CC BY
85
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 1-2, стр 29-38 © 2003, СПб РО РААКИ
Обзоры
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ ДЛЯ СУПРЕССИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
Кривощапов Л.Г.
Московская Медицинская Академия им И.М. Сеченова
Резюме. Привлекательность применения генно-инженерных иммуномодуляторов основана на концепции разработки нетоксичной, специфичной терапии с минимальными побочными эффектами.
Цитокины, рецепторы и антитела, обладающие способностью блокировать развитие иммунного ответа, могут быть изменены для обладания определенной биологической активностью. Отдельно можно выделить такие методы, как ДНК-вакцинацию и селективную элиминацию определенных клеточных популяций.
Дальнейшие исследования различных генно-инженерных иммуномодуляторов могут способствовать внедрению новых обоснованных подходов к терапии аутоиммунных заболеваний. В предлагаемом обзоре рассматривается ряд подходов к воздействию на регуляторные механизмы иммунного ответа.
Ключевые слова: аутоиммунные заболевания, иммуносупрессия, генно-инженерные препараты.
Krivoshchapov L.G.
MEDICAL USE OF RECOMBINANT IMMUNOMODULATORS FOR
THE IMMUNE SUPPRESSION IN AUTOIMMUNE DISEASES
Abstract. The attraction of usage of recombinant immunomodulators is based on the concept of developing nontoxic, specific therapies with minimal side effects.
Cytokines, receptors, antibodies that are capable to block immune response can be modified and engineered to contain predicted biological activity. Additional genetic strategies include DNA vaccination and the ablation of selected cell populations.
The further investigation of the different recombinant immunomodulators may help to invent new rational therapeutic approaches for autoimmune diseases. Herein we review a number of approaches which may be used for targeting regulatory mechanisms of immune response. (MedJmmunol., 2003, vol.5, N1-2, pp 29-38)
Лечение аутоиммунных заболеваний зачастую связано с широким спектром побочных эффектов. Ряд этих побочных эффектов можно связать с генерализованной иммуносупрессией, особенно, если в схему лечения включено использование стероидных гормонов и цитостатиков.
Применение методов генной инженерии позволяет получать белки и нуклеиновые кислоты с прогнозируемой биологической активностью. Большой
Адрес для переписки:
Московская Медицинская Академия им И.М. Сеченова, кафедра патологической анатомии 119 881, Москва, Б. Пироговская, 2-6.
Тел: 242-91-52.
E-mail: krivoschapov@mmascience.ru
интерес в настоящее время вызывает возможность разработки новых лекарственных средств, вызывающих селективную иммуносупрессию. Использование подобных препаратов, созданных на основе рекомбинантных рецепторов, цитокинов, гормонов и других биологически активных веществ, позволяет существенно снизить побочные эффекты, воздействуя на регуляторные механизмы иммунного ответа.
Частота и распространенность аутоиммунных заболеваний человека достаточно высока. Так, распространенность хронического аутоиммунного тире-оидита в США в 1997 году составила 791.6 на
100.000, ревматоидного артрита - 860 на 100.000, тиреотоксикоза и миастении Гравис - 1151.5 на
100.000, первичного гломерулонефрита - 40 на
100.000 [32]. Социальная значимость этих заболеваний обусловлена тем, что они приводят к инвалиди-зации. Например, при некоторых формах артрита частота инвалидизации составляет до 60% [48], а реабилитация таких больных обходится очень дорого [24].
Для аутоиммунных заболеваний (АЗ) характерно развитие самоподдерживающегося иммунного ответа на нативные молекулы межклеточного вещества или мембран клеток собственного организма.
Существует несколько гипотез, объясняющих механизмы индукции АЗ. Считается, что в основе АЗ лежит возникновение клонов иммунокомпетентных клеток, продуцирующих антитела против нативных молекул организма либо аутореактивных клеток, распознающих антигены собственного организма. Происхождение подобных аутореактивных клонов связывают с нарушением регуляции на этапе отрицательной селекции клонов лимфоцитов, распознающих фрагменты собственных пептидов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), или на этапах поздней дифференци-ровки, что приводит к формированию аутореактивных клонов лимфоцитов, вызывающих, чаще всего, хроническое поражение клеток и тканей собственного организма. Недостаточная элиминация этих клонов может быть связана с нарушениями апопто-за лимфоцитов, дефицитом или функциональной недостаточностью Т-супрессоров.
Гипотеза «забарьерных» антигенов основана на том факте, что иммунный ответ может развиваться против аутоантигенов, в норме находящихся за гис-тогематическим барьером. Такие аутоантигены находятся в головном мозге, половых железах, глазах и некоторых других органах.
Гипотеза Фюденберга предполагает наличие генетически обусловленного специфического иммунодефицита к определенному микробному антигену [59]. Инфекционный процесс, обусловленный микроорганизмом, содержащим подобный антиген, как правило, сопровождается хронизацией инфекции с повышенным разрушением тканей и высвобождением большого количества аутоантигенов, которые, в последующем, вызывают сенсибилизацию и экспансию аутореактивных клеток и продукцию аутоантител [26]. Сходство эпитопов некоторых патогенных микроорганизмов, например [3-гемолитического стрептококка группы А, с эпитопами антигенов тканей и органов человека может вызывать формирование перекрестно реагирующих аутоантител и приводить к развитию АЗ. Модификация структуры собственных белков организма при взаимодействии с некоторыми лекарственными веществами, которые могут играть роль гаптенов, приводит к распознаванию эпитопов данных белков рецепторами иммунокомпетентных клеток и, как следствие, развитию аутоиммунного ответа. Мутации генов, регулирую-
щих продукцию медиаторов воспаления, и связанная с этим повышенная продукция провоспалитель-ных цитокинов или необычная экспрессия молекул ГКГС, а также бесконтрольная поликлональная экспансия лимфоцитов также могут приводить к индукции АЗ [1, 2].
Существует ряд классификаций АЗ, основанных на различиях антигенов-мишеней, что позволяет выделять АЗ с более выраженным органоспецифическим или преимущественно системным поражением. АЗ можно также разделить на группы по типу иммунного повреждения тканей в соответствии с эффекторными механизмами иммунных реакций II
- IV типа. Иммунные реакции II типа - реакции, опосредованные антителами к клеточным или матричным антигенам (например, при аутоиммунном тиреоидите, первичной микседеме, инсулиннезави-симом сахарном диабете (II типа), вульгарной пузырчатке, гранулематозе Вегенера и др.). Иммунные реакции III типа проявляются повреждением тканей иммунными комплексами (в частности, при идиопа-тической криоглобулинемии, системной красной волчанке). При иммунных реакциях IV типа развиваются клеточно-опосредованные реакции, например, при синдроме Шегрена, инсулинзависимом сахарном диабете (I типа), рассеянном склерозе и др. Некоторые классификации учитывают также генетическую предрасположенность к определенным АЗ (Е.Л. Насонов, В.В. Сура, 1988).
Достаточно детально изучены вопросы клинической диагностики АЗ. Существующие схемы лечения, применяющиеся в клинической практике, как правило, основываются на комбинации заместительной терапии с целью возмещения утраченной функции (В(2 - при пернициозной анемии, тироксин - при микседеме), применении неспецифических противовоспалительных средств (производных салициловой кислоты, кортикостероидов) и иммуносупрессивной терапии (циклоспорином, циклофосфаном, меркап-топурином и др.). Использование цитостатических препаратов приводит к элиминации сенсибилизированных клонов лимфоцитов. Применяются также различные методы цитофереза и гемосорбции с целью элиминации аутореактивных клеток и удаления антител, циркулирующих иммунных комплексов, а также иммунотерапия, направленная на десенсибилизацию к аутоантигенам.
Серьезные пробелы существующих схем лечения связаны с тяжелыми побочными эффектами и осложнениями, развивающимися на фоне применения неспецифических противовоспалительных средств, кортикостероидов и цитостатиков [49]. С этим связана необходимость проведения коротких курсов терапии. Отдельно можно выделить большую группу побочных эффектов, непосредственно связанных с генерализованной иммуносупрессией. Предложена также методика, заимствованная из онкологичес-
кой практики и основанная на полной элиминации лимфоцитов высокодозным тотальным облучением и субтоксическими дозами цитостатиков [20] с последующей аутологичной пересадкой костного мозга [56,1].
Так как десенсибилизация и элиминация иммуногена при АЗ зачастую совершенно невозможны, то при поиске решения существующих проблем наиболее значимым представляется достижение более дифференцированного и специфичного воздействия на звенья патогенеза АЗ с целью уменьшения тяжести заболевания и снижения побочных эффектов. Решение подобной задачи возможно лишь при использовании новых терапевтических агентов селективного действия и стратегии, в основе которой лежит воздействие на молекулярные механизмы развития аутоиммунного поражения, в том числе на ранних стадиях развития заболевания.
В основе антигенспецифического иммунного ответа лежит представление и распознавание чужеродного антигена клетками иммунной системы. Иммунная система человека представляет собой совокупность центральных и периферических лимфоидных органов и диссеминированных клеток, выполняющих иммунологические функции. Ведущая роль в развитии специфических иммунных реакций принадлежит лимфоцитам. В периферических лимфоидных органах зрелые неиммунные лимфоциты вступают в контакт с антигенпредставляющими клетками (АПК) и, в условиях достаточного коре-цепторного взаимодействия, обеспечивающего дополнительную стимуляцию, лимфоцит активируется и вступает на путь дальнейшей дифференциров-ки и пролиферации.
Выделяют две популяции лимфоцитов: В-лимфо-циты и Т-лимфоциты. Т-лимфоциты, в свою очередь, в результате дифференцировки образуют эффектор-ные субпопуляции: Т-киллеров, Т-супрессоров и две субпопуляции Т-хелперов (ТЫ и ТЬ2).
АПК, в роли которых чаще всего выступают дендритные клетки, макрофаги или В-лимфоциты, осуществляют процессинг антигена и представление его лимфоцитам. На начальном этапе для индукции антигенспецифического ответа необходимо взаимодействие АПК и Т-лимфоцита, который взаимодействует с АПК посредством Т-клеточного рецептора. Этот первый сигнал к активации Т-хелпера является следствием распознавания Т-клеточным рецептором антигена в виде пептидных фрагментов, связанных с ГКГС второго класса. Кроме того, необходим второй сигнал, дополнительный, который не является анти-ген-специфичным и обеспечивается взаимодействием между АПК и Т-лимфоцитами посредством других рецепторов и их лигандов. Фактически подобное взаимодействие служит лишь сигналом, определяющим, какой клон Т-лимфоцитов может участвовать в иммунной реакции.
Основная костимулирующая молекула, экспрессируемая Т-лимфоцитами - гликопротеин CD28, который способен связываться с двумя молекулами на АПК: B7.1(CD80) и B7.2(CD86) [66]. Взаимодействие CD28 и В7 играет важную роль как при аутоиммунных реакциях, так и при реакции на гетерогенные антигены [44]. Еще одной молекулой, которая представляет интерес с точки зрения обеспечения дополнительного сигнала при активации Т-лимфоцитов, является 4-1ВВ (CD137), по данным некоторых авторов в определенных условиях [73] она участвует в костимуляции Т-лимфоцитов [17, 78].
Для формирования полноценного ответа при взаимодействии Т-лимфоцита с АПК имеет значение стимуляция цитокинами (в частности IL-2) и наличие на поверхности клеток ряда адгезивных молекул (LFA-1 (CDUa/CD18), ICOS (inducible T-cell co-stimulator), SLAM (CDwl50), OX-40 (CD134) и др.). Кроме того, остается много вопросов, связанных с участием ряда других молекул в активации Т-лим-фоцитов. Признано, в частности, что независимые от TCR, CD28/B7 и ICAM-l(CD54)/LFA-l(CDlla/ CD 18) - опосредованные сигналы способствуют реорганизации мембраны Т-лимфоцита в результате движения компонентов цитоскелета, заканчивающегося увеличением плотности TCR на участке мембраны, непосредственно взаимодействующим с АПК [82].
Активированные Т-лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в эффекторные клетки. CD4+ Т-клетки дифференцируются в два типа хел-перов, каждому из которых свойственен определенный цитокиновый профиль: ТЫ секретируют INF-y, IL-2, IL-3, TNFoc и р, GM-CSF, что проявляется, в основном, усилением активности макрофагов. Для Th2 характерна продукция IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 и GM-CSF. ТЬ2 осуществляют эффекторное воздействие, в основном, на В-лимфоциты, способствуя их дифференциров-ке в плазматические клетки и в В-клетки памяти. Плазматические клетки в дальнейшем вырабатывают антитела и играют ведущую роль в дальнейшем развитии гуморального антигенспецифического иммунного ответа.
При распознавании антигена взаимодействие CD28 с В7 приводит к увеличению количества Т-лимфоцитов, вовлеченных в клеточный ответ, и наиболее существенно влияет на продукцию лимфоки-нов и выживаемость Т-лимфоцитов (рис.1). Таким образом, стимуляция CD28 может усилить опосредованную Т-клеточным рецептором продукцию лим-фокинов, включая IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF и INF-y [1, 2, 33, 76]. Этот эффект CD28, который выражается в увеличении продукции лимфокинов до нескольких порядков, вызван не только усилением транскрипции лимфокинов, но и стабилизацией мРНК лимфокинов [42].
Рис. 1. Схема взаимодействия Т-лимфоцита и АПК
CD8+ Т-клетки под воздействием Т-хелперов и цитокинов, в частности IL-2, дифференцируются в Т-киллеры (цитотоксические клетки) и Т-клетки памяти. Цитотоксические клетки в дальнейшем приобретают способность разрушать клетки, несущие на своей поверхности определенный антиген.
Из вышеизложенного следует, что ключевым звеном в развитии иммунного ответа при АЗ является селекция и активация аутореактивных клонов с их последующей дифференцировкой в эффекторные клетки.
Много исследований посвящено изучению и разработке селективных методов иммуносупрессии. Существует ряд наиболее охарактеризованных моделей АЗ, которые могут быть сопоставимы с клиническими аналогами АЗ. Для изучения аутоиммунной патологии применяется достаточно широкий спектр моделей, основанных на трансгенных животных. Подобные модели позволяют, в известной степени, охарактеризовать роль определенных элементов иммунной системы и сигнальных механизмов в условиях нормы и патологии на животных с выключенными генами цитокинов TGF-1, [13] IL-6 [63,65] и IL-8 [7], INFa[51], мембранных рецепторов лимфоцитов и их лигандов (CD28 [8], CTLA-4 [9], CD3-i; [57], СЭЗ-лС [47] СЭЗ-л [58]), а также некоторых адгезивных молекул (L-селектин [3]).
Использование моделей на животных, безусловно, подразумевает определенные ограничения при экстраполяции данных на АЗ, наблюдаемые у человека, но является важным инструментом для изучения патологии при аутоиммунных поражениях.
Разработан и применяется ряд модельных линий животных, у которых спонтанно развиваются аутоиммунные нарушения. К ним относятся модели мышей линии NZB, у которых аутоиммунная гемолитическая анемия развивается через 5-6 месяцев после рождения в связи с продукцией и накоплением антиэритроцитарных антител класса IgG [61]. Аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура развивается спонтанно у мышей линии (NZW х BXSB) F1, вырабатывающих антитела к тромбоцитам [52]. Сюда можно отнести также мышей линии NOD (nonbese diabetic) [19]: развитие аутоиммунного сахарного диабета у них связано с нарушением как от-
рицательной [37], так и положительной селекции [75] аутореактивных клонов лимфоцитов в тимусе, а также определенным гаплотипом молекул ГКГС [68]. В подобной модели у крыс линии Biobreeding развитие аутоиммунного сахарного диабета связано также с выраженными нарушениями функций тимического эпителия и нарушениями отрицательной селекции [18].
Модель сахарного диабета II типа обусловлена врожденным нарушением взаимодействия гормона жировой ткани лептина с его рецептором [10]. Сложность использования таких линий в качестве моделей для изучения действия иммуномодуляторов заключается в том, что воздействие на генетически детерминированные иммунные нарушения должно проводится лишь с помощью методов генотерапии, что в настоящее время существенно ограничивает применение таких моделей для разработки новых лекарственных средств.
Модели, основанные на переносе аутореактивных клонов тимоцитов группам здоровых животных, подтверждают возможность развития аутоиммунного поражения при нарушении отрицательной селекции аутореактивных клонов в тимусе [31] и позволяют моделировать аутоиммунные поражения, основанные на клеточном иммунном ответе. Подобным образом может быть индуцирован, например, экспериментальный энцефаломиелит, представляющий собой демиелинизирующую болезнь центральной нервной системы воспалительного характера, что позволяет, с некоторыми ограничениями, использовать эту модель в качестве модели развития болезни Альцгеймера. Подобным же образом можно воспроизвести модель аутоиммунного неврита, вводя крысам Lewis специфичные активированные Т-лимфоциты, распознающие белок Р2 [41].
Эффективным методом является иммунизация животных либо чужеродными антигенами, имеющими эпитопы, сходные с антигенами собственного организма, либо «забарьерными» антигенами собственного организма: таким способом можно индуцировать экспериментальный энцефаломиелит у мышей линий SJL или крыс Льюиса, проводя иммунизацию миелином или производными миелина, например, основным белком миелина (МВР), белком протеолипида миелина (PLP), или пептидами, производными этих белков [77].
Иммунизация позвоночных животных пептидами ацетил'холинового рецептора электрического ската Torpedo califomica с полным адъювантом Фрейнда приводит к развитию иммунного поражения аце-тилхолиновых рецепторов. Таким способом воспроизводится модель с клинико-иммунологическими проявлениями, свойственными Myasthenia gravis [39, 60].
Модель экспериментального аутоиммунного ти-реоидита, используемая для исследований в качестве
модели болезни Хашимото, индуцируется иммунизацией мышей восприимчивых линий мышиным тиреоглобулином [36]. В качестве примера применения для воспроизведения модели гетерогенного антигена можно привести модель ревматоидного артрита. Путем интраперитонеального введения фрагментов клеточной стенки стрептококка группы А можно индуцировать модель ревматоидного артрита [30]. Однократное введение компонентов гомо-или гетерологичной гломерулярной базальной мембраны с полным адъювантом Фрейнда крысам линии Вистар (WKY) вызывает продукцию антител к гломерулярной базальной мембране и развитие в эксперименте синдрома Гудпасчера [6, 71]. Более эффективно эта модель индуцируется иммунизацией альфа-3 цепью коллагена IV типа [38, 72]. Аутоиммунное поражение, сходное с синдромом Гудпасчера, может быть вызвано также более простым методом: введением гетерологичных антител к альфа-3 цепи коллагена IV типа [53].
Другим, несомненно, более сложным и дорогим, но в то же время перспективным методом иммунизации, является применение ДНК-вакцинации. Метод основан на способности нуклеиновых кислот существовать несколько недель и даже месяцев в цитоплазме клеток организма-хозяина, не встраиваясь в его геном, но поддерживая синтез белков. Так, например, достаточно сложно получить необходимое для иммунизации количество очищенного рецептора тиреостимулирующего гормона гипофиза, поэтому с наиболее полными проявлениями и максимально эффективно (у 17% иммунизированных животных) мышиная модель аутоиммунного тиреоидита была индуцирована иммунизацией введением последовательности копийной ДНК, кодирующей человеческий рецептор тиреостимулирующего гормона гипофиза [14].
Углубленное изучение молекулярных механизмов развития иммунного ответа позволяет все более широко использовать методы, направленные на достижение иммуносупрессивного эффекта на определенных стадиях развития как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Рассматривая отдельно методологию подобного «точечного» воздействия, можно выделить несколько возможных подходов. Иммунный ответ можно блокировать при помощи моноклональных антител (мАт), блокирующих взаимодействие рецепторов, участвующих в регуляции иммунного ответа и их лигандов. Так, моноклональные антитела (мАт) к лиганду рецептора Fas были применены для лечения волчаночного нефрита у мышей линий NZB/NZW [54]. Блокада CTLA-4 при помощи анти-СТЬА-4 мАт усиливает реакцию Т-лимфоцитов на стимуляцию in vitro и in vivo [79]. Антитела к CD40L были использованы для лечения в модели болезни Альцгеймера (экспериментального энцефаломиелита) [29]. В последнее время при-
меняются также рекомбинантные, обладающие меньшей иммуногенностью, мАт к адгезивным молекулам, например, рекомбинантные анти-С018 были впервые использованы в клинической практике для лечения больных некоторыми формами васкулитов [45]. Однако иммуногенность вводимых с терапевтическими целями мАт и связанная с этим продукция нейтрализующих антител оставляет дискуссионным вопрос о перспективности развития этого направления исследований.
Методы генной инженерии позволяют получить и выделить белки, представляющие собой модифицированные при помощи рекомбинантных технологий естественные цитокины, рецепторы или их части, лиганды и антитела. Применение рекомбинантных протеинов предоставляет широкие возможности для супрессии иммунного ответа при помощи растворимых молекул, блокирующих взаимодействие рецепторов, участвующих в регуляции иммунного ответа, с их лигандами. Были произведены эксперименты по блокированию дополнительного сигнала с рецептора CD28 [25, 40]. Способность протеина CTLA-4Ig связывать В7 с более высокой авидно-стью обусловило его использование в качестве агента, разрывающего связь CD28-B7 in vivo [43]. Finck с соавт. [25] вводили самкам мышей трижды в неделю CTLA-4Ig в течение 4 месяцев, предшествующих типичному сроку начала клинических проявлений болезни. Подобное лечение рекомбинантным протеином предотвращало выработку аутоантител к ДНК, способствовало сохранению функции почек и продлевало жизнь экспериментальных животных. Даже когда лечение было отсрочено до поздних стадий болезни, введение CTLA-4Ig замедляло выработку аутоантител и прогрессирование болезни, а также улучшало показатели выживаемости.
CTLA-4Ig успешно использовался и на некоторых других экспериментальных моделях индуцированных аутоиммунных заболеваний, например, на модели экспериментального энцефаломиелита [5]. На модели волчаночного нефрита мышей была осуществлена попытка его лечения растворимой формой CD16 (sCD16), представляющей собой Fc-pe-цептор IgG третьего типа (FcyRIII) [80]. Успешное блокирование взаимодействия Fas - Fas-лиганда было произведено при помощи рекомбинантного протеина FAS-Fc на мышиной модели сахарного диабета [46]. Интерес представляет возможность супрессии иммунного ответа при помощи разрыва взаимодействия рецептора CD40 с его лигандом [16]. Возможно воздействие и на более поздних стадиях иммунного ответа. Так, действие IL-1 и TNF может быть селективно заблокировано при помощи растворимых форм этих рецепторов, что было продемонстрировано в работе Arend W.P. с соавт. [4].
Несмотря на то, что генетическая основа большинства A3 не охарактеризована, одной из страте-
гий экспериментального лечения A3 представляется применение методов генотерапии. В данном случае рассматриваются методы, при которых эффект достигается за счет доставки в организм гена, синтетические продукты которого обладают иммуномодулирующими свойствами. Такими продуктами могут быть как белки, так и различные молекулы РНК: рибозимы и антисмысловые последовательности РНК. Кроме того, следует выделить ДНК-вакцина-цию [23]. В широком смысле слова цель генотерапии состоит не только в переносе и синтезе продуктов неких олигонуклеотидов, а также в модуляции экспрессии генов в определенных клетках. Производились исследования по генотерапии сахарного диабета, болезни Альцгеймера, системной красной волчанки и ревматоидного артрита [22].
При сравнении с другими методами генотерапия позволяет избежать сложностей, связанных с доставкой иммуномодулирующих белков или РНК в организм, и имеет заметное преимущество, связанное с длительностью эффекта. Доставка может осуществляться посредством вирусных или плазмидных [62, 74] векторов, катионных липосом [15] и генетически модифицированных Т-лимфоцитов [12, 50].
Простейший вектор содержит, как правило, подходящий промотер, ген интереса, полиаденилирован-ную последовательность и при необходимости другие цис-элементы [70]. Гораздо большей эффективностью обладают вирусные векторы [69]. В настоящее время наиболее интенсивно изучается применение четырех групп вирусных векторов: ретровирусных, аденовирусных, производных вируса простого герпеса (HSV) и аденоассоциированных вирусов (AAV).
Одним из недостатков применения ретровирусных векторов является отсутствие у многих из них способности трансфецировать неделящиеся клетки, а также возможности мутагенеза при свойственной ретровирусам случайной интеграции в геном [64]. Большой интерес представляют ретровирусные векторы - производные лентивирусов, которые способны трансфецировать неделящиеся клетки [55].
Преимуществом аденоассоциированных вирусов является сайт-специфическая трансфекция в 19 хромосому, при которой уменьшается вероятность мутагенеза. Спорным остается факт интеграции рекомбинантных аденоассоциированных векторов, но, тем не менее, они обеспечивают длительную экспрессию гена интереса на моделях in vivo [35]. Существенными недостатками аденоассоциированных векторов представляются относительно небольшие размеры гена интереса (около 4 т.п.н.), а также сложность их получения [28].
Векторы - производные аденовирусов обеспечивают низкий уровень интеграции в геном, но широко используются в связи с легкостью получения в высоких титрах и трансфецирования неделящихся
клеток, кроме того, они позволяют получать довольно высокий уровень экспрессии. К недостаткам этой группы векторов можно отнести иммунный ответ, развивающийся при введении и экспрессии рекомбинантных аденовирусных векторов. В связи с этим применение аденовирусных векторов имеет значение для достижения высокого уровня экспрессии на ограниченный период времени [21]. Внутривенное или внутрибрюшинное введение некоторых аденовирусных векторов вызывает развитие гепатита у мышей.
Применение векторов, полученных на основе вируса простого герпеса, дает возможность вставки в вектор больших фрагментов (порядка 30 т.п.н.). Представляет также интерес возможность использования нейротропности вируса простого герпеса. Сложность получения и высокая цитотоксичность в существенной мере ограничивают применение этой группы векторов.
При использовании генотерапии для лечения A3 возникают две основные, и пока не разрешимые в полной мере, проблемы: целенаправленная доставка генетического материала в ткани, подвергающиеся аутоиммунному поражению и контроль экспрессии доставляемого гена.
При лечении экспериментальных моделей A3 применяется также ДНК-вакцинация. Суть метода заключается в том, что при подкожном или внутримышечном введении ДНК, кодирующей определенный продукт, развивается иммунная реакция направленная на нейтрализацию этого продукта [67]. Метод был использован для иммунизации крыс к TNF, МСР-1 и М1Р-1а [83]. На модели экспериментального энцефаломиелита применение этого метода привело к выработке нейтрализующих антител к вышеупомянутым протеинам и снижению тяжести заболевания [84]. На этой же модели может быть применена стратегия вакцинирования против аутореактивных лимфоцитов, когда для вакцинации используют последовательности, кодирующие фрагменты рецепторов Т-лимфоцитов [27].
Как уже было упомянуто, при помощи различных векторов можно доставлять гены, синтетические продукты которых обладают иммуномодулирующими свойствами. Прежде всего, подобные эксперименты направлены на продукцию белков, блокирующих активацию Т-лимфоцитов. Так, была произведена трансфекция крысиной модели экспериментального энцефаломиелита геном, кодирующим CTLA-4Ig [34]. Другой возможной точкой приложения этого метода может служить разрыв взаимодействия рецептора CD40 с его лигандом.
Необходимо отметить, что, в зависимости от вектора и ткани-мишени, доставка гена может производиться in vivo или ex vivo. Доставка in vivo подразумевает введение вектора непосредственно в организм пациента, a ex vivo предполагает получение клеток
организма пациента с последующей модификацией in vitro и реимплантацией в организм. Несмотря на то, что тактика in vivo представляется менее трудоемкой, она не всегда подходит для клинического применения, особенно с позиций безопасности. Кроме того, выделенные клетки ex vivo могут быть транс-фецированы в специальных условиях, тщательно протестированы и отобраны перед реимплантацией в организм пациента. Еще одной положительной чертой тактики ex vivo является возможность трансфекции клеток, находящихся в различных фазах деления, что может быть опасным при использовании некоторых вирусных векторов.
Одной из положительных сторон применения тактики ex vivo при лечении АЗ является также и то обстоятельство, что при трансфекции в Т-лимфоци-ты, за счет миграции трансфецированных клеток при развитии иммунного ответа обеспечивается доставка гена непосредственно на место развития аутоиммунного поражения. Например, трансфецированные IL-10 [50] и TGF-P [11] Т-лимфоциты были успешно использованы для лечения экспериментального энцефаломиелита. Трансфекция в АПК гена Fas-ли-ганда позволила достичь элиминации аутореактивных клонов Т-лимфоцитов при взаимодействии Fas-рецептора на их поверхности с Fas-лигандом на АПК [85].
Помимо описанных выше методов, определенный интерес может представлять органоспецифическая доставка генов, продукты которых вызывают превращение предшественников цитостатических препаратов в активные формы. Таким способом можно существенно улучшить эффект цитостатической терапии, обеспечивая при этом минимизацию побочных эффектов.
Применение современных технологий для создания иммуносупрессивных агентов создает основу для принципиально нового подхода к изучению и лечению аутоиммунных болезней, который основывается на избирательном воздействии на отдельные механизмы регуляции иммунного ответа. Необходимо отметить, что достижение некоторого иммунносупрессивного эффекта возможно при эффективном блокировании взаимодействия клеточных и гуморальных составляющих иммунного ответа практически на любой стадии - от формирования аутореактивных клонов, их активации и экспансии, до предотвращения развития более поздних стадий иммунного ответа. При этом «мишенью» действия иммуномодулирующих препаратов могут служить:
- адгезивные молекулы, участвующие в эффективном взаимодействии АПК с лимфоцитами и обеспечивающие миграцию лимфоцитов к очагу аутоиммунного поражения;
- рецепторы, обеспечивающие антигенспецифи-ческую активацию В- и Т-лимфоцитов и взаимодействие аутореактивных субпопуляций;
- цитокины, обеспечивающие эффекторные функции клеточных элементов и участвующие в дальнейшем развитии иммунного ответа.
Развитие иммунного ответа можно блокировать при помощи моноклональных антител (мАт), естественных и модифицированных при помощи рекомбинантных технологий цитокинов и рецепторов, участвующих в регуляции иммунного ответа, или их лигандов. Применение рекомбинантных протеинов на охарактеризованных моделях in vivo, дает возможность проводить поиск терапевтических агентов, обладающих наименьшими побочными действиями на определенной стадии развития АЗ.
В настоящее время представляется преждевременным говорить об обширном использовании методов генотерапии и ДНК-вакцинации для модуляции иммунного ответа при АЗ. Несмотря на большой потенциал этих методов, их широкое применение сдерживается из-за технологических ограничений. Дальнейшие исследования, несомненно, могут расширить возможности применения этих методов и заложить основу для нового этапа развития экспериментальной и клинической иммунологии.
Список литературы
1. Иммунология. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., М.: Медицина, 2000
2. Клиническая иммунология. Под ред. А.В. Караулова, М.: Медицинское Информационное Агентство, 1999
3. Arbones ML, Ord DC, Ley К, Ratech H, May-nard-Curry C, Otten G, Capon DJ, Tedder TF: Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficient mice. // Immunity 1994, 1: 247-260.
4. Arend WP, Dayer JM: Inhibition of the production and effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum 38:151-160, 1995
5. Arnason BG. Relevance of experimental autoimmune encephalo-myelitis to multiple sclerosis. //Neural. Clin. 1983, 1: 765.
6. Bolton, W.K., May, W.J., Sturgill, B.C. Proliferative autoimmune glomerulonephritis in rats: a model for autoimmune glomerulonephritis in humans. // Kidney Int. 1993, 44:294-306.
7. Cacalano G, Lee J, Kikly K, Ryan AM, Pitts-Meek S, Hultgren B, Wood WI, Moore MW: Neutrophil and В cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. // Science 1994, 265: 682-684.
8. Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphop-roliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells. / / Immunity 1997, 7: 885-895.
9. Chambers CA, Sullivan TJ, Truong T, Allison JP. Secondary but not primary T cell responses are enhanced
in CTLA-4-deficient CD8+ Т cells. // Eur J Immunol 1998, 28: 3137-3143.
10. Chen H. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor in db/db mice. // Cell 1996, 84: 491 -495
11. Chen LZ, Hochwald GM, Huang C, Dakin G, Tao H, Cheng C, Simmons WJ, Dranoff G, Thorbecke GJ: Gene therapy in allergic encephalomyelitis using myelin basic protein-specific T cells engineered to express latent transforming growth factor-betal. // Proc Natl Acad Sei USA 95:12516 -12521, 1998
12. Chernajovsky Y., Adams G„ Triantaphyllopou-los K., Ledda M.F. and Podhajcer O. L. Pathogenic lymphoid cells engineered to express TGF beta 1 ameliorate disease in a collagen-induced arthritis model. // Gene Ther, 1997, 4:553-559.
13. Christ M, McCartney-Francis NL, Kulkarni AS, Ward JM, Mizel DE, Mackall CL, Gress RE, Hines KL, Tian H, Karlsson S, Wahl SM. Immune dysregulation in TGF-1-deficient mice.//J Immunol 1994,153:1936-1946.
14. Costagliola S, Many M-C, Denef J-F, Pohlenz J, Refetoff S, Vassart M. Genetic immunization of outbreed mice with thyrotropin receptor cDNA provides a model of Graves disease. //J Clin Invest 2000,105:803-811.
15. Croxford J.L., Triantaphyllopoulos K., Podhajcer O.L., Feldman M., Baker D. and Chernajovsky V. Cytokine gene therapy in experimental allergic encephalomyelitis by injection of plasmid DNA-cationic liposome complex into the central nervous system. // J. Immunol, 1998, 160:5181-5187.
16. Datta SK, Kalled SL: CD40-CD40 ligand interaction in autoimmune disease. // Arthritis Rheum 40:1735-1745, 1997
17. DeBenedette MA, Shahinian A, Mak TW, Watts TH: Costimulation of CD28- T lymphocytes by 4-IBB ligand. // J Immunol 1997, 158:551-559
18. Doukas, J.Thymic epithelial defects and predisposition to autoimmune disease in BB rats. // Am. J. Pathol. 1994, 145: 1517-1525
19. Elias D, Cohen IR. Peptide therapy for diabetes in NOD mice. // Lancet. 1994 Mar 19;343 (8899):704-6
20. Euler HH, Schroeder JO, Harten P. Treatment-free remission in severe systemic lupus erythematosus following synchronization of plasmapheresis with subsequent pulse cyclophosphamide. // Arthritis Rheum 1994;37:1784-1794
21. Evans CH, Ghivizzani SC, Oligino TJ, Robbins PD: Gene therapy for autoimmune disorders // J Clin Immunol, Vol. 20, No. 5, 2000
22. Evans CH, Ghivizzani SC, Whalen JD, Robbins PD: Gene therapy in autoimmune diseases. // Ann Rheum Dis 57:125-127, 1998
23. Evans CH, Robbins PD: Gene Therapy in Inflammatory Diseases. Basel, Birkhauser, 2000
24. Felts W, Yelin E. The economic impact of rheu-
matic diseases in the United States // J Rheum 1989; 16: 867-884
25. Finck, B., Linsley, P., Wofsy, D. Treatment of murine lupus with CTLA4Ig. // Science 1994,265:1225
26. Fudenberg HH. Genetically determined immune deficiency as the predisposing cause of "autoimmunity" and lymphoid neoplasia // Am J Med. 1971 Sep;51(3):295-8.
27. Godillot AP, Madaio M, Weiner DB, Williams WV: DNA vaccination as an anti-inflammatory strategy. In Gene Therapy in Inflammatory Diseases, CH Evans, PD Robbins (eds). Basel, Switzerland, Birkhauser Verlag, 2000, pp 205-229
28. Herzog RW, Hagstrom JN, Kung SH, Tai SJ, Wilson JM, Fisher KJ, High KA: Stable gene transfer and expression of human blood coagulation factor IX after intramuscular injection of recombinant adeno-as-sociated virus. // Proc Natl Acad Sei USA 94:5804 -5809, 1997
29. Howard LM, Miga AJ, Vanderlugt CL, Dal Canto MC, Laman JD, Noelle RJ, Miller SD: Mechanisms of immunotherapeutic intervention by anti-CD40L (CD 154) antibody in an animal model of multiple sclerosis. //J Clin Invest 103:281-290, 1999
30. Hunter N, Anderle SK, Brown RR, Dalldorf FG, Clark RL, Cromartie WJ, Schwab JH. Cell-mediated immune response during experimental arthritis induced in rats with streptococcal cell walls. // Clin Exp Immunol. 1980 Dec;42(3):441-9
31. Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, Otsuka F and Sakaguchi S (1999) Thymus and autoimmunity: production of CD25+ CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance. //J Immunol, 162:5317-5326.
32. Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of selected autoimmune diseases in the United States // Clin Immunol Immunopathol. 1997 Sept 84 (3): 223-43
33. June CH, Ledbetter JA, Lindsten T, Thompson CB, Evidence for the involvement of three distinct signals in the induction of IL-2 gene expression in human T lymphocytes //J Immunol. 1989 Jul 1;143(1):153-61
34. Kawaguchi Y: A gene therapy or purified CTLA4IgG treatment of experimental allergic encephalomyelitis. // Hokkaido Igaku Zasshi 74:467- 475,1999
35. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ: Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. // Proc Natl Acad Sei USA 93:14082-14087,1996
36. Kong YC, Rose NR, Elrehewy M, Michaels R, Giraldo AA, Accavitti MA, Leon MA. Thyroid alloanti-gens in autoimmunity. //Transplant Proc. 1980 Sep; 12 (3 Suppl l):129-34
37. Lamhamedi-Cherradi, S.E.Resistance of T cells to apoptosis in autoimmune diabetic (NOD) mice is in-
creased early in life and is associated with dysregulated expression of Bcl-x. // Diabetologia, 1998,41:178-184
38. Leinonen A, Netzer KO, Boutaud A, Gunwar S, Hudson BG, Goodpasture antigen: expression of the full-length alpha 3(IV) chain of collagen IV and localization of epitopes exclusively to the noncollagenous domain. // Kidney Int, 1999, 55:926-935.
39. Lennon, V., Lindstrom, J., Seybold, M. E., Experimental autoimmune myasthenia (EAMG): A model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs. //I. Exp. Med. 141, 1365-1375,1975.
40. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G„ Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig. // Science
1992, 257, 789
41. Leussink I, Zettl K, Jander S, Pepinsky B, Lobb R, Stoll G, Toyka V, Gold R. Blockade of signaling via the very late antigen (VLA-4) and its counterligand vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) causes increased T cell apoptosis in experimental autoimmune neuritis. // Acta Neuropathol (Berl). 2002 Feb;103(2):131-6
42. Lindstein T, June CH, Ledbetter JA, Stella G, Thompson CB, Regulation of lymphokine messenger RNA stability by a surface-mediated T cell activation pathway. //Science. 1989 Apr 21 ;244(4902):339-43
43. Linsley PS, Wallace PM, Johnson J, Gibson MG, Greene JL, Ledbetter JA, Singh C, Tepper MA, Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T cell activation molecule. // Science. 1992 Aug 7;257(5071):792-5
44. Linsley, P.S., Ledbetter, J.A. The role of CD28 receptor during T cell responses to antigen. // Annu. Rev. Immunol. 1993, 11:191-212
45. Lockwood CM, Elliott JD, Brettman L, Hale G, Rebello P, Frewin M, Ringer D, Merrill C, Waldmann H. Anti-adgesion molecule therapy as an interventional strategy for autoimmune inflammation. // Clin Immunol, 1999; Vol. 93 (2) Nov; 93-106
46. Mahiou J, Walter U, Lepault F, Godeau F, Bach J-F, Chatenoud L. In vivo blokade of the Fas-Fas ligand pathway inhibits cyclophosphamide-induced diabetes in NOD mice. //J Autoimm. 2001; 16: 431-40.
47. Malissen M, Gillet A, Rocha B, Trucy J, Vivier E, Boyer C, Kontgen F, Brun N, Mazza G, Spanopoulou E, Guy-Grand D, Malissen B: T cell development in mice lacking the CD3-h/z gene.//EMBOJ 1993,12:4347-4355.
48. Markenson JA. Worldwide trends in the socioeconomic impacts and long-term prognosis of rheumatoid arthritis // Seminars in Arthritis and Rheumatism 1991; 21 (Suppl.): 4-12
49. Marmont AM. Immune ablation followed by allogeneic or autologous bone marrow transplantation: a new treatment for severe autoimmune diseases? // Stem Cells 1994;12:125-135
50. Mathisen PM, Yu M, Johnson JM, DrazbaJA, Tuohy VK: Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with genetically modified memory T cells. //J Exp Med 186:159 -164,1997
51. Matsuyama T, Kimura Y, Kitagawa M, Pfeffer K, Kawakami T, Watanabe N, Kundig TM, Amakawa R, Kishihara K, Wakeham A: Targeted disruption of IRF-1 or IRF-2 results in abnormal type IIFN gene induction and aberrant lymphocyte development. // Cell
1993, 75: 83-97.
52. Mizutani H, Engelman RW, Kurata Y, Ikehara S, Good RA. Development and characterization of monoclonal antiplatelet autoantibodies from autoimmune thrombocytopenic purpura-prone (NZW x BXSB)F1 mice. // Blood, 82:837-844.
53. Nagai H, Takizawa T, Nishiyori T, Koda A. Experimental glomerulonephritis in mice as a model for immunopharmacological studies. // Jpn J Pharmacol. 1982 Dec;32 (6):1117-24
54. Nakajima A, Hirai H, Kayagaki N, Yoshino S, Hirose S, Yagita H, Okumura K. Treatment of lupus in NZB/W FI mice with monoclonal antibody against Fas ligand. //J Autoimm, 2000,14; 151-57
55. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D: In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a len-tiviral vector. // Science 272:263-267, 1996
56. Nelson JL, Torrez R, Louie FM. Pre-existing autoimmune disease in patients with long-term survival after allogeneic bone marrow transplantation. //J Rheumatol Suppl 1997;48:23-29
57. Ohno H, Aoe T, Taki S, Kitamura D, Ishida Y, Rajewsky K, Saito T:Developmental and functional impairment of T cells in mice lacking CD3z Chains. // EMBOJ 1993,12: 4357-4366.
58. Ohno H, Goto S, Taki S, Shirasawa T, Nakano H, Miyatake S, Aoe T, Ishida Y, Maeda H, Shirai T, Rajewsky K, Saito T: Targeted Disruption of the CD3h locus causes high lethality in mice: modulation of Oct-1 transcription on the opposite strand. // EMBOJ 1994, 13: 1157-1165.
59. Pandey JP, Fudenberg HH. Immunogenetic markers in autoimmune disease // Ann Intern Med. 1984 Dec;101(6):868-9.
60. Patrick, J., Lindstrom, J. M., Autoimmune response to acetylcholine receptor. // Science 180, 871-872, 1973
61. Perry FE, Barker RN, Mazza G, Day MJ, Wells AD, Shen C-R, Schofield AE, Elson CJ. Autoreactive T-cell specificity in autoimmune hemolytic anemia of the NZB mouse. // Eur J Immunol, 1996, 26:136-141.
62. Piccirillo C.A., Chang Y. and Prud'homme G.J. TGF-betal somatic gene therapy prevents autoimmune disease in nonobese diabetic mice. //J. Immunol., 1998, 161:3950-3956.
63. Poli V, Balena R, Fattori E, Markatos A, Yamamoto M, Tanaka H, Ciliberto G, Rodan GA, Costantini
F:Interleukin-6 deficient mice are protected from bone loss caused by estrogen depletion.//EMBOJ 1994,13: 1189-1196.
64. Powell SK, Kaloss M, Burimski I, Weaver L, Long Z, Lyons R, McGarrity GJ, Otto E: In vitro analysis of transformation potential associated with retroviral vector insertions. // Hum Gene Ther 10:2123-2132, 1999
65. Ramsey AJ, Husband AJ, Ramshaw IA, Bao S, Matthaei KI, Kohler G, Kopf M:The role of interleu-kin-6 in mucosal IgA antibody responses in vivo. // Science 1994, 264: 561-563.
66. Reiser H, Stadecker MJ. Costimulatory B7 molecules in the pathogenesis of infectious and autoimmune diseases. // N Engl J Med 1996; 335:1369-77
67. Restifo NP, Ying H, Hwang L, Leitner WW: The promise of nucleic acid vaccines. // Gene Ther 7:89 -92, 2000
68. Ridgway, W.M. A new look at MHC and autoimmune disease. // Science 1999, 284: 749-751
69. Robbins PD, Ghivizzani SC: Viral vectors for gene therapy. // Pharmacol Ther 80:35- 47, 1998
70. Robbins PD: Gene Therapy Protocols. Totowa, NJ, Humana Press Inc., 1997
71. Sado, Y., Naito, I. Experimental autoimmune glomerulonephritis induced in rats by soluble isologous or homologous antigens from glomerular and tubular basement membranes. // Br. J. Exp. Pathol. 1987, 68:695-704.
72. Saus J, Wieslander J, Langeveld J, Quinones S, Hudson B, Identification of the Goodpasture antigen as the 3(IV) chain of collagen IV. //J Biol Chem, 1988, 263:13374-13380
73. Shuford WW, Klussman K, Tritchler DD, Loo DT, Chalupny J, Siadak AW, Brown TJ, Emswiler J, Raecho H, Larsen CP: 4-1 BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cell responses. //J Exp Med 1997, 186: 47-55.
74. Song X., Gu M., Jin W., Klinman D. and Wahl
S.M. Plasmid DNA encoding transforming growth factor-1 suppresses chronic disease in a streptococcal cell wall-induced arthritis model. //J. Clin. Invest., 1998, 101:2615-2621.
75. Thomas-Vaslin, V. Abnormal T-cell selection on NOD thymic epithelium is sufficient to induce autoimmune manifestations in C57BL/6 athymic nude mice. / / Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1997,94: 4598-4603
76. Thompson CB, Lindsten T, Ledbetter JA, Kunkel SL, Young HA, Emerson SG, Leiden JM, June CH, CD28 activation pathway regulates the production of multiple T-cell-derived lymphokines/cytokines // Proc Natl Acad Sei USA. 1989 Feb;86(4):1333-7
77. Touhy, V. K., Lo, Z., Sobel, R. A., Laursen, R. A., Lees, M. B. Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein for SJL mice. //J. Immunol. 1989,142,1523-1527.
78. Vinay DS, Kwon BS: Role of 4-IBB in immune responses. // Semin Immunol 1998, 10:481-489.
79. Walunas TL, Lenschow DJ, Bakker CY, Linsley PS, Freeman GJ, Green JM, Thompson CB, Bluestone JA. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. // Immunity 1994, 1: 405-413.
80. Watanabe H, Sherris D, Gilkeson GS. Soluble CD 16 in the treatment of murine lupus nephritis. // Clin Immunol Immunopathol, 1998; Vol. 88 (1); 91-95
81. Wulffraat NM, van Royen A, Vossen JP. Autologous bone marrow transplantation in refractory polyarticular and systemic JCA. // Bone Marrow Transplant 1998;21(suppl 1):50
82. Wülfing C, Davis MM: A receptor/cytoskeletal movement triggered by costimulation during T cell activation. // Science 1998, 282: 2266-2269.
83. Youssef S, Wildbaum G, Karin N: Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by MIP-lalpha and MCP-1 naked DNA vaccines. //J Autoim-mun 13:21-29, 1999
84. Youssef S, Wildbaum G, Maor G, LanirN, Gour-Lavie A, Grabie N, Karin N: Long-lasting protective immunity to experimental autoimmune encephalomyelitis following vaccination with naked DNA encoding C-C chemokines. //J Immunol 161:3870 -3879, 1998
85. Zhang HG, Liu D, Heike Y, Yang P, Wang Z, Wang X, Curiel DT, Zhou T, Mountz JD: Induction of specific T-cell tolerance by adenovirus-transfected, Fas ligand-producing antigen presenting cells. // Nat Bio-technol 16:1045-1049, 1998
поступила в редакцию 20.09.2002 принята к печати 10.01.2003
