CC BY
181
УДК 573.6:633.111:664.641.1.016
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЛЕКЦИИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ПО ГЕНАМ, ОТВЕЧАЮЩИМ ЗА ХЛЕБОПЕКАРНЫЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ КАЧЕСТВА МУКИ
М.В. КЛИМУШИНА, М.Г. ДИВАШУК, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекуля рной биотехнологии)
С помощью аллель-специфичных маркеров была дана характеристика аллельного состояния генов высоко- и низкомолекулярных глютенинов, локализованных в геноме D коллекции сортов мягкой пшеницы российской и украинской селекции. При изучении аллельного состояния высокомолекуля рных глютенинов было показано, что в 39 из 40 образцов имеется аллель «5+10», присутствие которого повышает хлебопекарные качества. В случае низкомолекуля рных глютенинов было показано преимущественное наличие Glu D3-43-гаплотипов. Была оценена возможность применения ряда молекулярных маркеров для быстрого поиска нуль-аллелей waxy генов в изучаемой коллекции. Было показано, что не все ранее опубликованные в других работах маркеры явля ются эффективными. В то же время с использованием эффективных ДНК-маркеров в коллекции выя влено два сорта, один из которых несет в своем геноме нуль-аллель wx-A1, а второй — wx-B1. Эти данные подтверждены также с использованием методов протеомики.
Ключевые слова: пшеница, хлебопекарные качества, молекулярное маркирование, 2-D электрофорез, waxy-гены.
Пшеница я вляется одной из самых ности протеаз, способности клейкови-
распространенных и важнейших с.-х. ны удерживать в тесте выработанный
культур земного шара. Более полови- дрожжами углекислый газ [1].
ны населения нашей планеты питается Клейковина, формирующая ся в
продуктами, получаемыми из зерна тесте, представляет собой полимер
этой культуры. При этом значительная коротких субъединиц глютенина и
часть зерна идет на выпечку хлеба, липидов, в совокупности да ющих
хлебобулочных и макаронных изде- эластичность и силу теста. В м гкой
лий [2]. пшенице белки, формирующие клей-
Хлебопекарные качества сортов ковину, закодированы в локусах,
м гкой пшеницы определ ютс в картированных в 1 и 6 гомеологичных
основном двум факторами: газообра- группах хромосом [7]. Белки клейкови-
зующей способностью и газоудержива- ны представлены глиадинами, высоко-
ющей силой теста. На газообразующую молекуля рными (HMW-GS) и низкомо-
способность теста влия ет содержание лекуля рными (LMW-GS) глютенинами.
естественных сахаров, качество крах- Каждый класс запасных белков влия ет
мала и ферментативная активность на особенности теста, такие как сила,
амилазы. Газоудерживающая сила эластичность, консистенция и т.д.,
зависит от содержания клейковины и что, в свою очередь, сказывается на
ее качества, протеолитической актив- качестве хлеба.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0286.
Р д исследователей установили корреляцию между присутствием определенных аллельных вариантов высоко-молекуля рных глютенинов HMW-GS и силой теста. Было показано, что кодируемый локусом Glu-D аллельный вариант HMW «5+10» повышает хлебопекарные качества, в то время как наличие варианта «2+12» приводит к снижению хлебопекарных свойств пшеницы [4, 8].
Низкомолекул рные глютенины LMW-GS и в меньшей степени глиа-дин также оказываю т в лия ние на хлебопекарные качества, так как они составляют около 1/3 от общего количества запасных белков и 60% от глютениновой фракции. Однако роль индивидуальных низкомолекул рных глютенинов LMW-GS менее изучена, так как большое количество их субъединиц имеют одинаковую подвижность в одномерном полиакриламидном гель-электрофорезе SDS-PAGE. Так, гены локуса Glu-3, кодирующие низкомо-лекуля рные глютенины, представлены семьей мультигенов, включающих 30~40 малоизученных генов [10].
Кроме запасных белков на хлебопекарные и технологические свойства зерна пшеницы вли ет количество и соотношение различных групп углеводов, необходимых для развития дрожжей в тесте. Наиболее значимым из них вл етс крахмал эндосперма, представленный амилозой и амило-пектином. Ключевым ф ерментом в синтезе амилозы эндосперма вл етс granule-bound starch synthasa (GBSS), которую кодируют гены, получившие название Waxy [9]. В пшенице три го-меологичных GBSSI-гена расположены в хромосомах 7AS (Wx-A1), 4AL (Wx-B1), и 7DS (Wx-D1) [6]. Крахмал waxy-мутантов пшеницы (имеющих нуль-аллели по всем трем waxy-генам) полностью состоит из амилопектина, что необходимо дл изготовлени лапши быстрого приготовлени . Кроме
того, выведение сортов мутантных по юаху-генам позволит получать муку с оптимальным содержанием амилозы, необходимую для изготовления высококачественных продуктов без химической модификации крахмала.
Характеристика аллельного состава генов, отвечающих за качественные показатели муки существующих сортов мягкой пшеницы, я вляется важной задачей. Это позволит провести иссле-довани по оценке их роли и степени вли ни на показатели качества.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — наиболее простой и эффективный способ идентификации аллельных вариантов различных генов. Идентифицировать аллельные варианты генов также можно с помощью системы двумерного полиакриламидного гель-электрофореза (2D-PAGE) белков. Этот метод вл етс одним из перспективнейших методов в про-теомных исследовани х, так как на пор док увеличивает разрешающую способность исследований по сравнению с одномерным электрофорезом.
В нашей работе проведено исследование аллельного состоя ния генов, отвечающих за качественные показатели муки сорока сортов и линий озимой пшеницы.
Материалы и методы
Растительный материал: В работе использовали сорок сортов и линий озимой пшеницы* (табл. 3) В качестве контролей использовали сорта м гкой пшеницы с уже известным аллельным составом генов запасных белков: Новосибирская 67, Иволга, Мироновская 808.
Выделения ДНК из растительного материала: ДНК выделяли по методу Вегпа12ку и Тапкв1еу (1986) с некоторыми модификациями [3].
Праймеры и условия проведения ПЦР: Наличие локуса высокомоле-кул рного глютенина с комбинацией
* Коллекция любезно предоставлена проф. В.П. Нецветаевым.
субъединиц «5+10» определяли с использованием праймеров: Dx5F, DxF, DxR.
Праймеры, с помощью которых вы-полн ли анализ аллельных вариантов низкомолекул рных глютенинов и выя вляли нуль-аллели waxy-генов, приведены в таблицах 1 и 2.
Кроме того, для определения нуль-аллелей Wx-D1 генов использовали ко-доминантные маркеры со следующей комбинацией праймеров: Wx-D1-1-F, Wx-D1-1-R и Wx-D1-2-F, Wx-D1-2-R [12], при условия х: денатурация 3 мин при 95°C, затем 40 циклов : 94°C/30 с; 55°C/45 с; 72°С/ 1 мин; 1 цикл 72°C в течение 5 мин.
Выделение белка для двумерного полиакриламидного гель электрофореза (2D-PAGE): Белки выделя ли из эндосперма зерновки с помощью Sample-буфера (вода для хроматографии, 5% амфолины (pH 3_10), 80 мМ ДТТ, 16,7% раствора 30% CHAPS + 10% NP40). Затем образцы
центрифугировали при 13QQQ об/мин в течение 15 мин. Дл анализа брали б0 ul образца.
Двумерный полиакриламидный гель электрофорез 2D-PAGE: Для изоэ-лектрофокусировани использовали стрипы длиной 7 см с диапазонами pH 3$10 и p H4$7 (BioRAD). Fегидpатация проходила в течение 15 ч. Собственно изоэлектрофокусирование проводили на приборе PrOTEIN-IEF (BioRAD).
После первого разделени делали одноэтапную эквилибровку стрипов в SDS-буфере (6m мочевина, Q,375 M Tris-HCl pH8,8, 2% SDS, 2Q% glycerol, 2% DTT). После эквилибровки стрипы переносили на поверхность 12% полиакриламидного гел и закрепл ли
0,9% агарозой с бромфеноловым синим. Электрофорез проводили в буфере, содержащем 0,25 мM Tris, 19,2 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия в следующем режиме: по 1Q mA на стекло 15 мин, по 2Q mA на стекло 8 ч.
Т а б л и ц а 1
Праймеры и условия амплификации GIu-D3 вариантов [11]
Гаплотипы GIu-D3 гена Праймеры Условия ПЦР
GIu D3-21/22 M2F12 940C/40 с; 640C/40 с; 720C/ 90 c
M2R12
GIu D3-22 M2F2 940C/40 с; 640C/40 с; 720C/60 c
M2R2
GIu D3-23 M2F3 940C/40 с; 640C/40 с; 720C/ 60 c
M2R3
GIu D3-31 M3F1 940C/45 с; 560C/45 с; 720C/ 80 c
M3R1
GIu D3-32 M3F2 940C/30 с; 590C/30 с; 720C/ 60 c
M3R2
GIu D3-41 M4F1 940C/45 с; 590C/45 с; 720C/ 90 c
M4R1
GIu D3-43 M4F3 940C/30 с; 610C/30 с; 720C/ 60 c
M4R3
Т а б л и ц а 2
Праймеры для идентификации нуль-аллелей waxy-генов [б]
Праймеры
Условия ПЦР
м/х-А1 АРС, АР2 Денатурация 5 мин при 95°С, затем 32 цикла: 95°С/30 с;
^х-Б1 БОРЬ, БРО 65°С/30 с; 72°С/ 2 мин и 1 цикл 72°С в течение 7 мин
wx-гены
Результаты и их обсуждение
В последние годы были клонированы и секвенированы гены, контролирующие высокомолекул рные глютенины. На основе нуклеотидных последовательностей были разработаны праймеры, специфично выя вляющие «5+10» и «2+12» аллели локуса Ы1и^ [5]. В нашей работе было проведено изучение коллекции 40 сортов м гкой пшеницы на аллельное состо ние высокомоле-куля рных глютенинов локуса Ы1и^ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти сорта обладают высокими хлебопекарными качествами. При проведении ПЦР-анализа было вы влено, что 39 сортов м гкой пшеницы несут локус «5+10» в гомозиготном состоя нии. Только в одном сорте (Золотоколоса ) был вы влен аллельный вариант «2+12» (рис. 1). Возможно, в этом сорте наличие аллельного варианта «2+12» компенсируетс другими запасными белками, также играющими важную роль в определении хлебопекарных качеств.
В свя зи с тем, что низкомолекуля р-ные белки составля ют 40% от общего содержания запасных белков семени, они оказывают значительное вли ние на качество теста и муки пшеницы. Нами были использованы ДНК маркеры генов Ы1и 03-21/22, Ы1и 03-22, Ы1и 03-23, Ы1и 03-31, Ы1и 03-32, Ы1и 03-41 и Ы1и 03-42 [11]. В результате проведени ПЦР было получено следующее распределение гаплотипов локуса Ы1и 03 в исследуемых сортах озимой пшеницы (табл. 3).
Наиболее часто в исследуемой коллекции встречались гены Ы1и 03-23, Ы1и 03-32 и Ы1и 03-43. При использовании маркера Ы1и 03-31 не было обнаружено ни одного сорта, несущего данный ген. Это св зано либо с малой распространенностью указанного гена среди сортов озимой пшеницы российской и украинской селекции, либо с тем, что данный молекуля рный маркер работает на данных сортах не совсем корректно. Следует обратить особое внимание на аллель Ы1и 03-43. Он присутствует практически у всех
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами Ож 5Р, ОжР, ОжР (М — маркер размеров, номерами 1-40 отмечены исследуемые сорта)
Распределение гаплотипов локуса GIu D3 в сортах озимой пшеницы
№ Сорт GIu D3-21/22 GIu D3-22 GIu D3-23 GIu D3-31 GIu D3-32 GIu D3-41 GIu D3-43
1 Волжская 100 + + — — — — +
2 Харьковская 107 + + — — + — +
3 Безенчукская 380 — — + — + — +
4 Московская 39 — — + — + — +
5 Белгородская 12 — — + — + — +
6 Краснодарская 99 — — + — + — +
7 Коротышка — — — — — — +
8 Синтетик + — — — — — +
9 Донецкая 48 + + — — — + —
10 Селянка одесская + + — — — — +
11 Льговская 4 — — + — + — +
12 Перлина лісостепу — — + — + — +
13 Финт — — + — + — +
14 Ариадна — — — — — — +
15 Одесская 267 + — — — — — +
16 Крыжинка — — + — + — +
17 №500 + + — — — — +
18 Херсонская безостая + + — — — — +
19 Фея — — + — + — +
20 Белгородская 16 — — + — + — +
21 Копилівка + — — — + — +
22 БелНИИСХ 1 + + — — + — +
23 Старшина — — + — — — +
24 Юбилейная 100 + — — — + — +
25 Зимородок + — — — — — +
26 Пал Пич — + + — + — +
27 Уманка — — — — — — +
28 Селянка Краснодар — — + — + + —
29 Золотоколосая — — + — + — +
30 Дельта — — + — + — +
31 Лира — — + — + + —
32 Памяти Калиненко — — + — — — +
33 Повага — + + — — — +
34 Светоч — + + — + — +
35 Батько + — — — — — +
36 Дон 85 — — + — + — +
37 Красота — + + — + — +
38 Богданка + — — — + — +
39 Харус — — + — + — +
40 Дея — — + — + + —
сортов коллекции, за исключением четырех. А так как данная коллекция формировалась только из сильных сортов и линий пшеницы, то можно предположить, что этот аллель связан с повышенными качественными пока-зател ми зерна пшеницы. Однако это предположение требует дальнейшего подтверждения .
Кроме запасных белков важную роль в формировании технологических свойств зерна пшеницы играет
состав крахмала эндосперма. При этом количественное содержание амилозы в крахмале оказывает значительное вли ние на его качества и свойства. Регулировать содержание амилозы в крахмале возможно при использовании нуль-аллелей waxy-генов в селекционной работе. В нашем исследовании была оценена возможность применения ря да молекуля рных маркеров для быстрого поиска нуль-аллелей waxy генов. При проведении ПЦР-анализа
нуль-аллелей эффективными оказа- явления нуль-аллелей юх-А1 и тх-Б1
лись комбинации праймеров ЛЕС — (рис. 2 и рис. 3). В результате было
ЛИ2 и БВЕЬ — БИВ, созданные для вы- выя влено, что сорт Старшина несет
Waxy А-1 - _
5 6 7 8 9 10 П 12 13 14 15 16 М 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
I 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 - _ ! М 41 42 43 44 1 2 3 4
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами AFC и AR2 (М — маркер размеров, номерами 1-44 отмечены исследуемые сорта)
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами BDFL и БКй (М — маркер размеров, номерами 1-44 отмечены исследуемые сорта)
в своем геноме нуль-аллель по гену юх-А1, а сорт Коротышка нуль-аллель по гену юх-Б1.
При использовании комбинации праймеров ББЕЬ — БИБЬ, специфичных для ~Шх-П1, амплификации не было. Это согласуется с данными создателей данного маркера, которые отмечали, что он работает только на их собственных образцах. Кроме того, дл определени нормальных и нуль-аллелей '^'х-01-генов использовали кодоминантный маркер со следующими двумя комбинациями праймеров: Wx-D1-1-F и Wx-D1-1-R и Wx-D1-2-F и Wx-D1-2-R [12]. С первой парой праймеров амплификации также не наблюдалось. В случае второй комбинации праймеров амплификацию ДНК наблюдали дл 32 сортов. При этом все сорта несли локус дикого типа. Таким образом, для оставшихся вось-
ми сортов Коротышка, Льговская 4, Зимородок, Уманка, Селя нка Краснодарская , Памяти Калиненко и Харус для характеристики их аллельного состоя ния по гену ~Шх-П1 необходимо использование других методов.
Для подтверждения наличия нуль-аллелей адаху-генов на уровне экспрессии белков у сорта Старшина нами была применена методика двумерного электрофореза. Изоэлектрическая точка waxy-белков располагается в диапазоне pH 5,5-6,5. На рисунке 4 отмечен сектор, в котором располагаются waxy-белки. В этом секторе имеются только белки, продуцируемые ЮХ-В1 и юх-П1 генами, и отсутствует белок, характерный для гена юх-Л1. Таким образом, эти данные указывают на эффективность применени ДНК маркеров дл скрининга образцов на наличие нуль-аллелей по юаху-генам.
Рис. 4. 2О-РА0Б сорта Старшина, несущего нуль-аллель по тек-А1 гену
Таким образом, нами дана мо-лекуля рно-генетическая характеристика коллекции 40 сортов озимой пшеницы по наличию аллельных вариантов генов, отвечающих за хлебопекарные и технологические качества
пшеницы. Изученные сорта и ДНК маркеры могут быть использованы в дальнейших работах по изучению роли генетического полиморфизма генов в формировании качества зерна пшеницы.
Выводы 2. При изучении аллельного состоя-
ния высокомолекулярных глютенинов
1. С помощью аллель-специфичных показано, что в 39 из 40 образцов имеет-
маркеров дана характеристика аллель- ся аллель «5+10», присутствие к°т°р°го
ного состояния генов высоко- и низко- повышает хлебопекарные качества.
молекулярных глютенинов, локализо- 3. С помощью молекулярных мар-
ванных в геноме Б коллекции сильных керов и двухмерного электрофореза
белков выявлены два сорта, один из ко-
сортов м гкой пшеницы российской украинской селекции.
торых несет в своем геноме нуль-аллель гена wx-Al, а второй — wx-Bl.
Библиографический список
1. Долгодворова Л.И. Селекция полевых культур на качество. М.: Издательство MCXA, 1995.
2. Пыльнев B.B., Коновалов Ю.Б., Хупацария Т.И. и др. Частная селекция полевых культур I Под. ред. В.В. Пыльнева. М.: КолосС, 2005.
3. Bernatzky R., Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences II Genetics, 1986. Vol. ll2. P. 887-898.
4. Horvard D., Jurcovic Z., Sudar R., Pavlinic D., Simic G. The relative amounts of HMW glutenin subunits of OS wheat cultivars in relation to bread-making quality II Cereal Res., 2002.
5. Ishikawa G., Nakamura T. A new co-dominant PCR-based marker to identify the high-molecular-weight glutenin subunit combination «5+10» of common wheat II Wheat Information Service, 2007. 103. P. 1-4.
6. Nakamura T., Vrinten P., Saito M. and Konda M. Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers II NRC CanadaI, 2002.
7. Payne P.I. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread-making quality II Annual Reviews of Plant Physiology, 1987.
8. Shewry P.R., Halford N.G. and Tatham A.S. High molecular weight subunits of wheat glutenin II J. Cereal Sci., 1992.
9. Shure M. , Wessler S. and Fedoroff N. Molecular identification of the waxy locus in maize II Cell, 1983.
10. Tanaka H., Toyoda S., Tsijmoto H. Diversity of Low-Molecular-Weight glu-tenin subunit genes in Asian common wheat (Triticum aestivum L.) II Breeding Science, 2005.
11. Zhao X.L., Xia X.C., He Z.H., Lei Z.S., Ma W., Sun Q.X. Novel DNA variations to characterize low molecular weight glutenin Glu-D3 genes and develop STS markers in common wheat II Theor. Appl. Genet, 2006.
12. http: IImaswheat.ucdavis.eduIprotocols IWaxyIindex.htm
Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
The collection of Russian and Ukrainian cultivars of bread wheat has been characterized in relation to the allelic condition of the genes which encode high- and low-weight molecular glutenin and are localized in D-genome. As a result, the allele «5+10» has been shown to present in 39 of 40 samples analyzed. The Glu D3-43 haplotype has been found to be prevailing in case of low-weight molecular glutenin. The possibility to apply the number of the molecular markers for the quick search of the waxy gene null-alleles in the studied collection was assessed. Not all the previously published markers have appeared to be efficient. At the same time, the two cultivars have been revealed from which the first one carries wx-Al, while the second carries wx-Bl. The data have been confirmed by means of proteomic methods.
Key words: wheat, bread-making quality, molecular targeting, 2D-electrophoresis, waxy-genes.
