CC BY
30
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №0 3/2018 ISSN 2410-6070
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 613.636:614.75:614.91:57.088.3:577.112:57.042
Е.С. Лысова
магистрант 2 курса,
Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, РФ
E-mail: jerry1994@rambler.ru А.Р. Валеева младший научный сотрудник, Казанская государственная медицинская академия, г. Казань, РФ
E-mail: anna-valeeva@mail.ru К.С. Хаертынов канд. биол. наук, заведующий лабораторией, Казанская государственная медицинская академия, г. Казань, РФ
E-mail: khaerkamil@mail.ru
МЕМБРАННЫЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ БЕЗОПАСНОГО ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ БИОМАТЕРИАЛА НА ПРИМЕРЕ КОЗЬЕГО МОЛОКА
Аннотация
В статье рассматривается технология мембранных носителей, как материала для хранения биологических жидкостей, позволяющая решить проблемы транспортировки и хранения образцов. Электрофоретическим и спектрофотометрическим методами проведено исследование сохранности белков молока и сыворотки молока коз при использовании мембранных носителей. Показано, что использование технологии сухих пятен сохраняет концентрацию белков и белковый спектр в образцах на уровне нативного биологического материала. Данный метод пробоподготовки и консервации применим для безопасной транспортировки и хранения биожидкостей.
Ключевые слова:
мембранные носители, консервация, биологические жидкости, молоко, белковый спектр, электрофорез
Введение. В настоящее время проблема безопасного отбора и хранения биологических образцов является крайне важной для проведения исследований, при этом не существует универсального метода, который позволил бы надежно, удобно и на протяжении необходимого времени консервировать биологический материал [1]. Существующие методики могут применяться лишь ограниченно и имеют недостатки, причем некоторые из них - весьма серьезные. Большинство способов хранения требуют больших материальных и энергетических затрат, а некоторые могут привести образцы в негодность, и, следовательно, их нельзя будет использовать в дальнейших лабораторных исследованиях [2].
Мембранные материалы, применяемые в технологии так называемых «сухих пятен крови», используются для подготовки проб биологических жидкостей, посредством получения сухих образцов и их дальнейшей транспортировки и хранения до проведения анализа. Главным качеством мембранных материалов является их способность эффективно поглощать жидкости разной биологической природы и консервировать их в высохшем состоянии, сохраняя все нативные характеристики образца.
При использовании метода сухих пятен несколько капель образца крови или другой биологической жидкости наносится на подготовленный участок стекловолоконного материала, который прикреплен к специальной карточке с лабораторным номером и прочими отметками, далее жидкость высыхает и надежно фиксируется на носителе. В таком состоянии проба может храниться в течение длительного времени и при этом сохранять все функциональные свойства и компоненты, содержащиеся в биоматериале. После доставки заготовленной пробы в лабораторию, сухой образец смывают с вырезанной части носителя и проводят выявление исследуемых веществ стандартными аналитическими методами [3].
Главными достоинствами применения технологий сухих пятен является удобство и доступность применения, при этом существенно сокращаются затраты на транспортировку и сохранение образцов, за счет отсутствия «холодовой цепи» [3]. В последнее время технология сухих пятен крови все шире применяется для ветеринарной диагностики и исследований, в частности при дистанционном отборе проб биологических жидкостей животных (крови, плазмы, мочи, молока и др.) в полевых условиях и в местах их массового содержания [4,5]. Описано применение данной технологии для определения в крови ДНК вирусов-возбудителей с помощью метода полимеразной цепной реакции [6] и специфических антител в сыворотке крови иммуноферментным анализом [7].
Целью работы является определить возможность применения технологии мембранных носителей в качестве материала для хранения и транспортировки молока и сыворотки молока коз.
Материалы и методы. В качестве носителя сухого образца биологической жидкости использовали мембранную полоску из стекловолоконного материла шириной 0,5 см с нанесенной маркировкой (карточка для хранения и транспортировки биологических жидкостей в виде сухих пятен производства ООО «Иммуновед», г. Москва). На предмет сохранения белков в биологических материалах исследовали молоко и сыворотку молока коз. Всего было отобрано 18 образцов молока, из которых путем молочнокислого брожения было получено 18 образцов сыворотки. Все образцы были законсервированы с помощью технологии мембранных носителей. Участок мембраны погружали в образец жидкости и выдерживали в течение времени, необходимого для поднятия жидкости на всю длину мембранной полоски. Затем полоску с образцом высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч. Высушенные образцы хранили в плотно закрытых пластиковых пакетах. Пробы были законсервированы с различной периодичностью. Максимальный срок консервации проб составил 4 месяца, минимальный - 1 сутки.
Определение концентрации белка в образцах проводили на спектрофотометре UV5 Nano (Mettler Toledo). Электрофоретическое фракционирование белков молока проводили в 12% полиакриламидном геле по методике U.K. Laemmli, используя камеру для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra Cell (BioRad), аналогично описанной ранее методике [8,9]. Для визуализации продуктов электрофореза гели окрашивали с применением красителя Кумасси G-250 (Bio-Rad) и дальнейшей обработкой пластин геля азотнокислым серебром по методике Э.И. Гребиножко, аналогично описанной ранее методике [8,9]. Обработку полученных результатов проводили в программе VisionCapt. При статистическом анализе использовали t-тест.
Результаты и обсуждение.
Спектрофотометрическим методом определяли концентрацию белка в нативных и восстановленных образцах молока (табл. 1) и сыворотки молока (табл. 2) коз.
Таблица 1
Концентрация белка в исходных и восстановленных образцах молока (мг/мл)
Идентификатор образца Среднее значение для нативного образца Среднее значение для восстановленного образца, после хранения в течение
1 сут 4 мес
GM 17/01 93,22 91,65 89,98
GM 17/02 91,19 90,44* 90,22*
GM 17/03 105,60 103,75* 104,10*
GM 17/04 65,965 64,75* 64,50*
GM 17/05 103,7 104,41* 101,69*
GM 17/06 90,54 91,38* 89,60*
GM 17/07 108,98 107,2 107,57
GM 17/08 85,065 86,83* 84,67*
GM 17/09 112,97 109,32* 108,43*
GM 17/11 52,95 53,26* 51,45*
GM 17/12 74,88 73,94 73,21
GM 17/13 45,63 44,03* 44,49*
GM 17/14 105,19 105,25* 104,01*
GM 17/15 66,60 62,16* 61,66*
GM 17/16 98,13 90,47 88,64
GM 17/17 93,8 92,6* 92,48*
GM 17/18 65,55 65,25* 66,01*
GM 17/19 130,57 126,99 125,39*
* - входит в доверительный интервал (0,95)
Анализ результатов показал практически полное сохранение белковой массы. Полученные средние значения концентрации белков в образцах, восстановленных с мембран, близки к нативным. При статистическим обработке результатов установлено, что практически все значения восстановленных проб молока и сыворотки молока входят в 95% доверительный интервал, а отличия значений образцов, законсервированных на 4 месяца и на сутки не значительны. Также не обнаружено зависимости от вида жидкости, нанесенной на мембранный носитель: и сыворотка, и молоко одинаковым образом сохраняли нативную долю белков.
Таблица 2
Концентрация белка в исходных и восстановленных образцах сыворотки молока (мг/мл)
Идентификатор образца Среднее значение для нативного образца Среднее значение для восстановленного образца, после хранения в течение
1 сут 4 мес
GMW 17/01 21,91 20,59* 22,09*
GMW 17/02 57,33 58,90* 57,38*
GMW 17/03 11,53 11,48* 10,33
GMW 17/04 19,39 17,67* 18,64*
GMW 17/05 40,03 41,55 40,16*
GMW 17/06 7,91 7,82* 7,66*
GMW 17/07 7,85 8,26* 8,92
GMW 17/08 71,58 68,78 71,54*
GMW 17/09 10,31 10,31* 10,64*
GMW 17/11 7,36 7,16* 7,11*
GMW 17/12 19,70 18,69* 18,73*
GMW 17/13 8,36 8,20* 9,11*
GMW 17/14 3,29 2,76* 3,19*
GMW 17/15 2,75 2,36 1,61
GMW 17/16 5,90 5,79* 6,51*
GMW 17/17 2,93 3,13* 2,8*
GMW 17/18 7,74 7,43* 6,80*
GMW 17/19 106,42 102,48* 114,53*
* - входит в доверительный интервал (0,95)
Тест на достоверность показал, что между результатами измерений молока в начальных условиях и молока, подвергнутого консервации, нет достоверных различий, однако результаты измерения белка в сыворотке имеют статистически значимые различия (табл. 3). Такие результаты обусловлены большим разбросом значений концентрации белка в сыворотке: минимальное значение в нативных образцах составляло 2,75 мг/мл, а максимальное 106,43.
Таблица 3
Результаты ^теста независимых выборок - проверка гипотезы, что выборки имеют равные дисперсии
M m P Достоверность
Молоко
Нативные 83,714 17,98
Восстановленные (1 сут) 82,300 17,54 0,005 Достоверно
Восстановленные (4 мес) 82,131 17,33 0,006 Достоверно
Сыворотка молока
Нативные 22,907 20,415
Восстановленные (1 сут) 22,411 20,23 0,0662 Недостоверно
Восстановленные (4 мес) 23,210 20,197 0,268 Недостоверно
M - среднее значение выборки, m - среднее квадратичное отклонение, P - вероятность ошибки
Так как все образцы сыворотки были получены естественным путем молочнокислого брожения молока, то, по всей видимости, вследствие неполного отделения супернатанта из молока, некоторые образцы сыворотки содержали чрезмерное количество белка, что и привело к недостоверным результатам статистического анализа, при этом концентрация белков в образцах сохранялась на начальном уровне.
Электрофоретическое разделение белков показало, что в целом, белковый спектр в нативных и восстановленных образах выглядит идентичным. Обработке подвергали денситограммы белкового спектра в полиакриламидном геле при окрашивании Кумасси G-250 (рис. 1) и азотнокислым серебром (рис. 2).
Рисунок 1 - Денситограммы белкового спектра козьего молока (образец GM 17/01), Кумасси G-250: А нативный образец; В - образец, законсервированный с помощью мембранного носителя в течение 4 месяцев; С - образец, законсервированный на мембранном носителе в течение 1 суток
Рисунок 2 - Денситограммы белкового спектра козьего молока (образец GM 17/01), азотнокислое серебро: А - нативный образец; В - образец, законсервированный с помощью мембранного носителя в течение 4 месяцев; С - образец, законсервированный на мембранном носителе в течение 1 суток
Окрашиванием Кумасси G-250 удалось визуально выявить 9 фракций, молекулярные массы отличались незначительно, что обусловлено погрешностью обработки при использовании программы. Способ обработки результатов электрофореза азотнокислым серебром дает более яркую визуализацию белков, что позволяет выделить больше фракций и более выраженные пики белковых концентраций.
Таким образом, методом электрофореза показано, что консервация образцов молока коз с применением мембранных носителей не нарушает картину белкового спектра: все белки, обнаруженные в нативных образцах, сохранились и в законсервированных.
Заключение. Электрофоретическим фракционированием белков доказано, что хранение биологических жидкостей, таких как молоко коз и сыворотка молока коз, на мембранных носителях в полном объеме сохраняет их белковый спектр. Спектрофотометрическим методом установлено, что концентрация белка в нативных и законсервированных образцах остается близкой к нативной, вне зависимости от срока
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №0 3/2018 ISSN 2410-6070
консервации образцов. Доказано, что пробы биологического материала, хранящиеся на мембранных носителях, сохраняют свои биохимические свойства и характеристики. Список использованной литературы:
1. Тонкова Г.В., Валиуллин Л.Р., Егоров В.И. и др. Экономические аспекты управления запасами продовольственного сырья и их экологизация // В сб.: Актуальные проблемы обеспечения устойчивого экономического и социального развития регионов, сб. мат. 4-й междунар. науч.-практ. конф. Махачкала, 2013.С. 21-23.
2. Шуралев Э.А., Александрова Н.М., Мукминов М.Н. и др. Влияние антикоагулянтов и активаторов свертывания крови на результаты серологических реакций // Ветеринария. 2018. № 2. С. 54-57.
3. Саушкин Н.Ю., Самсонова Ж.В., Осипов А.П. и др. Диагностика инфекционных заболеваний крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа в сухих пятнах крови с использованием нового формата пробоподготовки // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2016. Т. 57. № 4 С. 263-268.
4. Lehner A.F., Rumbeiha W., Shlosberg A. et al. Diagnostic analysis of veterinary dried blood spots for toxic heavy metals exposure // J Anal Toxicol. 2013. V.37(7). P. 406.
5. Sun D., Cho Y.I., Comyn P., Yoon K.J. Use of blood collected onto and dried on filter paper for diagnosing pregnancy in cattle // Vet J. 2013. V.198(2). P. 494.
6. Саушкин Н.Ю., Самсонова Ж.В., Осипов А.П. и др. Сравнение методов ПЦР и ИФА для определения лейкоза крупного рогатого скота с использованием сухих пятен крови // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2: Химия. 2016. Т.57, № 5. С. 41-47.
7. Белецкий С.О., Каримуллина И.Г., Авзалова А.Ф. и др. Выявление антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в сухих образцах сыворотки крови, полученных на пористых мембранных носителях нового формата // Ветеринарный врач. 2016. № 2. С. 14-19.
8. Ефимова М.А., Хаертынов К.С., Арсланова А.Ф. и др. Выделение, очистка и оценка серологической активности антигенов вируса бешенства // Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 4. С. 27-31.
9. Шуралев Э.А., Хаертынов К.С., Валеева А.Р. и др. Функционирование и серологическая активность экстракта клеток и продуктов экспрессии Mycobacterium bovis // Ветеринария и кормление. 2017. № 3. С. 103-105.
© Лысова Е.С., Валеева А.Р., Хаертынов К.С., 2018
УДК57
Абдуллаева А.М.
канд. биол. наук, доцент ФГБОУ ВО «МГУПП», г. Москва, РФ
E-mail: asiat29@mail.ru Салахова Н.Р.
бакалавр 4 курса ФГБОУ ВО «МГУПП», г. Москва, РФ E-mail :nadsal11201996@gmail.com
ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ МЯСА ИНДЕЙКИ ПРИ НАРУШЕНИИ РЕЖИМОВ ХРАНЕНИЯ
Аннотация
В данной статье рассмотрены причины и последствия нарушения режимов хранения мяса индейки. Основной акцент сделан на видах порчи мяса и том, какую опасность они представляют для здоровья человека.
Ключевые слова:
мясо индейки, режимы хранения, гниение, ослизнение, плесневение.
В России в последнее время уровень потребления и производства мяса птицы стремительно растет. Лидирующее место на сегодняшний день занимает мясо индейки. За 2017 г производство индейки увеличилось на 23 %. Это объясняется тем, что люди стали больше внимания уделять здоровому питанию.
