CC BY
491
Для корреспонденции
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских
наук, заведующая лабораторией оценки безопасности
биотехнологий и новых источников пищи
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-64
E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Тышко Н.В.1, Садыкова Э.О.1, Сухачева М.В.2, Батурин А.К.1
Молекулярно-генетические исследования генно-инженерно-модифицированного картофеля: трансформационное событие PH05-026-0048
1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
2 ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
2 Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow
Характеристика и оценка специфичности методов идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) направлены на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО. Специфичность праймерной системы для идентификации трансформационного события PH05-026-0048 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени экспериментально подтверждена в исследованиях с другими генно-инженерно-модифицированными (ГМ) линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Эффективность, линейность и правильность метода соответствуют требованиям Международной лаборатории Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Предел обнаружения и количественного обнаружения геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 составляет соответственно 0,019% (11 копий геномной ДНК ГМ-картофеля) и 0,06% (36 копий геномной ДНК ГМ-картофеля) из расчета на 100 нг суммарной ДНК.
Ключевые слова: генно-инженерно-модифицированный картофель, методы контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами, трансформационное событие PH05-026-0048
Для цитирования: Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Сухачева М.В., Батурин А.К. Молекулярно-генетические исследования генно-инженерно-модифицированного картофеля: трансформационное событие PH05-026-0048 // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 25-31. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10038.
Статья поступила в редакцию 24.11.2017. Принята в печать 13.07.2018.
For citation: Tyshko N.V., Sadykova E.O., Sukhacheva M.V., Baturin A.K. Molecular and genetic studies of genetically engineered potato: transformation event PH05-026-0048. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 25-31. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10038. (in Russian) Received 24.11.2017. Accepted for publication 13.07.2018.
Molecular and genetic studies of genetically engineered potato: transformation event PH05-026-0048
Tyshko N.V.1, Sadykova E.O.i, Sukhacheva M.V.2, Baturin A.K.i
Expert evaluation of genetically engineered organisms (GMO) identification methods is aimed at confirmation their adequacy with the tool and methodological base used in the institutions of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing to control market turnover and labelling of genetically engineered food. The primer system's specificity was experimentally confirmed in studies with other GM potato lines, as well as with the results of the BLAST-analysis. The efficiency, linearity and correctness of the method meet the requirements of the European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed. Limit of detection and limit of quantification of GM potato line PH05-026-0048 genomic DNA were 0.019% (11 copies of the GM potato genomic DNA) and 0.06% (36 copies of the GM genomic DNA of the potato) per 100 ng of total DNA, respectively.
Keywords: genetically engineered potato, methods of control over genetically engineered organisms, transformation event PH05-026-0048
В соответствии с законодательством РФ и Евразийского экономического союза (ТР ТС 015/2011, ТР ТС 021/2011, ТР ТС 022/2011, ТР ТС 023/2011, ТР ТС 024/2011, ТР ТС 027/2012, ТР ТС 029/2012, постановление Правительства РФ от 23.09.2013 № 839) пищевая продукция, полученная с использованием генно-инже-нерно-модифицированных организмов (ГМО), относится к категории новых пищевых продуктов, которая до выхода на рынок проходит процедуру государственной регистрации. В рамках данной процедуры должны быть выполнены молекулярно-генетические исследования и санитарно-эпидемиологическая экспертиза ГМО, предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов [1, 2]. Молекулярно-генетические исследования предусматривают проведение медико-генетической оценки, а также характеристику и оценку специфичности методов идентификации ГМО. Исследования включают Б1_АвТ-анализ праймеров и зондов, определение характеристик и показателей точности метода, экспериментальное подтверждение специфичности метода в исследованиях с другими ГМО.
Исходя из сложившейся практики контроля основным методом обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Несмотря на то что для не подвергавшихся технологической переработке пищевых продуктов и продовольственного сырья могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков, универсальность, специфичность и простота ПЦР делают ее методом выбора при лабораторных исследованиях.
Генно-инженерно-модифицированный (ГМ) картофель линии РН05-026-0048 содержит в геноме кассеты экспрессии генов 03-гр1 и ЛЬ1аэ, детерминирующих устойчивость соответственно к фитофторозу и к гербициду имидазолинону. Экспрессию 08-гр1 регулируют промотор р-гр'1 и терминатор ^гр1, которые не входят в перечень регуляторных генетических элементов, определяемых в рамках рутинного контроля за ГМО; экспрессию ЛЬав регулируют промотор рЫОЗ и терминатор tNOS, которые, напротив, могут быть выявлены в процессе скри-нинговых лабораторных исследований пищевой продукции. Таким образом, обнаружение ГМ-картофеля линии
PH05-026-0048 на основании детекции маркерных регу-ляторных элементов не представляет проблемы, однако метод идентификации трансформационного события и количественного определения этого ГМО в настоящее время не входит в список утвержденных в Российской Федерации.
Цель настоящей работы - подтверждение характеристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, что необходимо для внедрения данного метода в практику надзорной службы.
Материал и методы
Исследования проведены с использованием сертифицированных стандартных образцов (Certified Reference Material, CRM) ERM-BF435a (0% ГМО, немодифициро-ванный картофель) и ERM-BF435b (100% ГМ-картофель линии PH05-026-0048).
Метод идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR, позволяет определять содержание реком-бинантной ДНК относительно общей ДНК картофеля, присутствующей в образце. Протокол ПЦР разработан и валидирован European Commission Joint Research Centre [3].
Идентификация трансформационного события выполнена с использованием пары праймеров, один из них расположен внутри перенесенной генетической конструкции, другой - в области геномной ДНК картофеля, прилегающей к трансгенной вставке, и олигонуклеотидного зонда с репортерным флуоресцентным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5'-конце и гасителем BHQ1, относящемся к семейству красителей Black Hole Quenchers, - на З'-конце (табл. 1) [3].
Для обнаружения целевого (референсного) гена картофеля (гена fru, кодирующего ß-фруктозидазу) использовали пару ген-специфичных праймеров и зонд, меченный FAM на 5'-конце, и BHQ1 - на З'-конце [3].
Праймеры и зонды синтезированы Научно-производственной компанией (НПК) «Синтол» (РФ). ПЦР-РВ про-
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для идентификации трансформационного события РН05-026-0048 и рефе-ренсного гена картофеля
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие PH05-026-0048
Прямой праймер 5'- TTG ATT TAT AGT CGA AGA TCT TTC AAA AAT AA
Обратный праймер 5'- GCT TGG CGT AAT CAT GGT CAT AG
TaqMan-зонд 5'- FAM- AAA GGA TAA TTT CAA TTT CAC ACA GG - BHQ-1
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген картофеля fru
Прямой праймер 5'- CTGCCTCCGTCAAGATTTGGTCACT
Обратный праймер 5'- CTCTTCCCTTTCTTGATGG
TaqMan-зонд 5'- FAM- ACTTGTAATTCATCAAGCCAT- BHQ-1
Здесь и в табл. 2-8: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Таблица 2. Объем реакционной смеси для амплификации (на 1 реакционную пробирку)
водили с использованием аналога 2x TaqMan Universal PCR Master Mix - 2,5x реакционной смеси для ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ROX (НПК «Син-тол», РФ), содержащего праймеры и зонды в концентрациях, указанных в табл. 2.
Для выделения ДНК применяли модифицированный метод щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии («Promega», США) [4]. Пригодность полученных препаратов ДНК для амплификации при последующей ПЦР подтверждали методом ПЦР по [5].
Для постановки ПЦР использовали амплификатор CFX96TM Real-Time PCR System («Bio-Rad», США) (табл. 3). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета CFX Manager™ Software, версия 1.6 («Bio-Rad», США).
Проверку специфичности праймерной системы для выявления генетической мишени в трансформационном событии РН05-026-0048 проводили с помощью качественного анализа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени по технологии TaqMan на препаратах ДНК ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, а также других ГМ-линий картофеля: ЕН92-527-1 (CRM, ERM-BF421b), AV43-6-G7 (CRM, ERM-BF431e) и традиционного аналога (CRM, ERM-BF435a). В качестве отрицательного контроля использовали пробу без ДНК-матрицы.
Анализ нуклеотидных последовательностей праймеров относительно референсного генома картофеля Solanum tuberosum проводили с помощью онлайн-сер-виса BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [6] базы данных GenBank, алгоритм BLASTN.
Относительное количество ГМ-картофеля PH05-026-0048 определяли на основании калибровочной кривой (график зависимости логарифма % концентрации от величины ДС для каждой калибровочной точки), для построения которой использовали стандарты - контрольные растворы с известным содержанием ДНК картофеля.
Эффективность, линейность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой троекратной амплификации.
Результаты и обсуждение
Специфичность праймерной системы для идентификации трансформационного события PH05-026-0048 методом ПЦР-РВ экспериментально подтверждена в исследованиях с другими ГМ-линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Данные анализа продуктов ПЦР с ГМ-специфичными и таксон-специфичными праймерами представлены на рис. 1 и в табл. 4.
Появление продукта ПЦР в реакции с праймерами, специфичными для конкретного трансформационного события, подтверждает присутствие в анализируемом образце искомой генетической конструкции, соответствующей линии PH05-026-0048, при этом отсутствие продукта ПЦР в реакциях с другими ГМ-линиями картофеля свидетельствует о специфичности данной прай-мерной системы.
Компонент Конечная концентрация Объем
ГМ-специфичная ДНК
Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ИОХ 2,5х 1x 10
Прямой праймер (10 мкМ) 200 hm 0,5
Обратный праймер (10 мкМ) 200 hm 0,5
TaqMan-зонд (5 мкМ) 200 hm 0,5
ДНК - 10,0
Деионизированная вода - 3,5
Итого 25 мм3
Таксон-специфичная ДНК
Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ИОХ 2,5х 1x 10
Прямой праймер (10 мкМ) 200 hm 0,5
Обратный праймер (10 мкМ) 200 hm 0,5
TaqMan-зонд (5 мкМ) 200 hm 0,5
ДНК - 10,0
Деионизированная вода - 3,5
Итого 25 ммз
Таблица 3. Температурно-временной профиль реакции
Стадия Процесс t, °C Время, с Количество циклов
I Начальная денатурация 95 600 1
II Амплификация денатурация 95 15 45
отжиг и элонгация 60 60
РН05-026-0048
fru
: 700 600 i 500 ■400 -300 флу200 100 - 0
10
20 30
Количество циклов
40
3- 700 1 600
1 500 ц
цен400
уорес300
■©■ 200
§ 100 в о
0
0
10
20 30
Количество циклов
40
Рис. 1. Кривые продуктов амплификации ДНК образцов картофеля с праймерами, специфичными трансформационному событию РН05-026-0048 и нуклеотидной последовательности гена картофеля 1ги
0
Таблица 4. Результаты анализа продуктов амплификации ДНК образцов картофеля с праймерами, специфичными трансформационному событию РН05-026-0048 и нуклеотидной последовательности гена картофеля 1ги
Образец Пороговый цикл Среднее значение порогового цикла
РН05-026-0048 fru РН05-026-0048 fru
ГМ-картофель РН05-026-0048 23,09 27,05 23,3 27,04
23,52 27,03
Картофель, традиционный аналог Н/о 23,35 0,00 23,57
Н/о 23,80
ГМ-картофель ЕН92-527-1 Н/о 23,54 0,00 23,63
Н/о 23,72
ГМ-картофель AV43-6-G7 Н/о 23,09 0,00 23,30
Н/о 23,52
Отрицательный контроль Н/о Н/о 0,00 0,00
Н/о Н/о
Н/о - не обнаружено.
Результаты определения относительного количества ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 с помощью калибровочной кривой представлены на рис. 2 и в табл. 5.
Как видно из табл. 5, значения систематической ошибки (bias, systematic error) лежат в интервале значений ±25% для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что говорит о близости полученных результатов к истинному значению. Кроме того, значения относительного стандартного отклонения (relative within laboratory standard deviation - RSDr) для каждого стандартного образца, полученные в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, также находятся в допустимом интервале значений <25%.
Для определения диапазона применения метода [интервала между наибольшей и наименьшей концентрациями (количествами) определяемого вещества
в образце (включая эти концентрации), при котором аналитическая методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности] для построения калибровочной кривой использовали стандартные растворы с содержанием ГМ-картофеля РН05-026-0048 от 0,1 до 50% (рис. 3).
Как показано на рис. 3, в диапазоне рабочих концентраций угол наклона стандартной кривой составляет -3,392, коэффициент корреляции линейной регрессии (Я2) равен 0,99, эффективность амплификации составляет 90,7%. Полученные результаты подтверждают прямую пропорциональную зависимость аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце и, соответственно, линейность метода.
Предел обнаружения геномной ДНК картофеля линии РН05-026-0048, представляющий собой наименьшее количество определяемого аналита в образце, которое
s 300-
: 500 400 300 200 ; 100 0
-100
10
20 30
Количество циклов
40
_ Стандартная кривая
35 О ■ 34:: 1 33^ 32:: 31::
30$
-1—I—I—I—I—I
Значение логарифма концентрации о Стандарт х Образец — Флуорофор - FAM
Эффективность ПЦР = 106,8%; R2 = 0,996; угол наклона стандартной кривой = 3,269; точка пересечения с осью Y = 32,462.
Рис. 2. Анализ продуктов амплификации ДНК с праймерами, специфичными трансформационному событию РН05-026-0048
0
Таблица 5. Результаты амплификации ДНК картофеля с праймерами, специфичными заявленному трансформационному событию «картофель линии РН05-026-0048»
Содержание ГМ-компо-нента, % Пороговый цикл Среднее значение порогового цикла Полученное данным методом содержание ГМ компонента в образце, % Систематическая ошибка (bias, systematic error), % Относительное стандартное отклонение (RSDr), %
0,1 38,29 38,25 38,23 38,22 0,098 -2 3,8
0,5 35,64 35,69 35,68 35,67 0,52 4 1,9
1 34,57 34,60 34,55 34,57 1,06 6 1,8
2 33,54 33.47 33.48 33,50 2,1 5 2,7
5 32.21 32,28 32.22 32,24 4,94 -1,2 2,7
10 31,18 31,20 31,17 31,18 9,8 -2 1,1
° 400
S
|300f
£200-
0
■&100 _о
1
е
о 0 р
>-100 0
10
20 30
Количество циклов
40
Стандартная кривая
36 f 34~ 32~ 30~ 28 ~ 26
Значение логарифма концентрации о Стандарт x Образец — Флуорофор - FAM
Эффективность ПЦР = 90,7%; R2 = 0,990; угол наклона стандартной кривой = 3,392; точка пересечения с осью Y = 32,711.
Рис. 3. Определение диапазона применения метода
ед500
может быть обнаружено с использованием данного метода, составляет 0,019%, или 11 копий геномной ДНК картофеля линии РН05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при РвОг<25%. Предел количественного обнаружения, представляющий собой наименьшее
количество аналита в образце, которое можно количественно определить с надлежащим уровнем достоверности и точности, составляет 0,06%, или 36 копий геномной ДНК картофеля линии РН05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при РвОг<25% (рис. 4).
Эффективность, линейность и правильность метода соответствуют требованиям Международной лаборатории Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Согласно полученным данным при всех трех независимых амплификациях значение ко-
эффициента корреляции линейной регрессии (Я2) было выше 0,98, а угол наклона стандартной кривой, полученной методом линейной регрессии, лежал в допустимых пределах (от -3,1 до -3,6). Результаты представлены в табл. 6.
Linear Regression Y = A + B x X
Parameter Value Error
A 34,52591 0,02065
B -3,41136 0,03693
R SD N
-0,99982 0,04099 5 <0,0001 00
_____________________________________________ 32 4-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 Log C
Рис. 4. Предел обнаружения и предел количественного обнаружения ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 в образце (А и В - переменные формулы линейной регрессии, R - коэффициент корреляции линейной регрессии, N - число образцов, SD - стандартное отклонение, P - значение)
Таблица 6. Параметры трех независимых амплификаций
Номер запуска Идентификация целевого гена картофеля Идентификация трансформационного события «картофель линии PH05-026-0048»
угол наклона эффективность ПЦР, % R2 угол наклона эффективность ПЦР, % R2
1 -3,58 90,2 0,992 -3,504 92,9 0,995
2 -3,49 93,2 0,989 -3,26 107 0,996
3 -3,52 91 0,991 -3,515 92,5 0,990
Таблица 7. Значения относительного стандартного отклонения (RSDr)
Таблица 8. Содержание генно-инженерно-модифицированного картофеля линии РН05-026-0048 в анализируемых образцах, вычисленное по калибровочной кривой, для трех независимых амплификаций
Содержание ГМ-компо-нента,% Пороговый цикл Среднее значение порогового цикла Относительное стандартное отклонение (RSDr), %
0,1 38,29 38,25 38,23 38,22 3,8
0,5 35,64 35,69 35,68 35,67 1,9
1 34,57 34,60 34,55 34,57 1,8
2 33,54 33.47 33.48 33,50 2,7
5 32.21 32,28 32.22 32,24 2,7
10 31,18 31,20 31,17 31,18 1,1
Допустимый предел <25% для каждого стандартного образца.
Содер- Полученное Среднее значе- Относи-
жание данным мето- ние содержания тельное
ГМ-компо- дом содержа- ГМ-компонента стандартное
нента ние ГМ-компо- в образце, полу- отклонение
в образце, нента ченное данным (RSDr), %
% в образце, % методом, %
0,1 0,096 0,1 0,2
0,11
0,098
0,5 0,48 0,5 1,1
0,51
0,52
1 1,1 1,05 3,9
1,06
0,99
2 2,1 2,06 2,5
2,03
2,05
5 4,94 5,0 5,5
4,98
5,09
10 9,8 9,97 9,5
9,9
10,2
Допустимый предел <25% для каждого стандартного образца.
Относительные стандартные отклонения результатов отдельных определений, полученные в условиях повторяемости (ЯвОг) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, представлены в табл. 7.
Результаты независимых индивидуальных испытаний представлены в табл. 8.
Как видно из табл. 8, относительное стандартное отклонение для каждого стандартного образца, полученное в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, находилось в допустимом интервале значений <25%.
Таким образом, результаты проведенных исследований подтвердили характеристики, определенные для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии РН05-026-0048. Высокая специфичность прай-меров, специфичность, линейность и точность метода свидетельствуют о его надежности и пригодности для обеспечения эффективного надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04123).
Сведения об авторах
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Садыкова Эльвира Олеговна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Сухачева Марина Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник подразделения ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва) E-mail: msukhacheva@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4406-6581
Батурин Александр Константинович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель научного направления «Оптимальное питание» ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва) E-mail: baturin@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-7007-621X
Литература
Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения : методические указания (МУ 2.3.2.2306-07): М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.
Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками : методические указания (МУ 2:3:2:3388-16): М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. 30 с.
The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank mate-
rial (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014. Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.
ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с.
GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (дата обращения 4.06.2018).
2
5
3
References
Methodical Guidelines 2.3.2.2306-07 «Medical and biological safety assessment of genetically modified organisms of plant origin». Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2008: 21 p. (in Russian)
Methodical Guidelines 2.3.2.3388-16 «Medical and biological safety assessment of stacked genetically modified organisms of plant origin». Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2016: 30 p. (in Russian) The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank mate-
rial (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extraction from different food products using the modified alkaline method. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2009; (2): 83-90. (in Russian)
GOST R ISO 21571-2014 [ISO 21571:2005]. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)
GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (date of access June 04, 2018)
2
5
3
6
