Направленная элиминация миелинреактивных В-клеток с применением иммунотоксинов лигандов антигенных рецепторов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.017.1:612.112.31

Направленная элиминация миелин-реактивных В-клеток с применением иммунотоксинов — лигандов антигенных рецепторов

А. В. Степанов1,2*, А. А. Белогуров12,3, P. Kothapalli4, О. Г. Шамборант1, В. Д. Кнорре1, Г. Б. Телегин1, А. А. Овсепян1, Н. А. Пономаренко1, С. М. Деев1, S. V. Kaveri4, А. Г. Габибов123

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

2Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Россия, Казань, ул. Кремлевская, 18

3Институт биологии гена РАН, 119334, Россия, Москва, ул. Вавилова, 34/5

4Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S 1138, F-75006 Paris,

France

*E-mail: stepanov.aleksei.v@gmail.com Поступила в редакцию 05.05.2015

РЕФЕРАТ B-клетки играют важную роль в развитии и патогенезе как системных, так и орган-специфических аутоиммунных заболеваний. Аутореактивные B-клетки не только продуцируют аутоантитела, но также секретируют провоспалительные цитокины и эффективно презентируют специфические аутоантигены Т-клеткам. Существующая на сегодняшний день терапия аутоиммунных заболеваний путем элиминирования большинства аутореактивных В-клеток моноклональным анти-CD19/20-антителом Ритуксимаб (Rituximab) приводит к системным побочным проявлениям и требует значительного пересмотра. Терапия, направленная на селективную элиминацию патологических аутореактивных В-клеток, потенциально может стать универсальным подходом к лечению целого ряда аутоиммунных заболеваний. В данной работе нами создан рекомбинантный иммунотоксин на основе константного фрагмента антитела, слитого с имму-нодоминантным эпитопом основного белка миелина. На животной модели рассеянного склероза - мышах линии SJL/J с индуцированным экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ), показано, что созданный рекомбинантный иммунотоксин способен направленно элиминировать популяцию патологических лимфоцитов in vivo. Предложенная концепция может лечь в основу дальнейшего развития препаратов для специфической терапии рассеянного склероза и ряда других аутоиммунных заболеваний. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аутоантигены, В-лимфоциты, иммуноглобулины, иммунотоксины, рассеянный склероз. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЕАЕ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; ИФА - иммунофер-ментный анализ; MBP - основный белок миелина; ПАФ - полный адъювант Фрейнда; РС - рассеянный склероз.

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) - это хроническое нейро-дегенеративное заболевание центральной нервной системы аутоиммунной природы, при котором основными аутоантигенами являются белки миели-новой оболочки нервных волокон [1]. В Российской Федерации насчитывается более 200000 человек, больных рассеянным склерозом [2]. Несмотря на успехи в терапии РС, достигнутые в последние годы, существующие методики не позволя-

ют добиться полного выздоровления пациента [3]. Современные подходы к терапии РС, включающие введение рекомбинантных антител и других низкомолекулярных агентов, специфически действующих на компоненты иммунной системы, крайне затратны для бюджетов развитых стран, а с учетом необходимости длительного лечения ставят под угрозу всю систему реабилитации. Более того, уровни инвалидизации пациентов не дают основания для позитивного прогноза в социальной сфере.

Важно отметить, что на сегодняшний день методики, применяемые при РС, включают в себя в основном иммуносупрессирующие препараты ненаправленного действия, часто вызывающие системные осложнения [4].

Основную роль в патогенезе РС долгое время отводили CD4+ Т-клеткам, однако на настоящий момент очевидно, что В-клеточный ответ несомненно играет не менее важную роль в развитии данного заболевания. Аутореактивные B-клетки не только вырабатывают аутоантитела, но также способны эффективно функционировать в качестве антиген-презентирующих клеток, активируя Т-клетки [5]. Кроме того, В-клетки могут секретировать провос-палительные цитокины и усиливать патологические процессы саморазрушения [6]. Терапия, направленная на определенную популяцию лимфоцитов, в перспективе является универсальным средством при целом ряде В-клеточных заболеваний. На сегодняшний день элиминацию аутореактивных В-клеток осуществляют с помощью введения моноклонально-го анти-CD19/20-антитела Ритуксимаб (Rituximab, Rituxan, MabThera), которое активно используется в терапии лимфом и аутоиммунных заболеваний [7-12]. Клиническое применение данного препарата в значительной степени ограничено и осуществляется в исключительных случаях, так как приводит к элиминации большинства В-лимфоцитов организма и, как следствие, широкому спектру побочных эффектов [13]. В этой связи проблема создания препаратов специфической терапии рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний остается крайне актуальной.

Основной подход к терапии рассеянного склероза заключается в подкожном введении иммуномо-дулирующего препарата глатирамера ацетата (GA, glatiramer acetate). GA - это полипептид длиной 40-100 аминокислотных остатков, включающий случайную комбинацию аланина, лизина, глутамата и тирозина в соотношении 4.5 : 3.6 : 1.5 : 1 соответственно. Структурно GA имитирует один из основных аутоантигенов при РС, сильно положительно заряженный основный белок миелина (myelin basic protein, МВР). Действие GA предположительно состоит в конкуренции с фрагментами основного белка миелина за связывание с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II DR, а также в индукции регуляторных Т-клеток (тип Тх2/3), секретирующих противовоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-10 и нейротрофический фактор головного мозга [14]. Следует отметить, что степень эффективности терапии GA сильно варьирует, вплоть до полной резистентности пациентов к используемому препарату [14].

В данной работе нами предложен и успешно реализован подход к созданию рекомбинантных полипептидов, способных осуществлять специфическую элиминацию патологических лимфоцитов in vivo. В качестве мишени адресной доставки цитотокси-ческих агентов нами был выбран поверхностный иммуноглобулин аутореактивных В-лимфоцитов (В-клеточный рецептор, BCR) - уникальный рецептор, отличающий определенную клонально-гомоген-ную популяцию В-клеток от всех других клеток организма. В ряде научных работ уже была доказана высокая эффективность направленной элиминации лимфоцитов с помощью BCR-специфичных иммуно-токсинов in vitro [15, 16]. Ранее уже было показано, что в сыворотке больных РС обнаруживается высокий титр аутоантител [17-19], специфичных к МВР. Одна из наиболее признанных животных моделей рассеянного склероза - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), индуцированный у мышей линии SJL/J [20, 21]. При развитии ЕАЕ у мышей SJL/J также формируются аутоантитела, специфичные к MBP. С помощью созданной нами ранее библиотеки рекомбинантных эпитопов MBP методом иммуноферментного анализа (ИФА) проведен сравнительный анализ специфичности сывороточных аутоантител, полученных от пациентов с РС и различных животных с ЕАЕ к различным эпитопам аутоантигена [22]. Основываясь на полученных данных, в качестве высокоспецифичного лиганда поверхностных BCR аутореактивных B-клеток выбрали иммунодоминантный фрагмент [QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQ] MBP82-105. Далее нами был создан химерный белок, состоящий из последовательности MBP82 , слитой с константным фрагментом антитела, который обладает хорошими фармакодинамическими показателями и, вместе с тем, способен эффективно запускать механизмы антитело-зависимой цитотоксичности. В настоящей работе изучен терапевтический потенциал созданного белка-киллера в терминах селективной элиминации аутореактивных MBP-специфичных В-клеток in vivo у мышей линии SJL/J с индуцированным ЕАЕ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Создание генетической конструкции, кодирующей константный фрагмент иммуноглобулина, слитого

с MBP82_105

Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент MBP82 , получена путем ПЦР-амплификации с взаимно перекрывающимися внешними и внутренними праймерами 5'-ATTAGGTACCCAAGATGAAAAC-

CCCGTAGTCCACTTCTTCAAGA-3', 5'-CGTAGTCCACTTCTTCAAGAA-CATTGTGACGCCTCGCACACC-3' и 5'-TAAT-GTCGACTCCCTGCGACGGGGGTGGTGTGC-GAGGCGTCACA-3'. ПЦР-продукт был обработан эндонуклеазами рестрикции EcoRI и BglII, а затем лигирован с обработанным аналогичным образом вектором pFUSE.

Получение клонов-продуцентов рекомбинантных молекул

Для получения стабильной линии клеток CHO, продуцирующей рекомбинантные молекулы MBP82 105-Fc (pFUSE-MBP82-105-Fc) и Fc (pFUSE-Fc), клетки линии CHO трансфицировали методом липофекции соответствующими генетическими конструкциями. Для этого за день до трансфекции клетки CHO рассе-вали в лунки 6-луночного планшета (Nunc) в концентрации 0.5 млн/мл. При достижении 80% конфлюент-ности клетки трансфицировали методом липофекции с помощью набора Lipofectamine LTX (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Спустя 72 ч к клеткам добавляли среду с селективным антибиотиком зеоцином. Устойчивые к антибиотику клетки переносили в 96-луночные плашки (Corning). Полученные клоны тестировали на наличие продукции рекомбинантных молекул методом ИФА с помощью моноклональных анти-Fc-антител.

Выделение молекул Fc, MBP82 105-Fc

Выделение белков-киллеров, содержащих Fc-фрагмент антитела класса IgG2a, проводили по следующей схеме. Первоначально отбирали супернатант клеток CHO, трансфицированных плазмидами, содержащими нуклеотидные последовательности, кодирующие константный фрагмент антитела, соединенный с последовательностью пептида. Отобранную фракцию центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин. Супернатант отбирали и наносили на колонку для аффинной хроматографии с иммобилизованным белком G (HiTrap Protein-G Sepharose (Amеrsham, США)) в буфере PBS со скоростью 0.5 мл/мин. Затем колонку промывали 80-100 объемами PBS на скорости 2.5 мл/мин для отделения неспецифически сорбированных белков. Фракцию элюировали с колонки 100 мМ раствором глицин-HCl pH 2.5 и незамедлительно нейтрализовали 2 М раствором трис-основания до pH 7.3-7.7. Все хромато-графические стадии выделения проводили на системе DuoFlow BioRad. Идентификацию препаратов Fc и MBP82 105-Fc, а также оценку их чистоты проводили с помощью денатурирующего электрофореза в по-лиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром и иммуноферментным анализом.

Индукция и терапия ЕАЕ у мышей линии SJL

Эксперименты проводили в научно-производственном подразделении филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова - питомнике лабораторных животных «Пущино» (Россия, Пущино) и научном центре Centre de Recherche des Cordeliers de Jussieu (CRC) (Франция, Париж) с соблюдением всех регламентированных этических норм. ЕАЕ индуцировали у самок мышей линии SJL в возрасте от 6 до 8 недель со статусом SPF (specified pathogen free) в соответствии с протоколом [23] путем двукратного введения 100 мкг гомогената спинного мозга мыши (ГСММ) в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), содержащем туберкулин в концентрации 4 мг/мл. В 1-й день ГСММ вводили подкожно в две точки вдоль позвоночного столба, а на 3-й день в подошвы задних лап. Дополнительно в день инъекций ГСММ в ПАФ мышам вводили внутривенно раствор коклюшного токсина (Pertussis toxin, Calbiochem, США) в количестве 500 нг/мышь. Мышей с индуцированным ЕАЕ разделили на четыре группы по 10 животных в каждой: без инъекций (группа без терапии); животным однократно вводили 200 мкг GA (Teva); животным в группах Fc и MBP82 105-Fc на 5 и 10 день с момента индукции ЕАЕ внутривенно вводили 50 мкг препарата. Тяжесть развития аутоиммунной патологии оценивали ежедневно в соответствии со следующей шкалой: 0 - норма, 1 -потеря тонуса хвоста, 2 - слабость задних ног или их паралич, 3 - сильный паралич конечностей, 4 - полный паралич (неспособность двигаться), 5 - смерть.

Проточная цитофлуориметрия

У мышей SJL/J из каждой экспериментальной группы выделяли селезенку. Далее селезенку переносили в чашки Петри и гомогенизировали для получения суспензии спленоцитов. Изолированные спленоциты ресуспендировали в среде DMEM, 1 млн клеток центрифугировали в течение 10 мин при 400 g, осадок дважды отмывали PBS. К клеткам добавляли раствор биотинилированных пептидов MBP (7-TQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPS или 12-DAQG-TLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR) в фосфатном буфере, содержащем 1% БСА. Клетки инкубировали в течение 40 мин при +4°С, центрифугировали (10 мин, 400 g) и ресуспендировали в физиологическом буфере. К клеточной суспензии добавляли анти-В220-APC-антитела (eBioscience, США) и конъюгат Streptavidin-Pacific Blue™, инкубировали (40 мин при +4°С), центрифугировали (10 мин, 400 g), ресуспендировали в буфере FACS (0.1% БСА, 0.02% азида натрия, 50 мкг/мл йодида пропидия в фосфатном буфере) и анализировали на проточном цитофлуориме-тре FACSdiva (Becton Dickinson, США).

л

BglII

л

hinge CH2

CH3

^MBP82-105

.hinge CH2

CH3

Fc

MBP82-105-Fc

Б

<N

oo CL Cû

и

Е

Б

QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG - MBP82-105

ASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTG ILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSL PQKSHGRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRG

LSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGV DAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR

Рис. 1. Карта плазмидного вектора pFUSE, содержащего ген константного фрагмента иммуноглобулина мыши (А). Последовательность полноразмерного MBP и фрагмента MBP82 (выделен жирным), интегрированного в вектор pFUSE (Б)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание генетической конструкции, кодирующей константный фрагмент иммуноглобулина, слитого с пептидом MBP

Для создания цитотоксических белков высокой избирательности, способных направленно удалять популяцию аутореактивных В-клеток с заранее известной специфичностью, нами была получена генетическая конструкция, кодирующая константный фрагмент ^с) антитела мыши, слитый с фрагментом МВР82 . С этой целью использовали коммерчески доступный плазмидный вектор pFUSE, содержащий ген константного фрагмента иммуноглобулина мыши класса IgG2a (Invivogen) (рис. 1). Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент МВР82 (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG), была ампли-фицирована методом ПЦР с взаимно перекрывающимися праймерами. Полученные фрагменты ДНК встроили в плазмидный вектор pFUSE-mIgG2a по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BgПL

<N 00 CL Cû

и

Е

анти-Fc анти-MBP

Рис. 2. Схематическое изображение строения рекомбинантных слитых белков Fc и MBP82 105-Fc (А).

-Fc с анти-Fc- и анти-MBP-

Гибридизация Fc и MBP82 антителами (Б)

Для получения стабильной линии клеток CHO, продуцирующей рекомбинантные белки MBP82 -Fc (pFUSE-MBP82-105-Fc) и Fc (pFUSE-Fc), клетки линии CHO трансфицировали методом липофекции соответствующими генетическими конструкциями. Трансфицированные клетки отбирали на среде с антибиотиком зеоцином. Устойчивые к антибиотику клетки клонировали. Полученные клоны тестировали на наличие продукции рекомбинантных белков методом ИФА. Отобранные клоны-продуценты использовали для препаративной продукции белка в 125 см2 флаконах в течение 9 дней. Fc-содержащие белки последовательно очищали из ростовой среды с помощью аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным G-белком и на гель-фильтрационной колонке Superdex 200. Согласно электрофоретиче-скому анализу, гомогенность препаратов составила более 95%. Наличие фрагмента MBP в выделенных рекомбинантных белках оценивали методом блотинга по Вестерну с использованием анти-MBP (рис. 2Б) и анти-Fc(рис. 2Б) антител. Гибридизация с анти-MBP-антителами подтвердила, что слитый белок MBP82-105-Fc содержит иммунодоминантный участок MBP, в то время как в составе контрольного Fc его фрагменты отсутствуют.

л

Профиль ЕАЕ

Б

ш 2.0 *

MBP 81-103-Pacific Blue

В

MBP 146-170-Pacific Blue

-2 0 5 10 20 День

-2 0 5 10 20 День

-2 0 5 10 20 День

-2 0 5 10 20 День

Q2

Q4

-2 0 5 10 20

1 группа - ЕАЕ

2 группа + ЕАЕ

щ Q2

Q4

3 группа + ЕАЕ

+ GA

4 группа + ЕАЕ

+ Fc

5 группа + ЕАЕ

+ MBP82-105-FC

Рис. 3. Степень развития ЕАЕ у мышей линии SJL, отобранных из каждой экспериментальной группы (А). Репрезентативный анализ изолированных спленоцитов на наличие В-клеток, специфичных к фрагментам МВР81 103 (Б) и МВР146 (б), методом проточной цитофлуориметрии

День

Элиминация аутореактивных В-клеток у мышей SJL с индуцированным ЕАЕ

Для формирования популяции аутореактивных В-клеток, специфичных к MBP, у мышей линии SJL индуцировали экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит. С этой целью животным делали две подкожные инъекции гомогената спинного мозга мыши в эмульсии полного адъюванта Фрейнда. Дополнительно для усиления развития ЕАЕ в те же дни животным внутривенно вводили раствор коклюшного токсина (Pertussis toxinj. В качестве отрицательного контроля использовали группу (1), в которую входили неиммунизированные интактные мыши. Далее мышей с индуцированным ЕАЕ разделили на четыре экспериментальные группы по 10 животных в каждой: (2) без терапии; (3) животным

однократно вводили 200 мкг GA (Teva) (группа GA); животным в каждой группе дважды внутривенно вводили Fc (4) и MBP82 105-Fc (5) (таблица).

На 7 день с начала индукции ЕАЕ и до окончания эксперимента во всех группах оценивали развитие симптомов ЕАЕ по пятибалльной шкале.

На 14-15 день после индукции у мышей во всех группах начинали развиваться симптомы ЕАЕ, на 17-19 дни заболевание достигало пика. На 23 день из каждой экспериментальной группы были отобраны мыши SJL с одинаковой клинической картиной ЕАЕ (рис. 3А). В культурах спленоцитов, полученных из этих мышей, выявляли В-клетки, специфичные к иммунодоминантному и С-концевому фрагментам MBP. Для этого клетки инкубировали с пептидами MBP81 и MBP146 , конъюгированными с био-

Экспериментальные группы

Группа Число мышей ЕАЕ Инъекции Количество инъекций День инъекции Доза, мкг/ мышь

1 5 - - - - -

2 10 + - - - -

3 10 + GA 1 1 200

4 10 + Fc 2 5 и 10 50

5 10 + MBP -Fc 1VJ"LJ-L 82-105 2 5 и 10 50

тином. Для визуализации В-клеток использовали конъюгат анти-В220-антител с флуорофором APC (eBioscience), в свою очередь, биотинилированные пептиды MBP, связанные с поверхностным BCR, детектировали, добавляя конъюгат стрептавидина с флуорофором Pacific Blue™ (eBioscience). Образцы анализировали методом проточной цитофлуориме-трии на приборе FACSDiva (BD), результаты представлены на (рис. 3Б,В).

Как видно из рис. 3Б,В у мыши из группы «контроль» отсутствовала популяция В-клеток, специфичных к MBP, в то время как в культуре сплено-цитов, полученной от животного из группы «без терапии», выявлена значимая популяция В-клеток, специфичных к обоим пептидам MBP. Как и ожидалось, внутривенные инъекции контрольного Fc, не содержащего пептиды MBP, не привели к какому-либо изменению популяции МВР-реактивных В-клеток. При однократном введении препарата GA в культуре клеток исчезала популяция, специфичная к MBP81 , но оставалась популяция В-клеток, содержащих на поверхности BCR, специфичный к С-концевому фрагменту MBP146-170. Данное наблюдение в очередной раз подтверждает, что терапевтическое действие GA направлено на популяцию В-клеток, специфичных к иммунодо-минантному эпитопу MBP81 [24]. Введение слитого белка MBP81-103-Fc приводило к полной элиминации В-клеток, специфичных не только к фрагменту MBP81 , входящего в состав вводимого иммуноток-сина, но и к фрагменту MBP146 . Таким образом, профиль популяции В-клеток, специфичных к MBP,

в культуре спленоцитов мыши, подвергнутой терапии белком МВР81 103^с, совпал с профилем здорового животного. Полученные результаты позволяют утверждать, что иммунотоксин МВР81 103^с наряду с селективной элиминацией В-клеток, специфичных к иммунодоминантному фрагменту МВР81 , подавляет также формирование В-клеток, специфичных к фрагменту МВР146-170.

ВЫВОДЫ

В последнее десятилетие при создании препаратов для лечения больных рассеянным склерозом и другими аутоиммунными заболеваниями все большее место отводится антиген-специфичной терапии. На животной модели нами протестирован один из наиболее актуальных на сегодняшний день подходов к терапии рассеянного склероза - селективная элиминация аутореактивных В-клеток. На основе константного фрагмента иммуноглобулина, слитого с иммунодоми-нантной последовательностью МВР, получен высокоселективный белок-киллер В-клеток. Введение данного рекомбинантного иммунотоксина мышам линии SJL/J с индуцированным ЕАЕ приводило к полному подавлению популяции В-клеток, специфичных к фрагментам МВР. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что предложенная концепция может быть успешно реализована при создании препаратов направленной терапии рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний. •

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России (проект № RFMEFI60714X0061).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nylander A., Hafler D.A. // J. Clin. Invest. 2012. V. 122. P. 1180-1188.

2. Kingwell E., Marriott J.J., Jette N., Pringsheim T., Makhani N., Morrow S.A., Fisk J.D., Evans C., Beland S.G., Kulaga S. // BMC Neurol. 2013. V. 13. P. 128.

3. Ransohoff R.M., Hafler D.A., Lucchinetti C.F. // Nat. Rev. Neurol. 2015. V. 11. P. 134-142.

4. Sorensen P.S. // Curr. Opin. Neurol. 2014. V. 27. P. 246-259.

5. Krumbholz M., Derfuss T., Hohlfeld R., Meinl E. // Nat. Rev. Neurol. 2012. V. 8. P. 613-623.

6. Marino E., Grey S.T. // Autoimmunity. 2012. V. 45. P. 377-387.

7. Arkfeld D.G. // Rheumatol. Int. 2008. V. 28. P. 205-215.

8. Wang M., Fowler N., Wagner-Bartak N., Feng L., Romaguera J., Neelapu S.S., Hagemeister F., Fanale M., Oki Y., Pro B. // Leukemia. 2013. V. 27. P. 1902-1909.

9. Ransohoff R.M., Zamvil S.S. // Neurotherapeutics. 2007. V. 4. P. 569-570.

10. Cross A.H., Stark J.L., Lauber J., Ramsbottom M.J., Lyons J.A. // J. Neuroimmunol. 2006. V. 180. P. 63-70.

11. Деев С.М., Лебеденко Е.Н.// Acta Naturae. 2009. Т. 1. № 1. С. 32-50.

12. Деев С.М., Лебеденко Е.Н., Петровская Л.Е., Долгих Д.А., Габибов А.Г., Кирпичников М.П. // Успехи химии. 2015. Т. 84. № 1. С. 1-26.

13. Castillo-Trivino T., Braithwaite D., Bacchetti P., Waubant E. // PLoS One. 2013. V. 8. e66308.

14. Sela M., Mozes E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 14586-14592.

15. Stepanov A.V., Belogurov A.A., Jr., Ponomarenko N.A., Stremovskiy O.A., Kozlov L.V., Bichucher A.M., Dmitriev S.E., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Balabashin D.S., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 6. e20991.

16. Zocher M., Baeuerle P.A., Dreier T., Iglesias A. // Int. Immunol. 2003. V. 15. № 7. P. 789-796.

17. Johnson A.B., Dal Canto M.C. // Nature. 1976. V. 264. P. 453-454.

18. Abramsky O., Lisak R.P., Silberberg D.H., Pleasure D.E. // New Engl. J. Med. 1978. V. 298. P. 743.

19. Ponomarenko N.A., Durova O.M., Vorobiev I.I., Belogurov A.A. Jr., Kurkova I.N., Petrenko A.G., Telegin G.B., Suchkov S.V., Kiselev S.L., Lagarkova M.A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 2. P. 281-286.

20. Miller S.D., Karpus W.J., Davidson T.S. // Curr. Protoc. Immunol. 2010. Ch. 15. V. 15. P. 11.

21. Stromnes I.M., Goverman J.M. // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 1810-1819.

22. Belogurov A.A., Jr., Kurkova I.N., Friboulet A., Thomas D., Misikov V.K., Zakharova M.Y., Suchkov S.V., Kotov S.V., Alehin A.I., Avalle B., et al. // J. Immunol. 2008. V. 180. P. 1258-1267.

23. Yasuda T., Tsumita T., Nagai Y., Mitsuzawa E., Ohtani S. // Japan J. Exp. Med. 1975. V. 45. P. 423-427.

24. Sela M., Teitelbaum D. // Expert Opin. Pharmacother. 2001. V. 2. P. 1149-1165.