Низкоиммуногенный синтетический матрикс трахеи, заселенный мезенхимальными мультипотентными клетками Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.017.1.084

Киселевский М.В.1, Анисимова Н.Ю.1, Корнюшненков Е.А.1, Шепелев А.Д.2, Тенчурин Т.Х.2, Мамагулашвили В.Г.2, Григорьев Т.Е.2, Лебединская О.В.3, Чвалун С.Н.2, Караулов А.В.4

НИЗКОИММУНОГЕННЫЙ СИНТЕТИЧЕСКИЙ МАТРИКС ТРАХЕИ, ЗАСЕЛЕННЫЙ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ

1Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина», 115478 г Москва; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123098, Москва; 3Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера, Петропавловская ул., Пермь, Россия; "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119991, Москва, Россия

Синтетические матриксы трахеи, заселенные мезенхимальными стромальными (стволовыми) клетками, имплантировали ортотопически собакам породы бигль. У животных определяли содержание и иммунофенотип лейкоцитов до и после имплантации. Через 2 мес биоимплантаты извлекали и оценивали их морфологические и иммуноморфологические характеристики. У животных не отмечено увеличения содержания лейкоцитов в крови после имплантации. В имплантате определяли незначительное количество Т-лимфоцитов (CD3-положительные клетки), единичное CD19+ (клетки плазматического ряда), CD68+ (макрофаги) и очень небольшое количество пролиферирующих клеток (Ki67+). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии признаков иммунологического отторжения и позволяют сделать заключение о низкой иммуногенности имплантата.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки; биоимплантаты; иммунофенотип; собаки бигль. Для цитирования: Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю., Корнюшненков Е.А., Шепелев А.Д., Тенчурин Т.Х., Мамагулашвили В.Г., Григорьев Т.Е., Лебединская О.В., Чвалун С.Н., Караулов А.В. Низкоиммуногенный синтетический матрикс трахеи, заселенный мезенхимальными мультипотентными клетками. Иммунология. 2016; 37 (4): 194-198. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-4-194-198

Kiselevskiy M.V.1, Anisimova N.Yu.1, Kornyushenkov E.A., Shepelev A.D., Tenchurin T.H.2, Mamagulashvili V.G.2, Grigor'ev T.E.2, Lebedinskaya O.V.3, Chvalun S.N. 2, Karaulov A.V.

NONIMMUNOGENIC SYNTHETIC MATRIX TRACHEA POPULATED MESENCHYMAL MULTIPOTENT CELLS

'Federal State Budget Scientific Institution "Russian N.N. Blokhin Cancer Research Center", 115478 Moscow, Russian Federation; 2National Research Center "Kurchatov Institute", 123098, Moscow; 3Academician E.A. Wagner Perm State Medical University, Perm, Russian Federation; 4I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, 199911, Moscow Synthetic matrices trachea before implantation experimental beagle dogs, populated mesenchymal stem cells, which subsequently implanted orthotopically. After 2 month. bioimplantats removed and evaluated their morphological characteristics. It has been shown that no sings of the blood leukocytes increasing after implantation. In implant was determined small number of T-lymphocytes (CD3-positive cells) are rare CD19+ (number of plasmatic cells), CD68+ (macrophage) and a very small amount of cell proliferating (Ki67+). The results show no signs of immunological rejection, that testifies to low immunogenicity of the tracheal implants.

Keywords: mesenchymal stem cells; bioimplantats; immunophenotype; beagle dogs.

For citation: Kiselevskiy M.V., Anisimova N.Yu., Kornyushenkov E.A., Shepelev A.D., Tenchurin T.H., Mamagulashvili V.G., Grigor 'ev T.E., Lebedinskaya O.V., Chvalun S.N., Karaulov A.V. Nonimmunogenic synthetic matrix trachea populated mesenchymal multipotent cells. Immunologiya. 2016; 37 (4): 194-198. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-4-194-198

For correspondence: Kiselevskiy Mikhail Valentinovich, Dr. med. Sci., Prof., head. lab., E-mail: kisele@inbox.ru

conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Funding. The work is executed at financial support of the Ministry of education and science of the Russian Federation (agreementNo. 14.604.21.0023from 17.06.2014 G. grant, a unique identifier of applied research RFMEFI60414X0023 unique identifier).

Received 07.01.16 Accepted 18.02.16

введение

Для корреспонденции: Киселевский Михаил Валентинович, Трахея - Один Ю Ш^ОГЖ Орташв, Шртсадаа Ю-

д-р мед. наук, проф., зав. лаб., E-mail: kisele@inbox.ru торых вызывает значительные трудности. Несмотря

на многочисленные попытки использовать в качестве протезов ауто- и аллотрансплантаты, проблема остается нерешенной из-за развивающихся процессов отторжения имплантатов. В последние годы для замещения сегментарных дефектов трахеи применяют различные синтетические материалы, которые были протестированы в экспериментальных исследованиях на животных. Используемые для создания синтетических протезов трахеи материалы должны отличаться низкой иммуногенностью, а их структура препятствовать проникновению микроорганизмов из внешней среды в средостенье, поскольку латентная воспалительная реакция в области имплантата может инициировать хроническое отторжение протеза трахеи [1].

В патогенезе отторжения трансплантатов важную роль играют эффекторы врожденного иммунитета, в частности натуральные нейтрофилы. Хорошо известно, что, помимо их физиологических функций, активированные нейтрофилы способны вызвать повреждение ткани. Это объясняется их способностью генерировать активные формы кислорода и высвобождать токсичные протеазы. Активация нейтрофилов происходит также во время острого отторжения в ответ на секрецию лим-фокинов и рассматривается как один из важнейших механизм повреждения трансплантата [2, 3]. Наряду с эффекторами врожденного иммунитета в процессе отторжения трансплантатов важную роль играют Т- и В-лимфоциты, инфильтрирующие имплантаты. Недостаточная васкуляризация графтов, воспалительные реакции индуцируют также активацию эндотелиальных клеток сосудов и высвобождение хемоаттрактантов. При этом рекрутирование ранее в область импланта-та нейтрофилов способствует инициации Т-клеточной реакции и отторжения [4, 5].

Современные полимерные материалы, уже зарекомендовавшие себя в клинической практике в качестве протезов сосудов и тканей, могут стать альтернативой донорской трахее [6, 7]. Пористые полимерные матриксы используют для получения биоинженерных протезов трахеи путем колонизации клетками-предшественниками реципиента, потенциально низ-коиммуногенны и не требуют проведения длительной иммуносупрессивной терапии [8-10].

Цель исследования - изучение системных и местных иммунологических реакций на заселенный ме-зенхимальными мультипотентными клетками реципиента новый синтетический ультраволокнистый матрикс трахеи после ортотопической имплантации его экспериментальным животным.

Материал и методы

Синтетические матриксы трахеи для исследований на собаках были изготовлены из нетканого материала на основе фторопласта методом электроспининга на опытной однокапиллярной установке для электро-спининга. Полукольца, армирующие нетканый полимерный материал, получали методом термопрессования, в качестве исходного материала использовали полиуретан [10].

Исследования проведены на 4 собаках породы

ORIGINAL ARTICLE

бигль, содержащихся в условиях вивария и отделения экспериментальной терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Все манипуляции с лабораторными животными выполнены по правилам, указанным в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенным в „Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (ЕЭС, Страсбург, 1985, 1986); руководствуясь требованиями Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000).

Матриксы трахеи заселяли мезенхимальными мультипотентными (стволовыми) клетками (МСК), выделенными из костного мозга собак-реципиентов. Полученные биоинженерные конструкции имплантировали в сформированный циркулярный дефект трахеи животных. Через 2 мес биоимпланты извлекали для исследования морфологических характеристик в сравнении с синтетическими матриксами трахеи. У экспериментальных животных восстанавливали целостность трахеи посредством формирования первичного анастомоза по типу конец в конец.

МСК генерировали из клеток костного мозга, полученного в результате стернальной пункции. Клетки костного мозга помещали в культуральные стерильные флаконы с питательной средой RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональную фетальную сыворотку. Проводили 2 пассажа, удаляя неадгезивные клетки. Морфологические характеристики МСК выявляли с использованием инвертоскопа Axiovert (Zeiss, Германия) в просвечивающем или фазово-контрастном режиме. Анализ иммуно-фенотипа клеток 2-го пассажа определяли с применением моноклональных антител к антигенам CD45, CD90, cD105 методом проточной цитометрии на цитофлуори-метре BD Canto II (Becton Dickinson, США).

Для изучения иммунофенотипа клеток крови собак использовали антитела anti dog к CD45, CD66, CDU^ конъюгированные с флуорохромами (Bioscience). Для проведения исследования эритроциты после инкубации крови с антителами лизировали реагентом - раствором OptiLyse (Immunotech, Франция), затем клетки отмывали фосфатно-солевым буфером. Фенотип лейкоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитоф-луориметре BD canto II (Becton Dickinson, США).

Статистический анализ проводили, подсчитывая величину среднего значения и стандартного отклонения (%±SD) после учета 10 000 событий. Результаты выражали в виде доли флуоресцирующих клеток в процентах от общего числа клеток. Анализ результатов проводили в программе FACSDiva 6.1.3.

Для иммуногистохимических исследований использовали маркеры CD3, CD4, CD8, CD19, CD34, CD56, CD68, Ki67, pi53 с применением биотин-стриптовидинового метода. Препараты просматривали и фотографировали с использованием светового микроскопа Axioplan 2 (Zeiss, Германия).

Клинический анализ крови собак-реципиентов в рамках данного исследования проводили с использованием анализатора ProCyte Dx, специально откали-брованного для исследования крови собак.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 1

содержание лейкоцитов в периферической крови собак до и после имплантации матрикса трахеи (M±m)

Показатель До операции После операции Размах нормативных показателей

1 нед 1 мес 2 мес

Лейкоциты, 109/л 10,2±2 11±3 14,7±5 10,2±4 8-18

Нейтрофилы, % 77±11 81±12 81±14 78±9 52-90

Лимфоциты, % 29±4 27±5 24±3 25±5 12-34

Моноциты, % 3±1 2±1 1±0,2 2±1 1-3

Эозинофилы, % 3±1 4±1 3±1 4±1 1-4

Базофилы, % 0 0 1±0,1 1±0,2 0-1

Для определения степени значимости выявленных изменений проанализировали множество связанных индивидуализированных выборок с использованием модуля "Непараметрическая статистика" программы Statistica 6.0, StatSoft.

результаты и обсуждение

Стерильные матриксы перед имплантацией животным колонизировали ex vivo МСК собак-реципиентов, полученные из взвеси клеток костного мозга посредством культивирования в питательных средах. Целевые клетки были представлены преимущественно фибро-бластоподобными крупными клетками полигональной или веретеновидной формы с длинными отростками,

Рис. 1. Содержание CD66b+-^eTOK среди CD45+-^eTOK в крови собак до и после имплантации биоинженерного протеза. а - до имплантации; б - через 1 нед после имплантации; в - через 1 мес после имплантации; г - через 2 мес после имплантации.

контактирующими между собой, со светлыми ядрами, содержащими несколько ядрышек. Анализ иммунофе-нотипа клеток 2-го пассажа позволил установить, что субпопуляция CD45-CD90+CD105+-клеток составляла

Таблица 2

содержание лейкоцитов CD45+ CD66b+ в периферической крови собак до и после имплантации матрикса трахеи

Статистический параметр Время после операции

до операции 1 нед 4 нед 8 нед

CD66b MFI CD66b, % CD66b MFI CD66b % CD66b, MFI CD66b, % CD66b, MFI CD66b, %

X 887 57 557 63 1002 71 887 61

Min. 0 54 57 61 41 62 34 0

Max. 1002 62 987 69 1010 78 995 68

р* - - 0,236 0,172 0,228 0,089 0,490 0,63

Рис. 2. Определение субпопуляций CD11c- (Q1-2) и CD11c+ CD66b+-лейкоцитов (Q2-2) в крови.

а - через 30 сут; б - через 1 мес; в - через 2 мес после ортотопической трансплантации матрикса трахеи. Размерность осей - интенсивность флуоресценции в условных единицах.

ORIGINAL ARTICLE

не менее 65%. Полученные таким образом биоинженерные конструкции имплантировали собакам орто-топически в сформированный дефект трахеи.

Анализ содержания лейкоцитов периферической крови собак после имплантации позволил установить, что рассматриваемые гематологические параметры у животных-реципиентов колебались в пределах физиологической нормы (табл. 1). В частности, у собак не наблюдали лейкоцитоза, моно- или нейтрофи-леза, что можно рассматривать как один из показателей отсутствия признаков развития системной реакции отторжения.

Оценивали также до и после

Рис. 3. Колонизация нетканого матрикса трахеи клетками реципиента и сформированными ортотопической имплантации ма-коллагеновыми волокнами. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400. триксов содержание в крови собак

Рис. 4. Результаты иммуногистохимического исследования биоинженерных конструкций трахеи после трансплантации с использование маркеров.

а - CD3; б - CD68; в - CD19; г - К 67.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

популяции нейтрофилов CD45+CD66+, вовлеченных в реализацию развития системного каскада воспаления и отторжения (рис. 1). Данные статистического анализа приведены в табл. 2.

Проведенный статистический анализ указывает на отсутствие достоверного увеличения содержания нейтрофилов CD45+CD66b+ в системном кровотоке собак в течение всего периода наблюдения (р > 0,05). Это свидетельствует об отсутствии явления системного нейтрофилеза, сопровождающего развитие системной реакции отторжения трансплантата после ортотопиче-ской трансплантации собакам экспериментальных образцов матрикса трахеи на основе ультраволокнистого фторопласта. Вместе с тем следует отметить увеличение в течение 1 мес после имплантации в крови собак содержание субпопуляции активированных нейтрофилов CD45+CD66b+СD11с+ (рис. 2).

Отмеченные изменения иммунологических показателей после ортотопической имплантации матрик-сов трахеи могут расцениваться как реакция организма на хирургическое вмешательство, поскольку к концу периода наблюдения (2 мес) данные значения нормализовались, приближаясь к исходным цифрам.

В совокупности полученные данные свидетельствуют об отсутствии развития реакции отторжения в организме собак после ортотопической трансплантации им экспериментальных образцов матрикса трахеи. Они коррелируют с результатами клинических наблюдений за состоянием животных в послеоперационном периоде: начиная со 2-й недели, у собак не отмечали признаков отека, гипертермии или болевых реакций.

Изучение клеточного состава имплантата и ткани, прилегающей к синтетическому материалу, не выявляло каких-либо признаков развития отторжения, опосредуемого клеточной реактивностью. В частности, не наблюдали признаков лейкоцитарной инфильтрации тканей или поверхностных слоев образца матрикса. Клеточный состав матрикса был представлен соединительнотканными клетками реципиента и потомками МСК в стадии дифференцировки, активно колонизирующими как наружную, так и внутреннюю поверхности и глубокие слои матрикса, а также небольшим количеством клеток лимфоидного ряда (рис. 3).

При иммуногистохимических исследованиях в имплантате определяли незначительное количество Т-лимфоцитов (CD3-положительные клетки), а также единичные CD19+ (клетки плазматического ряда) и CD68+ (макрофаги). Выявляли очень небольшое количество пролиферирующих клеток (Ю67+) (рис. 4).

Заключение

Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что ультраволокнистый синтетический ма-трикс трахеи характеризуется высокой биосовместимостью, хорошо колонизуется клетками реципиента. Это позволяет получать на его основе биоинженерную конструкцию протеза трахеи.

Отсутствие достоверных изменений гематологических показателей без изменений лейкоцитарной формулы в сторону нарастания относительной концентрации нейтрофилов и моноцитов, а также анализ гистологических препаратов извлеченных образцов матрикса с прилегающей тканью указывает на то, что признаков развития реакции отторжения имплантата организмом реципиентов не происходило. Полученные результаты свидетельствуют о низкой иммуногенности нового синтетического матрикса трахеи, что подтверждает перспективность дальнейших исследований с целью внедрения данной разработки в клиническую практику.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение № 14.604.21.0023 от 17.06.2014 г. о предоставлении субсидии, - уникальный идентификатор RFMEFI60414X0023).

У авторов нет конфликта интересов.

литература

10. Киселевский М.В., Ситдикова С.М., Анисимова Н.Ю., Полоцкий Б.Е., Давыдов М.И. Перспективные синтетические матрик-сы для реконструкции дефектов трахеи у онкологических больных. Вопр. онкол. 2015; 61 (3): 323-8. PMID: 26242141.

references

1. Delaere P., Van Raemdonck D. Tracheal replacement. J. Thorac. Dis. 2016; 8: 186-96. doi: 10.3978/j.issn.2072-1439.2016.01.85.

2. Buonocore S., Surquin M., Le Moine A., Abramowicz D., Flamand V., Goldman M. Amplification of T-cell responses by neutrophils: relevance to allograft immunity. Immunol. Lett. 2004; 94 (3): 16316-6. PMID: 15275962.

3. Adams D.H., Wang L.F., Burnett D., Stockley R.A., Neuberger J.M. Neutrophil activation - an important cause of tissue damage during liver allograft rejection? Nephrol. Ther. 2005l; 1: 161-6. PMID: 2164266.

4. Sentis A., Kers J., Yapici U., Claessen N., Roelofs J.J., Bemelman F.J. et al. The prognostic significance of glomerular infiltrating leukocytes during acute renal allograft rejection. Transplant. Immunol. 2015; 33

(3): 168-75. doi: 10.1016/j.trim.2015.10.004. Epub. 2015 Oct 20.

5. Ajalloueian F., Lim M.L., Lemon G., Haag J.C. Biomechanical and biocompatibility characteristics of electrospun polymeric tracheal scaffolds. Biomaterials. 2014; 3 (5): 5307-15. doi: 10.1016/j. biomaterials.2014.03.015. Epub. 2014 Apr 3.

6. Macchiarini P., Jungebluth P., Go T., Asnaghi M.A. et al. Clinical transplantation of a tissueengineered airway. Lancet. 2008; 372: 2023-30 doi: 10.1016/S0140-6736(08)61598-6. Epub. 2008 Nov 18.

7. Jones M.C., Rueggeberg F. A., Cunningham A. J., Faircloth H.A., Jana T., Mettenburg D. et al. Biomechanical changes from long-term freezer storage and cellular reduction of tracheal scaffoldings. Laryngoscope. 2015; 125: E22, doi: 10.1002/lary.24853. Epub. 2014 Aug 5.

8. Sun F., Pan S., Shi H.C., Zhang F.B., Zhang W.D., Ye G. et al. Structural integrity, immunogenicity and biomechanical evaluation of rabbit decelluarized tracheal matrix. J. Biomed. Mater. Res. A. 2015; 103

(4): 1509-19. doi: 10.1002/jbm.a.35273. Epub. 2014 Aug 6.

9. Kiselevsky M.V., Anisimova N.Y., Lebedinskaya O.V., Polotskii B.E., Davydov M.I. Optimization of a method for preparation and repopulation of the tracheal matrix for allogenic transplantation. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 151 (1): 107-13.

10. Kiselevskiy M.V. Sitdikova S.M., Anisimova N.Yu., Polotskiy B.E., Davydov M.I. Prospective synthetic matrices for the reconstruction of tracheal defects in cancer patients. Vopr. onkol. 2015; 61 (3): 323-8. PMID: 26242141. (in Russian)

Поступила 07.01.16 Принята в печать 18.02.16