мг/л. Для отбора дрожжевых трансформантов, прототрофных по гистидину, использовали минимальную среду и 6,8 г/л смеси витаминов, микроэлементов и источника азота (Sigma). При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды.
Культивирование дрожжевых штаммов
При экспрессии гена HuIFNa16 под контролем изучаемых промоторов применяли жидкую среду YPD. Культивировали в течение 48 часов при 20 °C.
Для определения активности КФ клетки дрожжей с твердой среды ресуспендировали в стерильной воде и засевали в 50 мл среды, содержащей дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, метанол — 20 мл и 0,1 М калий-фосфатный буфер (pH 6,0) на литр. Культивирование продолжалось 96 часов при 20 °C, измерения выполняли каждые 24 часа. Эксперимент для определения активности КФ проводили в трех повторностях. Культивировали во всех случаях при 150 об/мин.
Определение активности кислой фосфатазы
Активность КФ определяли по ранее разработанной методике [25]. В качестве контрольной пробы использовали суспензию культуральной жидкости штамма GS115, выращенного в тех же условиях. Удельную активность определяли как отношение оптической плотности при 410 нм к плотности клеточной суспензии при 600 нм.
Идентификация гетерологичного белка
Анализ гетерологичных белков электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и гибридизацию с антителами осуществляли по методике, примененной нами ранее [26].
Пробы готовили концентрированием культуральной жидкости в 10 раз при помощи центрифужных ультрафильтров Amicon Ultra 0,5 mL (MerckMillipore). В качестве контроля на гель наносили культуральную жидкость штамма GS115, выращенного в тех же условиях.
Для идентификации белка интерферона-альфа16 человека использовали первичные кроличьи IgG по-ликлональные антитела PA5-54146 (Thermoscientific), в качестве вторичных антител — конъюгат видоспеци-фических антител к иммуноглобулинам кролика и пе-роксидазы хрена (Sigma, A-0545). Все антитела разводили в 1000 раз.
Биоинформатические методы
Открытые рамки считывания 5 области гена PpKAR2 для выбора промоторного участка определяли с помощью интернет-сервиса ExPASy Шведского института биоинформатики [27]. Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов производили с помощью базы данных транскрипционных факторов S. cerevisiae — Yeastract [28] и программного обеспечения Genomatix Software Suite [29]. Статистическую обработку данных выполняли с использованием программ Excel и GraphPadPrizm 6 [30]. Межгрупповые различия оценивали с помощью {/-критерия Манна — Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ 5" регуляторных областей генов PpPDIl и PpKAR2
Для клонирования промоторной области гена PpPDIl был взят участок в 254 нуклеотида между стартовым
кодоном структурного гена и терминирующим кодоном гена, лежащего в 5 области [16]. После анализа нук-леотидной последовательности 5 области гена PpKAR2 был выбран участок, состоящий из 311 нуклеотидов, между стартовым кодоном структурного гена PpKAR2 и последним триплетом ближайшей открытой рамки считывания. Последовательность промотора PPDI1: 5'-aacacgaacactgtaaatagaataaaagaaaacttggatagtagaacttcaatgt agtgtttctattgtcttacgcggctctttagattgcaatccccagaatggaatcgtccatc tttctcaacccactcaaagataatctaccagacatacctacgccctccatcCCAGCa ccacgtcgcgatcaCCCCIaaaacttcaataattgaacacgtactgatttccaaacct tcttcttcttcctatctataaga-3\ Последовательность промотора PKAR2: 5'-aagacttgagatggacatgataaacaattatagtgaaaatagaaacc ataatacaatattctaatagaggaaccgtttacctgtggttcctattgtggcctactgttact agctagtgtaatacacccttgcctcagctttgcaagtlGACAActcagccaaatgatc tttgaatgcgcgaaacctcaaggtccatcGAAttlICtcGAAttlICagtgttttcata CAGCGIgtcatcttctttcgcgtacttatttaaatcgtacccagatcccttcttcttcctta atttcaattccaacactcaaga-3\ Подчеркнуты последовательности сайтов связывания факторов транскрипции, отдельно выделен перекрывающийся сайт Xbplp.
Выбранные нуклеотидные последовательности были проанализированы на присутствие сайтов связывания факторов транскрипции. В промоторе гена PpPDI1 было выявлено 24, а в промоторе гена PpKAR2 — 43 потенциальных сайта связывания факторов транскрипции. Нас интересовали белки-регуляторы, которые участвуют в ответе клетки на несвернутые белки в ЭР и такие стрессорные факторы, как повышение температуры и концентрации активных форм кислорода, дефицит питательных веществ. Выбор этих белков-регуляторов был обусловлен тем, что изменения, происходящие в клетке при сверхпродукции гетерологичных белков и воздействии многих стрессорных факторов, похожи [31]. Как следует из табл. 1, промотор PKAR2 содер-
Таблица 1
Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в промоторах PPDI1 и PKAR2
Table 1
Potential binding sites for transcription factors in PPDI1 and PKAR2 promoters
Транскрипционный фактор / Transcription factors
Промотор / Promoter Название / Name Нуклеотидная последовательность / Nucleotide
sequence
PPDI1, PKAR2 Hac1p CCAGC
PKAR2 Xbp1p CTCGA
Yap1p TGACAA
Hot1p CATTTGGC
Hsf1p GAA/TTC повторы / repeats
PPDI1 Msn2p/Msn4p AGGGG
жит больше потенциальных сайтов связывания белков, участвующих в ответе клетки на стрессорные факторы, по сравнению с промотором PPDI1.
В обоих промоторах присутствуют сайты связывания транскрипционного фактора Haclp. Haclp регулирует ответ клетки на накопление несвернутого белка в ЭР и контролирует биогенез мембран (см. рис. 1) [14]. С промотором гена PKAR2 могут взаимодействовать также белки Hsflp, Xbplp, Yaplp и Hotlp. Hsflp — фактор транскрипции, который в виде тримера активирует в ответ на повышение температуры и другие стрессорные факторы экспрессию генов, промоторы которых содержат инвертированные повторы NGAAN, где N — любой нуклеотид. Активность Hsflp регулируется на посттрансляционном уровне за счет фосфорилирования [32]. В промоторе PKAR2 найдено несколько сайтов связывания белка Hsflp. Xbplp — транскрипционный репрес-сор, который активируется при повышении температуры, окислительном стрессе, дефиците глюкозы и взаимодействует с промоторами структурных генов Gl/S циклинов. Он является потенциальным субстратом протеинкиназы Cdc28p [33]. Yaplp необходим для обеспечения устойчивости к окислительному стрессу, также опосредует
устойчивость к кадмию. Он активирует транскрипцию генов, продукты которых влияют на окислительно-восстановительный гомеостаз клетки [34]. Hotlp — фактор транскрипции, обеспечивающий адаптацию клетки к высокому осмотическому давлению, необходим для индукции генов биосинтеза глицерина GPD1 и GPP2 [35].
В промоторе гена PPDI1 есть сайт связывания белков Msn2p/Msn4p. Msn2p/Msn4p при воздействии различных стрессорных факторов — температуры, активных форм кислорода и др. — экспортируются в ядро и активируют транскрипцию генов, промоторы которых содержат STRE (stress response element — элемент стрессового ответа) [36].
Клонирование промоторов генов PpPDI1 и PpKAR2, получение плазмид, содержащих гены PHO5 и HuIFNa16 под контролем данных промоторов
В качестве матрицы для амплификации выбранных промоторных областей генов PpPDI1 и PpKAR2 была использована хромосомная ДНК штамма GS115. Для создания плазмид, несущих ген PHO5 под контролем промоторов PPDI1 и PKAR2, использовали плазми-ду pPIC9-PHO5 (рис. 2, а). Вектор обрабатывали ре-стриктазами AatII и BamHI, чтобы удалить промотор
\\Дельтазеин\ |
Рис. 2. Схема получения плазмид Fig. 2. Plasmid construction
/ + Т4 DNA ligase
гена Л(0X1, а затем лигировали с последовательностями промоторов генов РрРйП и РрКШ2, которые были обработаны этими же рестриктазами. Подтверждение структуры полученных плазмид проводили при помощи ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования. Схема получения плазмид р9РКШ-РН05 и р9РР01-РИ05 представлена на рис. 2 (1, 2).
Для получения конструкций, в которых под контролем промоторов РРВ11 и РКАЯ2 находится структурный ген интерферона-альфа16 человека (HuIFNа16), плаз-миды р9РКШ-РН05 и р9РРВ1-РН05 обрабатывали рестриктазами БашИ1 и ЕсоШ и лигировали с фрагментом ДНК, содержащим сигнальную последовательность а-фактора дрожжей 5. сегеи1я1ае и ген Ни^а16, который был получен при обработке плазмиды рР1С9-IFNа16 теми же рестриктазами. Схема конструирования плазмид представлена на рис. 2 (4, 5).
Получение дрожжевых штаммов с репортерной системой на основе КФ 5. cerevisiae и штаммов-продуцентов дельтазеина кукурузы
Штаммы ОБ-РРОП-РИОб и 08-РКАН2-РИ05, в которых репортерный ген РН05 находится под контролем изучаемых промоторов, были получены трансформацией штамма 08115 соответственно плазмидами р9РКШ-РН05 и р9РРВ11-РН05. Плазмиды обрабатывали рестриктазой 81и1, таким образом, вставка в геном происходила в локус Н54, что обеспечивало появление функциональной копии гена Н1Б4 и прото-трофность штамма по гистидину.
Для оценки влияния сверхпродукции гетерологичного белка на активность промоторов РРВ11 и РКАЯ2 использовали дельтазеин кукурузы. Для получения плазмиды, в которой под контролем промотора PA0X1 находится ген
дельтазеина кукурузы, плазмиду рР1^аА обрабатывали рестриктазами Б81Б1 и ЫоИ и лигировали с фрагментом дель-тазеина кукурузы, обработанным теми же рестриктазами. Схема получения плазмиды представлена на рис. 2 (5, 6). Штаммы 08-РР011-РИ05 и 08-РКАН2-РИ05 трансформировали плазмидой рР1&аЮ1£т. Плазмиду предварительно обрабатывали рестриктазой 8ас1, сайт расщепления которой находится в 5' области промотора PA0X1. Интеграция в геном происходила в промоторную область гена A0X1 без нарушения его функции. Таким образом получили штаммы 08-РР0П-РИ05/РА0Х1^ет и 08-PKAR2-PH05/PA0X1-Dzein, в которых репортерный ген РН05 находится под контролем соответственно промоторов РКАЯ2 и РРЭ11, а структурный ген гетерологичного белка — под контролем промотора РАСЖ1.
Для оценки влияния сверхпродукции собственного белка на активность промотора РКАЯ2 штамм 08-PA0X1-PDI1 [19], в котором под контролем промотора PA0X1 находится ген РрРБП, был трансформирован плазмидой р9РКШ2-РН05. Плазмида была обработана рестриктазой 81;и1, таким образом, встраивание происходило в локус Н54. В результате был получен штамм 08-РКАН2-РИ05/РА0Х1^11, в котором ген РН05 находится под контролем промотора PKAR2, а структурный ген белка РШ1р — под контролем промотора PA0X1.
Оценка активности промоторов РРЭП и РКАЯ2
Активность изучаемых промоторов оценивали по активности КФ, которую измеряли в суспензии клеток. При выращивании дрожжей в качестве единственного источника углерода мы использовали метанол, чтобы обеспечить сверхэкспрессию генов, находящихся под контролем промотора PA0X1. Полученные значения активности КФ представлены на рис. 3.
II
§ &
m <п Ь $
I
тз
□ GS-PPDI1-PHO5 П GS-PPDI1-PHO5/PAOX1-Dzein
I GS-PKAR2-PHO5/PAOX1-PDI1
4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,.. 0,50 0,00
GS-PKAR2-PHO5 Н GS-PKAR2-PHO5/PAOX1-Dzein П PAOX1-PHO5
1 2 3
Время культивирования, сут / Time of cultivation, day
Рис. 3. Активность промоторов PKAR2 и PPDIl в сравнении с активностью промотора PAOXl в исходном штамме и в штаммах со сверхпродукцией собственного и гетерологичного белков. Данные представлены со стандартной ошибкой среднего Fig. 3. The activity of promoters PKAR2 and PPDIl in comparison with the activity of the PAOXl promoter in the original strain and in strains with overproduction of native and heterologous proteins. The data are presented with a standard error of the mean
56 методология экологической генетики
Вес / Weight
кДа / kDa м к-i oi к-2 02
'if 55 m 43 34 26
17 '.vlji ^
Рис. 4. Иммуноблотинг белков культуральных сред штаммов дрожжей, содержащих ген HuIFNa16 человека под контролем изучаемых промоторов. Культуральные жидкости штаммов: [O1] — GS-PPDI1-IFNa16 и [O2] — GS-PKAR2-IFNa16. М — маркер, [K-1], [K-2] — куль-туральная жидкость штамма GS115 Fig. 4. Western-blot analysis of proteins from culture fluids of yeast strains containing human HuIFNa16 gene under the control of promoters under study. Description: Culture fluids of strains: [O1] - GS-PPDI1 -IFNa16 and [O2] - GS-PKAR2-IFNa16. M - protein marker, [K-1], [K-2] — a culture fluid of the strain GS115
Из графиков видно, что активность изучаемых промоторов заметно ниже, чем у PAOX1, особенно со вторых суток культивирования. В то же время при сверхэкспрессии гетерологичного гена активность промоторов PKAR2 и PPDI1 увеличивается.
Использование промоторов PPDI1 и PKAR2 для экспрессии гетерологичного гена HuIFNa16
Для проверки эффективности экспрессии гетеро-логичного гена под контролем изучаемых промоторов исходный штамм GS115 был трансформирован плазмидами p9PKAR2-IFNa16 и p9PPDI1-IFNa16 соответственно, в которых под контролем изучаемых промоторов находится структурный ген интерферона-альфа16 человека. Обозначения полученных штаммов — GS-PKAR2-IFNa16 и GS-PPDI1-IFNa16. Ранее ген HuIFNa16 человека был клонирован под контролем промотора гена AOX1 [21].
Наличие в штаммах-трансформантах нужных генетических конструкций и ориентацию встройки определяли при помощи ПЦР. Наличие гетерологичного белка в культуральной жидкости оценивали при помощи ИФА с антителами к интерферону-альфа16. В качестве контроля использовали культуральную жидкость исходного штамма GS115, выращенного в тех же условиях.
Как следует из результатов (рис. 4), в культуральной жидкости штаммов-продуцентов присутствует интерфе-рон-альфа16 человека.
ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ промоторов PKAR2 и PPDI1
В промоторах PKAR2 и PPDI1, как мы и предполагали, представлены потенциальные сайты связывания факторов транскрипции, которые регулируют ответ
клетки дрожжей на различные стрессорные факторы, в том числе тепловой и окислительный шок и накопление несвернутого белка в ЭР. Исходя из анализа последовательностей изучаемых промоторов, можно заключить, что у дрожжей Р. раяШЬБ, как и у дрожжей 5. сегеюШае, белок Нас1р — центральный участник иРР — взаимодействует с промоторами РРБ11 и РКАЯ2 (см. рис. 1). Но, как было уже отмечено ранее, у дрожжей Р. раяШЬБ в нормальных условиях не был найден несплайсированный вариант мРНК НАС1, что позволяет говорить об отличии механизмов иРР у разных видов дрожжей и, возможно, постоянной активности всех белков — участников иРР у Р. раБ^т [14]. Более детальное исследование состояния клетки дрожжей Р. раяШЬБ в условиях сверхпродукции гетерологичного белка, в том числе проверка наличия или отсутствия несплайсированного варианта мРНК НАС1, позволит дать ответ на этот вопрос. Существуют данные, подтверждающие тесную связь изменений, которые происходят в клетке при окислительном стрессе и нарушениях процесса секреции белка [37]. Дрожжи Р. раБ^т являются облигатными аэробами, в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются активные формы кислорода и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от окислительного стресса. В связи с этим можно предположить большую готовность клетки метилотрофных дрожжей к воздействию различных стрессорных факторов, в том числе синтезу гетерологичных белков. Широкий спектр гетерологичных генов, успешно экспрессированных в Р. раяШЬБ, и высокая продуктивность штаммов-продуцентов это косвенно подтверждают.
Сравнение активности промоторов PKAR2, PPDI1 и PAOX1 в исходных штаммах
Как следует из результатов (см. рис. 3), максимальную активность промоторы РРВ11 и РКАЯ2 исходных штаммов демонстрировали на первые сутки культивирования. Активность промотора РРВ11 составляла 64 % от РКАЯ2, а активность промотора РКАЯ.2 значимо не отличалась от активности промотора РАОХ1 (р = 0,667) и составила 1,51 у. е.
Активность промоторов РРВ11 и РКАЯ2 в течение культивирования снижалась и на третьи сутки составляла 5 % (РРБН) и 9 % (РКАЯ2) активности промотора РАОХ1 с сохранением значимой разницы между собой (р = 0,026), в то время как активность РАОХ1 повышалась. Увеличение активности РАОХ1 можно объяснить тем, что клетке нужно время для адаптации к катаболизму метанола. Одной из причин снижения активности РРВ11 и РКАЯ2 могут быть изменения метаболизма штаммов-продуцентов, ранее обнаруженные у дрожжей 5. сегею1Б1ае в стационарной фазе роста и сопровождающиеся замедлением скорости процессов транскрипции и трансляции [38].
Учитывая функции белков РШр1, Каг2р, Аох1р в клетке и роль последнего в метаболизме метанола, промоторы РРВ11 и РК^Я2 не могут конкурировать с таким сильным промотором, как PA0X1. Известно, что при росте на средах, содержащих метанол в качестве единственного источника углерода, в клетке Р. ра$1ош количество Аох1р может достигать 30 % от суммарного клеточного белка, а количество полиА-мРНК PpA0X1 может составлять до 5 % пула мРНК [39].
Сравнение активности промоторов РКАД2, РРЭ11 и РАОХ1 в условиях сверхэкспрессии гетерологичного и собственного генов
Данные (см. рис. 3) говорят о том, что при сверхсинтезе гетерологичного белка дельтазеина кукурузы, структурный ген которого клонирован под контролем РАОХ1, оба промотора демонстрируют рост активности. Максимальный прирост активности по сравнению с исходным штаммом (без сверхэкспрессии генов) составил 436 % (РРВ11) и 331 % (РКМ.2) на третьи сутки культивирования. Активность промотора РРВ11 повышалась в большей степени относительно исходного штамма, на вторые сутки культивирования она составляла 28 % активности промотора PA0X1 и сохранялась на одном уровне на протяжении всего времени культивирования. Максимальная активность у промотора PKAR2 была зарегистрирована также на вторые сутки и составляла 51 % от активности PA0X1.
Повышение активности обоих исследуемых промоторов в условиях синтеза гетерологичного белка может свидетельствовать, что экспрессия генов РрРВН и PpKAR2 увеличивается в ответ на воздействие этого стрессорного фактора. Промотор PKAR2 в абсолютных величинах реагирует сильнее, вероятно, потому, что Каг2р является шапероном и играет основную роль в поддержании нормальной конформации как собственных, так и гетерологичных белков в ЭР. А белок РШ1р участвует в формировании третичной структуры только белков, содержащих дисульфидные связи. Очевидно, различные стрессорные факторы могут затруднять нормальное сворачивание белков, что будет увеличивать время существования комплексов белок — шаперон и уменьшать пул свободных молекул шаперона. Это потребует увеличения количества Каг2р и, соответственно, усиления экспрессии гена PpKAR2. Не случайно промотор гена PpKAR2 имеет большее количество сайтов связывания транскрипционных факторов, контролирующих ответ клетки на различные стрессорные воздействия, по сравнению с промотором гена РРВ11.
При сверхпродукции собственного белка Р. рав-1от — РШ1р — активность промотора PKAR2 также увеличивалась, но в меньшей степени. Максимальный прирост активности (80 %) был зафиксирован на вторые сутки культивирования. Это может свидетельствовать в пользу нашего предположения о том, что для сворачивания собственных белков требуется меньше
времени, быстрее происходит освобождение Kar2p из комплекса шаперон — белок, поэтому не требуется значительного увеличения количества шаперона.
Экспрессия гена модельного гетерологичного белка
В предварительных экспериментах мы показали возможность использования промоторов PPDI1 и PKAR2 для экспрессии гена HuIFNa16. Продемонстрированное нами повышение активности промоторов генов PpPDIl и PpKAR2 у штаммов-продуцентов гетерологичного белка дает основание предполагать, что эти промоторы могут быть востребованы в биотехнологии.
Использование для экспрессии гетерологичных генов промоторов, которые повышают свою активность в ответ на синтез гетерологичного белка, может повысить продуктивность всего процесса за счет положительной обратной связи между накоплением гетерологичного белка в ЭР и активностью примененного промотора (рис. 5).
Увеличение активности и экспрессии Increased activity and expression
Промотор шаперона Chaperon promotor
Гетерологичный ген Heterologous gene
Опосредованная активация Увеличение продукции ,, , , , , , Production increase
Ма/Чюта/Ч пмпклгтп
Рис. 5. Схема возможного эффекта от применения промоторов шаперонов для продукции гетерологичных белков
Fig. 5. Scheme of possible effect from the use of chaperone promoters for the production of heterologous proteins
ЛИТЕРАТУРА
1. Schwarzhans JP, Luttermann T, Geier M, et al. Towards systems metabolic engineering in Pichia pastoris. Biotechnol Adv. 2017;35(6):681-710. doi: 10.1016/j. biotechadv.2017.07.009.
2. Pichia.com [Internet]. Pichia Technology from RCT. Pichia Produced Products on the Market [cited 2018 Apr 19]. Available from: www.pichia.com/science-cen-ter/commercialized-products/.
3. Zahrl RJ, Pena DA, Mattanovich D, Gasser B. Systems biotechnology for protein production in Pichia pastoris. FEMS Yeast Res. 2017; 17(7). doi: 10.1093/ femsyr/fox068.
4. Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98( 12):5301-5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5.
5. Patent USA No US008236528B2/ 2012.
6. Wang J, Wang X, Shi L, et al. Methanol-Independent Protein Expression by AOX1 Promoter with trans-Acting Elements Engineering and Glucose-Glycerol-Shift Induction in Pichia pastoris. Sci Rep. 2017;7:41850. doi: 10.1038/srep41850.
7. Ata O, Prielhofer R, Gasser B, et al. Transcriptional engineering of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter for improved heterologous protein production in Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng. 2017;1 14( 10):2319-2327. doi: 10.1002/ bit.26363.
8. Stadlmayr G, Mecklenbrauker A, Rothmuller M, et al. Identification and characterisation of novel Pichia pastoris promoters for heterologous protein production. J Biotechnol. 2010; 150(4):519-529. doi: 10.1016/j. jbiotec.2010.09.957.
9. Prielhofer R, Maurer M, Klein J, et al. Induction without methanol: novel regulated promoters enable highlevel expression in Pichia pastoris. Microb Cell Fact. 2013;12:5. doi: 10.1186/1475-2859-12-5.
10. Vogl T, Glieder A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. N Biotechnol. 2013;30(4):385-404. doi: 10.1016/j. nbt.2012.11.010.
11.Landes N, Gasser B, Vorauer-Uhl K, et al. The vitamin-sensitive promoter PTHI11 enables pre-defined autonomous induction of recombinant protein production in Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng. 2016;113(12):2633-2643. doi: 10.1002/bit.26041.
12. Gasser B, Saloheimo M, Rinas U, et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb Cell Fact. 2008;7:11. doi: 10.1186/14752859-7-11.
13. Kohno K, Normington K, Sambrook J, et al. The promoter region of the yeast KAR2 (BiP) gene contains a regulatory domain that responds to the presence of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Mol Cell Biol. 1993; 13(2):877-890. doi: 10.1128/ MCB.13.2.877.
14. Guerfal M, Ryckaert S, Jacobs PP, et al. The HAC1 gene from Pichia pastoris: characterization and effect of its overexpression on the production of secreted, surface displayed and membrane proteins. Microb Cell Fact. 2010;9:49. doi: 10.1186/1475-2859-9-49.
15. Wilkinson B, Gilbert HF. Protein disulfide isomer-ase. Biochim Biophys Acta. 2004;1699(1-2):35-44. doi: 10.1016/j.bbapap.2004.02.017.
16. Warsame A, Vad R, Kristensen T, Oyen TB. Characterization of a gene encoding a Pichia pastoris protein disulfide isomerase. Biochem Biophys Res Commun. 2001 ;281(5): 1176-1182. doi: 10.1006/ bbrc.2001.4479.
17. Guan B, Chen F, Su S, et al. Effects of co-overex-pression of secretion helper factors on the secretion of
a HSA fusion protein (IL2-HSA) in Pichia pastoris. Yeast. 2016. doi: 10.1002/yea.3183.
18.Sun H, Bankefa OE, Ijeoma IO, et al. Systematic assessment of Pichia pastoris system for optimized beta -galactosidase production. Synth Syst Biotechnol. 2017;2(2):113-120. doi: 10.1016/j.syn-bio.2017.04.001.
19.Цыганков М.А., Падкина М.В. Влияние сверхэкспрессии гена PDI на продукцию гетерологичных белков в дрожжах Pichia pastoris // Экологическая генетика. - 2017. - Т. 15. - № 2. - С. 21-30. [Tsygankov MA, Padkina MV. Influence of PDI gene overexpression on heterological proteins production in yeast Pichia pastoris. Ekol Genet. 2017; 15(2):21-30. (In Russ.)]. doi: 10.17816/ecogen15221-30.
20. Савинов В.А., Румянцев А.М., Самбук Е.В., Падкина М.В. Создание тест-системы для изучения генетического контроля регуляции гена AOX1 дрожжей Pichia pastoris // Вестник СпбГУ. Серия 3. Биология. -2009. - № 4. - С. 114-119. [Savinov VA, Rumy-antsev AM, Sambuk EV, Padkina MV. Constructing a test-system for researching genetic control of alco-holoxidase 1 gene regulation in yeast Pichia pastoris. Vestnik Sankt-Peterburgskogo universiteta. Seriia 3, Biologiia. 2009;(4):114-119. (In Russ.)]
21.Патент РФ на изобретение №2380405/ 29.11.2007. Падкина М.В., Доброгорская М.В., Карабельский А.В, и др. Способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. [Patent RUS No 2380405/ 29.11.2007. Padkina MV, Dobrogorskaya MV, Karabel'skiy AV, et al. Sposob polucheniya rekombinantnogo al'fa 16-inter-ferona cheloveka i farmatsevticheskaya kompozitsiya dlya lecheniya virusnykh zabolevaniy na osnove rekombinantnogo al'fa 16-interferona cheloveka. (In Russ.)]
22. Web.mit.edu [Internet]. "Smash and Grab" Yeast Genomic PrepМетодика выделения ДНК, "Smash and Grab" [cited 04.04.18]. Available from: http://web.mit. edu/biology/guarente/protocols/quickprep.html.
23. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. Biotechniques. 2004;36(1):152-154. doi: 10.2144/04361DD02.
24. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984. [Maniatis T, Fritch E, Sambrook J, Molecular Cloning: A laboratory manual. Moscow: Mir; 1984. (In Russ.)]
25. Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г., Петрашень М.Г., и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фос-фатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Характеристика кислых фосфатаз разных штаммов // Генетика. - 1974. - Т. 10. - № 11. - С. 100-111.
[Padkina MV, Krasnopevtseva NG, Petrashen' MG, et al. Genetiko-biokhimicheskoe izuchenie kislykh fos-fataz drozhzhey Saccharomyces cerevisiae. Kharakte-ristika kislykh fosfataz raznykh shtammov. Genetika. 1974;10(11):100-111. (In Russ.)]
26. Падкина М.В., Парфёнова Л.В., Градобоева А.Е., Самбук Е.В. Синтез гетерологичных интерферонов в клетках дрожжей Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. — 2010. — Т. 46. — № 4. - С. 448-455. [Padkina MV, Parfenova LV, Gradoboeva AE, Sambuk EV. Heterologous interferons synthesis in yeast Pichia pastoris. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2010:46(4):448-455. (In Russ.)]
27. Expasy.org [Internet]. SIB (Swiss Institute of Bioinfor-matic) Bioinformatics Resource Portal [cited 2018 Apr 19]. Available from: https://www.expasy.org/.
28. Yeastract.com [Internet]. Yeast Search for Transcriptional Regulators And Consensus Tracking [cited 2018 Apr 19]. Available from: http://www.yeastract.com/.
29. Genomatix.de [Internet]. Genomatix Software Suite -Scientific Analysis of genomic data [cited 2018 Apr 19]. Available from: http://www.genomatix.de/.
30. Graphpad.com [Internet]. GraphPad Prism software [cited 2018 Apr 19]. Available from https://www. graphpad.com/.
31. Jurgen B, Lin HY, Riemschneider S, et al. Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations. Biotechnol Bioeng. 2000;70(2):217-224. doi: 10.1002/1097-0290(20001020)70:2<217::AID-BIT11>3.0.CÜ;2-W
32. Eastmond DL, Nelson HC. Genome-wide analysis reveals new roles for the activation domains of the Sac-
charomyces cerevisiae heat shock transcription factor (Hsfl) during the transient heat shock response. J Biol Chem. 2006;281(43):32909-32921. doi: 10.1074/jbc. M602454200.
33. Mai B, Breeden L. Xbpl, a stress-induced transcriptional repressor of the Saccharomyces cerevisiae Swi4/ Mbpl family. Mol Cell Biol. 1997;17(11):6491-6501. doi: 10.1128/MCB.17.11.6491.
34. Rodrigues-Pousada C, Menezes RA, Pimentel C. The Yap family and its role in stress response. Yeast. 2010;27(5):245-258. doi: 10.1002/yea.1752.
35. Alepuz PM, de Nadal E, Zapater M, et al. Osmostress-induced transcription by Hot1 depends on a Hog1-mediated recruitment of the RNA Pol II. EMBO J. 2003;22(10):2433-2442. doi: 10.1093/emboj/cdg243.
36. Garreau H, Hasan RN, Renault G, et al. Hyper-phosphorylation of Msn2p and Msn4p in response to heat shock and the diauxic shift is inhibited by cAMP in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 2000;146(Pt 9):2113-2120. doi: 10.1099/00221287146-9-2113.
37. Tyo KE, Liu Z, Petranovic D, Nielsen J. Imbalance of heterologous protein folding and disulfide bond formation rates yields runaway oxidative stress. BMC Biol. 2012;10:16. doi: 10.1186/1741-7007-10-16.
38. Werner-Washburne M, Braun E, Johnston GC, Singer RA. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 1993;57(2):383-401.
39. Lin-Cereghino GP, Godfrey L, de la Cruz BJ, et al. Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 2006;26(3):883-897. doi: 10.1128/ MCB.26.3.883-897.2006.
•Ш Информация об авторах
Михаил Александрович Цыганков — инженер-исследователь, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: mial.tsygankov@ yandex.ru.
Марина Владимировна Падкина — профессор, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: mpadkina@mail.ru.
•à Information about the authors
Mikhail A. Tsygankov — Engeneer-Researcher, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of Biochemical Genetics. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: mial.tsygankov@yandex.ru.
Marina V. Padkina — Professor, Faculty of Biology, Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of Biochemical Genetics. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: mpadkina@mail.ru.
