CC BY
150
Подготовка реакционной смеси для ПЦР и режим проведения амплификации
В пробирки «Эппендорф» объемом 0,2 мл из набора реактивов фирмы «Изоген», содержащие Taq-полимеразу 50 ед/мл - 0,5 мкл, d АТФ - 400 мкМ, d ЦТФ - 400 мкМ, d ГТФ - 400 мкМ, d ТТФ - 400 мкМ, MgCb - 3 мМ, вносили по 5 мкл раствора исследуемой ДНК, по 2,5 мкл каждого праймера и 10 мкл двукратного буфера для ПЦР (из набора Мастер Микс). В качестве положительного и отрицательного контроля реакции использоваои ДНК эталонных штаммов трихинелл. Пробирки сразу же помещали в термоциклер и запускали следующую программу амплификации:
«Горячий старт», предварительная денатурация при температуре 96 оС -5 мин,
второй цикл - денатурация при температуре 95 оС - 30 с; отжиг праймеров при температуре 56 оС - 2 мин; элонгация цепей при температуре 72 оС - 1 мин.
Число циклов - 40.
Заключительная элонгация при температуре 72 оС - 5 мин.
Проведение электрофореза
2 г агарозы, растворенной в 100 мл буфера ТАЕ (1х), доводили до кипения и затем остужали до 45-50 оС. Бромистый этидий (1 %) добавляли непосредственно в гель в соотношении 1 : 100000 или проводили
окрашивание самого геля вышеуказанным реактивом после окончания электрофореза в течение 10-15 мин в защищенном от света месте. Предметный столик устанавливал и с помощью уровня строго горизонтально, зажимами закрепляли подложку для геля. Расплавленную агарозу заливали в форму камеры (толщина геля не более 5 мм), вставляли гребенку. Период полимеризации геля при комнатной температуре - 30-40 мин, объем вносимых в лунки геля образцов - 5-20 мкл. Маркер молекулярной массы (так называемый «леддер» - набор фрагментов ДНК молекулярной массой от 50 до 500 н.п.) является ориентиром для окончания электрофореза. В УФ-свете (длина волны 260 нм) должны просматриваться все полосы маркера М-50 или М-100. Электрофорезную камеру, соблюдая полярность, подключали к источнику питания; ток устанавливали из расчета 10 в/см геля. Соответственно амплифицированный фрагмент ДНК, принадлежащий T. spiralis, имел молекулярную массу 173 н.п. и визуализировался между уровнями электрофоретической подвижности фрагментов маркера 150-200 н.п.
Примечание. Для получения объективных результатов идентификации принадлежности исследуемых трихинелл к генотипу T. spiralis рекомендовано выделять ДНК не менее чем из 5 личинок и использовать ДНК эталонных штаммов.
Identification of genotype Trichinella spiralis using polymerase chain reaction
I.M. Odoyevskaya PhD in biological sciences I.I. Benediktov doctor of biological sciences V.V. Aseev
PhD in biological sciences N.V. Hilyuta postgraduate
All-Russian Scientific Research Institute of Helminthology named after K.I. Skryabin, 117218, Moscow, B. Cheremushkinskaya., 28, e-mail: odoevskayaim@rambler. ru L.A. Bukina
PhD in biological sciences
149
Vyatka State Agricultural Academy, 610117, Kirov, Oktyabrsky pr., 133, e-mail: l.bukina5@gmail.com
(Approved by section «Invasive diseases in animals», Division of Veterinary Medicine of RAAS on 23rd of September 2011, Protocol No 3)
Methods for interspecific and intraspecific differentiation of helminthes, identification of genotype Trichinella spiralis using polymerase chain reaction are developed. These methods detect DNA loci specific for genome T. spiralis and enables to determine connection between natural and synanthropic trichinellosis in different biocenosis. Methods are based on interaction of synthesized oligonucleotide primers with DNA loci typical for this parasite genotype. The amplified fragment length is increasing. Electrophoresis of amplification products enables to visualize the DNA fragments and find their molecular mass. The list of equipment and reagents is presented, the process of preparation of clinical trial materials, release of genomic DNA, preparation of reaction mixture for polymerase chain reaction, amplification and electrophoresis modes are described.
Keywords: Trichinella spiralis, method of polymerase chain reaction, differentiation, DNA.
150
Методические положения
МЕТОД ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ МЯСА ПРОМЫСЛОВЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗООНОЗАХ
А.В. УСПЕНСКИЙ, доктор ветеринарных наук Ф.К. СКВОРЦОВА кандидат ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, 117218, Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28, e-mail: director@vniigis.ru, fainaskvorcova1011@gmail.com (Рассмотрен и одобрен на заседании секции «Инвазионные болезни животных» 27 мая 2014 года, протокол № 1)
Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов промысловой и любительской охоты направлена на выявление источников и предотвращение заражения человека гельминтозоонозами. Она должна проводиться комплексным методом c использованием компрессорной трихинеллоскопии и метода пептолиза в искусственном желудочном соке. Приведено описание и дифференциация опасных для человека личинок, выделенных из мяса промысловых животных. Применение на практике методов ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов охотничьих трофеев позволит предотвратить заболеваемость человека и домашних животных опасными зоонозами.
Ключевые слова: зооноз, трихинеллез, аляриоз, ветеринарно-санитарная экспертиза.
За последние годы наблюдается усиление эпидемической напряженности по зоонозам в РФ, включая и сопредельные регионы. Анализ эпизоотической и эпидемиологической ситуации свидетельствует о повышении роли диких промысловых животных в распространении таких зоонозов как трихинеллез и аляриоз. Доминирующую роль в заражении людей в качестве источника инвазии играют дикие животные.
Трихинеллез во многих регионах оценивается уже исключительно как природно-очаговая инвазия, что связано в основном с употреблением населением мяса диких животных, добытых на охоте (бурых и белых медведей, кабанов), и экзотических блюд из мяса барсуков, собак, нутрий и др.
Цель работы - дифференциальная диагностика личинок гельминтозоонозов промысловых (кабанов и диких плотоядных) животных методами компрессорной трихинеллоскопии и пептолиза.
Методы компрессорной микроскопии и пептолиза мышечной ткани животных в искусственном желудочном соке (ИЖС) можно применять в ветеринарно-санитарных лабораториях на рынках, мясокомбинатах для диагностики трихинеллеза и аляриоза.
Материалы и методы
В соответствии с «Методическими указаниями по диагностике трихинеллеза животных» (Департамент ветеринарии Минсельхоза РФ № 13-7-2/1428 от 28.10.1998) обязательному исследованию на трихинеллез подлежит: мясо свиней, кабанов, медведей, барсуков, нутрий, собак, других всеядных и
151
плотоядных животных и продукты их убоя, имеющие поперечно-полосатую мускулатуру (субпродукты).
У хищников из природных биоценозов следует учитывать специализированный характер распределения личинок трихинелл и алярий в различных группах поперечно-полосатых мышц.
У кабанов и медведей пробы берут из ножек диафрагмы, ближе к основанию, из межреберных, шейных, жевательных, икроножных мышц, мышц языка; у плотоядных - из сгибателей и разгибателей передних и задних конечностей, межреберных и жевательных мышц; у псовых и куньих (лисиц и куниц) - дополнительно из мышцы спины. В отдельных случаях исследуют шпиг с мышечными прослойками и/или мышечную прирезь со свежих шкур.
Предпочтительнее пробы отбирать от туш только что убитых туш. Однако, для исследований пригодны замороженные, подгнившие или долго пролежавшие куски мяса, копченые, соленые или сушеные продукты из него, прирезь со шкур. В этом случае увеличивают массу проб для исследования.
Трихинеллез и аляриоз у хищных животных распространены повсеместно, однако интенсивность инвазии гельминтами обычно не превышает 0,5-1 лич./г. По инструкции обязательные для исследования 24 среза мышечной ткани составляют около 2 г, этого явно недостаточно для обнаружения гельминтов. Мясо диких промысловых животных необходимо в обязательном порядке исследовать нижеприведенным образом.
Мясо кабанов и медведей. 96 срезов мышечной ткани (по 48 срезов из ножек диафрагмы или массетеров или других мышц) методом компрессорной трихинеллоскопии или по 4,0 г из тех же мышц методом пепто-лиза в ИЖС.
Мясо барсука и хищных млекопитающих. С учетом результатов исследований, связанных с оценкой закономерностей распределения личинок трихинелл в различных группах мышц: 96 срезов мышечной ткани (по 48 из мышц плечевого пояса и задних конечностей или других мышц) методом компрессорной трихинеллоскопии или по 4,0 г из тех же мышц методом пептолиза в ИЖС.
Метод компрессорной трихинеллоскопии. Принцип метода заключается в раздавливании срезов мышц между стеклами компрессориума и просматривания их под микроскопом или трихинеллоскопом. Целесообразно брать пробы мышц из мест наибольшего скопления личинок трихинелл. Если такой возможности нет, то изучению подвергают имеющиеся мышцы.
Трихинеллоскопия свежих мышц дает наилучшие результаты, так как в них четко видны цисты алярий и капсулы трихинелл или свободные личинки трихинелл и других нематод.
В мышцах, пролежавших некоторое время, происходит аутолиз, при этом паразиты становятся плохо заметными, а молодые тонкостенные капсулы или цисты могут совсем оптически исчезнуть. Такие срезы можно подкрасить несколькими каплями 1%-ного спиртового раствора метиленового синего.
В мышцах после замораживания личинки трихинелл с еще не сформированными капсулами или с тонкими капсулами видны очень плохо и могут также оптически исчезнуть. В таком случае срезы подкрашивают 1%-ным спиртовым раствором метиленового синего. Сформированные капсулы хорошо видны в оттаявших мышцах на срезе. Цисты алярий видны в виде плотного образования с более темным пятном внутри.
В копченом и соленом мясе личинки трихинелл видны еще хуже; тонкие срезы из такого мяса просветляют 1-2 каплями 50%-ного раствора глицерина в течение 4-5 ч.
Цисты алярий просветляют длительное время - в течение 14-16 ч.
Нарезанные для компрессориума срезы высохших мышц или сухие остатки подкожных мышц со шкуры животного кладут на 10-20 мин в молочную кислоту, а затем исследуют обычным способом.
152
При невозможности исследовать на месте кусочки мышц следует сохранить в замороженном виде или законсервировать в насыщенном растворе поваренной соли для дальнейшего изучения обычным способом.
После консервации в спирте или формалине приготовленные срезы из мышц помещают на 4-5 ч в 50%-ный раствор глицерина для просветления, а затем исследуют обычным способом.
От каждой пробы по ходу мышечных волокон ножницами делают срезы мышц размером 1,5 я 0,3 см. Их помещают на стекло компрессориума и прижимают вторым стеклом. Срезы необходимо раздавливать между стеклами до полной прозрачности и только в таком состоянии исследовать. Их просматривают под микроскопом при малом увеличении. Дифференцируют личинок гельминтов по морфологическим признакам и учитывают число обнаруженных на срезах. Тщательно документируют данные о животном, группе исследованных мышц и интенсивности инвазии.
Дифференциальная диагностика. Капсулы с трихинеллами необходимо дифференцировать от наиболее часто встречаемых в образцах мышц от диких животных цист с личинками алярий (мезоцеркарии) и нематод. Дифференциация основывается на морфологии возбудителей.
Личинки трихинелл наиболее распространенных видов, Trichinella spiralis и T. nativa и др., образуют капсулы в мышечных волокнах поперечнополосатых мышц. Личинки T. pseudospiralis не образуют капсул и свободно лежат между мышечными волокнами. Личинки алярий также находятся в цистах, которые располагаются в межмышечной ткани в отличие от трихинелл.
При компрессорной диагностике при наличии инвазии в исследуемых срезах мышц отчетливо видны слоистые капсулы с трихинеллами, расположенными внутри мышечного волокна. В стенке капсул хорошо различимы внутренний тонкий гиалиновый слой и внешний утолщенный соединительнотканный слой. Капсулы могут быть различной формы - лимоновидной, овальной, округлой; разного размера, но в любом случае в них хорошо заметна свернутая личинка (или несколько личинок) в виде объемной спирали.
Встречаются капсулы с погибшими или лизированными личинками трихинелл. Они обычно темного цвета и нечетких очертаний. В пробах от плотоядных часто встречаются обызвествленные толстостенные капсулы, частично лизированные, а также следы резорбции капсул в виде темных пятен.
В мышечных волокнах могут встречаться юные личинки капсульных видов трихинелл с 10 по 17-е сутки после заражения, которые только начинают формировать соединительнотканную капсулу. Они очень подвижны, но малозаметны на срезе.
Личинки бескапсульного вида трихинелл также плохо видны на срезах, так как располагаются между мышечных волокон. Они обычно свернуты в виде скрепки или полураскрытой скрепки. Однако, через некоторое время (5-10 мин) в тканевой жидкости около среза можно наблюдать активно двигающиеся личинки, сворачивающиеся в спираль.
Цисты алярий обычно овальной формы размером 0,54 я 0,42 мм. У молодых алярий гиалиновая оболочка тонкая, одинарная, несколько похожая на капсулу трихинелл. Внутри цисты находится мезоцеркарий трематоды. Толстая двуслойная гиалиновая оболочка образуется позднее.
Цисты обычно расположены между мышечными волокнами в тех же группах поперечнополосатых мышц, что и капсулы трихинелл, но чаще встречаются на границе с жировой тканью. Циста алярии более крупная, округлая и прозрачная, чем капсула трихинелл, меняющая свою форму при движении личинки в компрессориуме при исследовании свежего мяса. Внутри видна плоская личинка с двумя присосками (ротовой и брюшной) и У-образным кишечником. Наряду с цистами с тонкими стенками встречаются более плотные, непрозрачные с малоподвижной личинкой.
153
От бескапсульных личинок трихинелл следует дифференцировать личинок нематод аскаридного типа, которые также свободно лежат между мио-фибриллами. Личинки на срезе малоподвижны, расположены в виде полукруга. Линейный размер этих нематод почти в 2-3 раза превышает размер бескапсульных личинок трихинелл.
Компрессорную трихинеллоскопию в полевых условиях проводят с помощью устройств типа ТП (ТП-2, ТП-3).
Заражение гельминтами, как правило, устанавливают при интенсивной инвазии, когда в 1 г мышц находится несколько личинок, а при слабой степени заражённости эффективность компрессорной микроскопии значительно снижается.
Эти недостатки компрессорной микроскопии восполняют за счёт увеличения числа срезов и исследованием других групп мышц или методом пептолиза.
Метод пептолиза мышечных проб в ИЖС. Основан на растворении в искусственном желудочном соке мышечной ткани и обнаружении в осадке личинок гельминтов. Метод позволяет обнаруживать личинки при слабой инвазии, которые не всегда улавливаются при обычном компрессорном исследовании. Пептолиз мышечных проб в ИЖС можно проводить стандартным (пассивным) методом или автоматизированным (экспресс-диагностика) с помощью приборов для выделения личинок. Для этих целей применяют ИЖС на основе пепсина и соляной кислоты или ИЖС бетасол, включающий пепсин, бетаин и лимонную кислоту.
Приготовление искусственного желудочного сока. Состав: вода при температуре 41-42 °С - 1 л; кислота соляная концентрированная (уд. масса 1,2) - 10 мл; пепсин свиной в зависимости от активности - 3-10 г, при исследовании соленых, копченых мясопродуктов - 14-18 г. ИЖС данного состава годен для применения в течение 8 ч с момента приготовления.
ИЖС бетасол: вода при температуре 41-42 °С - 1 л; пепсин свиной в зависимости от активности 3-10 г; бетаин - 10 г; лимонная кислота - 12-14 г. Состав необходимо использовать в течение 48 ч.
Пепсин. Концентрацию пепсина в ИЖС определяют видом используемого препарата. Предлагаемые пепсины обладают высокой ферментной активностью в дозе 3 г/л ИЖС.
Фирма Акрос (Acres Organics, Бельгия, США) - пепсин для биохимии, лиофилизированный кристаллический порошок. Активность 0,7 Ph.Eur.U/mg.
Фирма Сигма (Sigma Aldrich, Германия, США) - пепсин для биохимии, лиофилизированный кристаллический порошок. Активность 600-1200 ед/мг.
Фирма Merck (Германия, США) - пепсин для биохимии, лиофилизированный кристаллический порошок. Активность 0,7 Ph.Eur.U/mg.
ООО «Шако» (Россия) - пепсин свиной для сыроделия, лиофилизированный кристаллический порошок. Активность 100 ед/мг. Обладает невысокой ферментной активностью и небольшим сроком годности. Это обстоятельство вынуждает перед использованием данного пепсина тестировать его и в дальнейшем постоянно повышать дозу.
Мясо промысловых животных (кабана, медведя, енотовидной собаки, барсука и других) более плотное, жесткое, чем свинина, поэтому в отдельных случаях следует увеличивать дозу пепсина. Солонину, копчености, длительно мороженое мясо, мясные полуфабрикаты следует исследовать только методом пептолиза с увеличением дозы пепсина до 14 г/л.
Пассивный метод пептолиза. Переваривание образцов можно проводить в контейнере, который помещается в любую стеклянную емкость.
Пробу измельчают в мясорубке с диаметром решетки 3-4 мм. 20-25 г фарша помещают в контейнер из металлизированной сетки или в мешок из мельничного газа (с ячейками 0,3-0,5 мм) размером 8-10 см в диаметре. На 25 г фарша готовят не менее 500 мл ИЖС. Контейнер погружают в стеклянную емкость с ИЖС и закрепляют его на специальном держателе или любой
154
