CC BY
21
УДК 581.331.2: 582.475.4: 581.162.3
КАЧЕСТВО ПЫЛЬЦЫ КЕДРА СИБИРСКОГО (PINUSSIBIRICA (PINACEAE)) НА КЛОНОВОЙ ПРИВИВОЧНОЙ ПЛАНТАЦИИ В ЗАПАДНО- САЯНСКОМ ОПЫТНОМ ЛЕСНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
С.С. Савельев1, И.Н. Третьякова1'2, Е.В. Ворошилова2, Ю.А. Череповский3
'Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок, 50; e-mail: culture@ksc.krasn.ru
2Институт биотехнологии и фундаментальной биологии ГОУ ВПО «Сиби рский федеральный университет»
660041 Красноярск, пр. Свободный, 79
3Западно- Саянское опытное лесное хозяйство 662820 Ермаковское, пл. Мира, 43
Определяли качество пыльцы, продуцируемой клонами Западно - Саянской ОЛХ и пыльцы, полученной от плюсовых и гетерозисных деревьев, растущих в Западном Саяне, использованной в качестве опылителей. Для анализа пыльцы применяли цитологические, гистохимические методы. Выявлено, что пыльца, впервые продуц и-руемая клоновыми деревьями кедра сибирского в 13 - 14- летнем возрасте, оказалась низкого качества. Только у двух клоновых деревьев (из 23 пылящих) формировались зрелые двуклеточные пыльцевые зерна, которые пр о-растали в культуре in vitro.
Ключевые слова: пыльца, клоны, сосна сибирская
Defining quality of pollen, produced by clones of West-Sayan experimental forestry and pollen, received from plus and heterosis trees, growing in West Sayan, used as pollinator. For analysis used cytological, histochem ical methods. Discovered, that pollen, at first produced by clone Siberian pine trees at the age of 13-14, proved to be low quality. Only two clone trees (from 23 pollinate) forming double -cellular pollen-grains, that grown in culture in vitro.
Key words: pollen, clone, Siberian pine
ВВЕДЕНИЕ
Сосна сибирская (кедр сибирский Pinus sibirica Du Tour)- перспективный орехоносный вид, один из основных лесообразователей гор Сибири. П о-этому большое значение имеет проведение генет и-ко- селекционных работ по отбору высокоурожа й-ных форм данного вида, а также эксперименты по искусственной внутривидовой гибридизации кедра сибирского для получения хозяйственно - ценных гибридов.
Выведение гибридов во многом зависит от по д-бора родительских пар (Титов, 2006). Предпосылками для успешной гибридизации ке дра сибирского являются высокий полиморфизм и периодическая встречаемость кедров- акселератов, формирующих семена в год опыления (вместо двух лет) (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). Можно предположить, что использование пыльцы данных ос обей в работах по контролируемому опылению позволит получить гибриды, отличающиеся ускоре н-ным ростом, а также обильным семенош ением.
Одним из наиболее благоприятных мест для проведения контролируемого опыления являются горные районы Западного Саяна. В них на сравнительно небольшой территории в различных высо т-ных поясах сконцентрирован чрезвычайно богатый и разнообразный генофонд этого основного
*Работа поддержана грантами № 08-04-00107-а и ККФН 18G043.
орехоплодного вида (Ирошников, 1974).
Для сохранения природного богатства кедровых лесов Западного Саяна и их биоразнообразия, в 90-х годах прошлого века на базе Западно- Саянского опытного лесного хозяйства (ОЛХ) Ю. А. Череповским была создана клоновая плантация («архив») из плюсовых и гетерозисных деревьев кедра сибирского Западно- Саянской горной страны. Проведение гибридизационных работ на клон о-вой плантации позволит получить высокопроду к-тивные гибриды с заданными наследственными свойствами.
Цель настоящего исследования - определение качества пыльцы, продуцируемой клонами Западно- Саянской ОЛХ и пыльцы, полученной от пл юсовых и гетерозисных деревьев, растущих в З а-падном Саяне, использованных в качестве опыл и-телей.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕД ОВАНИЯ
Объектом настоящего исследования являются клоны деревьев кедра сибирского, произрастающие на клоновой прививочной плантации Западно - Саянского опытного лесного хозяйства, возраст кот о-рой 12-14 лет (табл. 1). В этом возрасте на клонах впервые появились микростроб илы.
Для сравнения использовали типичные и гет е-розисные формы сосны сибирской, растущие в естественном древостое Западного Саяна (Ермаков-ский и Шушенские районы Красноярского края).
С.С. Савельев и др.: Качество пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Ршасеае)) на клоновой прививочной плантации
Возраст деревьев из естественного древостоя с оставлял 100- 114 лет (табл. 2). При этом особого внимания заслуживала особь с ускоренным одно-
летним типом формирования шишек (1А). Такие деревья представлены в популяции редко (0,2 -0,5 %) (Ирошников, 1974).
Таблица 1 - Характеристика клонов материнских деревьев кедра сибирского (Ермаковское ОЭП)
№ клона Высота, м Э13, см Возраст, лет
277/22 1,5±0,2 15±2,5 13
280/25 1,6±0,3 16±3,1 13
281/26 1,5±0,4 15±2,6 11
286/32 1,6±0,2 16±3,2 13
287/33 1,5±0,3 15±2,4 14
288/34 1,6±0,3 16±3,1 12
157/17 1,5±0,2 15±2,5 11
155/15 1,5±0,2 15±2,1 10
142/1 1,6±0,2 16±3,1 13
144/6 1,6±0,3 16±3,0 12
145/4 1,7±0,3 17±2,8 13
147/8 1,5±0,2 15±3,1 13
153/13 1,8±0,5 18±2,8 13
141/3 1,7±0,3 17±1,9 14
Таблица 2 - Характеристика деревьев- опылителей кедра сибирского, отобранных в естественном древостое
Западного Саяна
№ дерева Место произрастания Высота, м Диаметр, см Возраст, лет Длина шишек, мм Генеративный цикл женских шишек
492 Ермаковский район 25 64 114 64±0,7 двулетний
476 -«»- 23 61 107 63±0,9 двулетний
22 24 63 106 62±0,6 двулетний
1А Шушенский район 23 69 103 48±1,8 однолетний
3ш 22 57 103 60±1,1 двулетний
С клоновых деревьев и деревьев, растущих в естественном древостое, с бор микростробилов осуществляли в период растрескивания микросп о-рангиев (9-12 июня 2006 и 6-8 июня 2007 гг.). Микростробилы высушивали, из них вытряхивали пыльцу. Пыльцу хранили в эксикаторе, наполне н-ном хлористым кальцием, в холодильнике при те м-пературе 0- 5 оС.
В лабораторных условиях у пыльцы (100 пыльцевых зерен) определяли размеры пыльцевых зерен и параметры прорастания пыльцы, пров одили гистохимический анализ на содержание крахмала (ра створ Люголя) (1оЬашеп, 1940). Данные о размерах пыльцевых зерен получены на основании: дл ины и высоты тела пыльцевого зерна и воздушных ме ш-ков. Проращивание пыльцы осуществляли в 15 %-ном растворе сахарозы и минеральной среде (Му-§ааМ, 1969).
Для подсчета числа клеток в пыльцевых зе рнах, приготовленные микропрепараты окрашивали ра створом сафранина по стандартной методике (Дже н-сен, 1965).
Просмотр микроскопических образцов осущ е-ствлялся на микроскопе МБИ-6. Размеры клеток определяли при помощи окуляр - микрометра с последующим переводом полученных единиц в микрометры (мкм). Статистическая обработка м а-териала проводилась по стандартной методике (Паушева, 1974).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В 2006 году на отдельных 13- летних деревьях клоновой прививочной плантации впервые образ о-
вались мужские генеративные органы. В 2007 году на всех 14- летних клонах происходило формирование микростробил. В этот период клоны достиг али высоты 1,5- 1,6 м, Б13 составил 15-17 см (табл. 1).
Морфометрические показатели пътьцы
В результате исследования было показано, что пыльца всех опытных деревьев (клонов и д еревьев из естественного древостоя) эллипсовидной формы и окружена двумя воздушными мешками. И по морфологии не отличается от других представителей рода Ртш.
Средние значения размеров пыльцы у деревьев -опылителей сосны сибирской из естественного древостоя варьируют по длине тела пыльцевого зерна от 50,08 мкм до 59,0 мкм, по высоте от 39,96 мкм до 55,5 мкм (табл. 3). Наиболее крупные пыльцевые зерна формировались у дерева 476 (длина пыльцевых зерен составляет 59,0 ± 0,5 мкм; высота - 55,5 ± 0,2 мкм) наиболее мелкие - у дерева 1А (длина пыльцевых зерен равна 50,08 ± 1,08 мкм, высота - 39,96 ± 0,93 мкм). Наиболее крупные размеры воздушных мешков отмечались у пыльцы дерева 22 (длина воздушного мешка составила ок о-ло 43,56 ± 1,36 мкм, высота - 26,96 ± 1,10 мкм). Минимальные размеры воздушных мешков набл ю-дались у дерева 3ш (29,9 ± 1,48 мкм по длине и 17,10 ± 0,93 мкм по высоте).
Размеры пыльцы, формирующейся на клон о-вой плантации, оказались намного меньше (табл. 4). Пыльцевые зерна достигали по длине тела пыльцевого зерна 34,7±1,32 мкм (Су = 14,4 %) для клона 157/17 мкм и 44,8±1,44 мкм (Су = 14,7 %) для клона 147/8, по высоте 14,7 ±0,73 мкм (Су = 22,8 %) для клона 228/173 и 39,2±1,09 мкм (Су =
13,1 %) для клона 141/3. Размеры воздушных мешков также варьировали по длине 31,4±1,15 мкм (^ = 17,7 %) для клона 157/17 и 44,1±1,12
мкм (^ = 12,5 %) для 147/8, по высоте 19,9±0,84 мкм (CV = 19.3 %) для 181/141 и 27,7±0,91 мкм (CV = 11,3 %) для 147/8.
Таблица 3 - Размеры пыльцы деревьев- опылителей кедра сибирского (над чертой - М±m, мкм, под чертой -^/о)_
№ дерева Тело пыльцевого зерна Воздушные мешки
длина высота длина высота
492 57,50±1,30 40,30±1,44 36,40±1,03 25,00±0,78
12,60 19,90 15,80 17,40
476 59,00±0,50 55,50±0,20 42,20±0,44 22,50±0,69
2,90 1,00 3,60 4,20
22 51,30±1,93 51,07±1,75 43,56±1,36 26,96±1,10
2,88 2,39 3,33 3,16
1А 50,08±1,08 39,96±0,93 33,12±0,91 18,96±0,90
7,60 11,40 13,40 23,10
3ш 57,90±3,16 35,20±1,61 29,90±1,48 17,10±0,93
7,20 12,40 13,20 38,30
Средние показатели 55,16±2,22 8,06 44,41±1,51 9,42 37,04±1,04 12,51 22,10±0,88 17,32
Таблица 4 - Размеры пыльцы клоновых деревьев кедра сибирского (над чертой - М±m, мкм, под чертой - CV,%)
№ клона Тело пыльцевого зерна Воздушные мешки
длина высота длина высота
1 2 3 4 5
277/22 39,9±0,96 23,8±1,04 37,5±1,44 24,1±0,92
11,5 19,6 17,7 17,7
142/1 35,5±0,78 25,34±1,0 33,3±0,78 24,6±0,73
8,3 19,5 8,9 15,2
358/70 43,7±1,33 26,7±1,13 38,9±1,55 22,0±0,78
12,1 18,1 16,8 15,7
157/17 34,7±1,32 28,7±1,09 31,4±1,15 23,1±0,69
14,4 15,9 17,1 14,7
145/4 35,9±0,87 29,17±1,01 32,9±0,83 22,8±1,05
9,2 14,6 11,3 21,5
171/131. 42,9±1,37 32,9±0,89 39,9±1,16 27,7±0,71
14,5 12,3 12,9 8,1
146/60 38,2±0,93 26,6±0,64 34,3±0,70 24,03±0,80
10,8 10,7 7,3 15,9
180/140 36,6±0,72 26,8±0,81 35±0,94 23,8±0,86
8,7 13,2 9,3 17,2
144/6 39,6±0,97 31,7±0,87 35,7±0,70 23,3±0,90
11,3 13,1 7,0 17,3
141/3 43,8±1,33 39,2±1,09 37,8±1,3 27,7±0,78
13,6 13,1 15,30 9,7
155/15 38,9±1,04 39,2±0,86 32,43±1,13 26,6±0,70
12,7 10,7 15,7 11,2
153/13 38,5±1,24 36,6±1,24 34,3±0,90 25,2±0,63
14,5 13,8 11,0 13,3
160/122 39,9±1,61 31,9±1,70 35,0±0,88 20,7±1,03
18,1 23,2 8,0 19,6
288/34 38,9±1,09 34,7±1,27 35,2±1,18 25,2±0,71
13,2 13,0 11,6 14,4
178/138 39,6±1,27 31,5±1,56 37,1±1,26 24,2±0,73
13,7 22,2 15,6 15,3
287/33 38,4±0,48 21,5±0,67 33,4±1,37 26,7±1,18
5,2 13,1 19,0 19,5
208/173 39,6±0,90 19,2±0,65 36,9±1,06 21,6±0,93
10,3 15,0 12,9 15,9
222/31 38,2±0,77 19,3±0,90 32,0±1,33 20,8±0,97
8,7 20,7 18,3 19,6
181/141 39,4±0,71 17,9±0,92 37,9±0,85 19,9±0,84
8,3 21,8 9,9 19,3
222/32 37,9±0,63 17,3±0,79 32,1±0,55 22,3±0,82
6,8 19,0 7,7 15,1
147/8 44,8±1,44 37,5±1,03 44,1±1,12 27,7±0,91
14,7 12,7 12,5 11,3
С.С. Савельев и др.: Качество пыльцы кедра сибирского (Ртж sibirica (Ршасеае)) на клоновой прививочной плантации
Окончание таблицы 4
1 2 3 4 5
156/16 39,2±0,71 34,3±0,96 37,1±0,83 24,2±0,80
9,2 12,2 10,0 16,2
208/173 39,8±0,64 14,7±0,73 37,1±0,91 20,6±0,99
7,0 22,8 11,0 20,1
Интересно отметить, что размеры пыльцы д е-рева № 22 и клона № 277/22, полученной от этого дерева, также значительно различаются. В среднем, размеры пыльцы клоновой плантации составляют для тела пыльцевого зерна 36,29±0,54 мкм по длине и 28,13±1,53 мкм по высоте, для воздушных ме ш-ков 32,98±0,63 мкм по длине и 22,06±0,49 мкм по высоте.
Таким образом, размер пыльцы, формирующейся в первый год пыления у клонов значительно меньше по сравнению с пыльцой в естественном древостое.
В целом, результаты морфометрического ан а-лиза показали, что пыльца, собранная у деревьев на клоновой плантации формировалась значительно мельче, чем пыльца, собранная с деревьев в естес т-венном древостое (рис. 1).
мкм 70
60 -50 -40 30 -20 -10
0
55,16
А
36,29
44,41
28,13
37,04
32,98
22,06 22,1
длина тела пыльцевого зерна
высота тела пыльцевого зерна
длина возлушных мешков
высота воздушных
мешков параметры пыльцы
Рисунок 1 - Сравнительная характеристика средних морфометрических параметров пыльцы кедра сибирского у клонов и деревьев из естественного древостоя (I I - клоновые деревья; I I -естественный древостой)
Прорастание пътьцы и рост пътьцевых трубок
Прорастание пыльцы было достаточно высоким у всех опытных деревьев. У разных деревьев пр о-растание колебалось от 75,4 % (дерево № 22) до
96.8 % (дерево № 492) пыльцевых зерен. Средняя длина пыльцевых трубок варьировала от 105 мкм (дерево № 22) до 164,9 мкм (дерево № 476), что также свидетельствует о высоком качестве пыльцы (табл. 5). При этом значения коэффициента вари а-ции длины пыльцевых трубок были высокими у всех опытных деревьев.
Прорастание пыльцы у большинства клонов оказалось очень низким (табл. 6). Процент проро сшей пыльцы колебался от 11,8 % (клон № 142/1) до
80.9 % (клон № 208/173). Отмечены были два клона, у которых жизнеспособность пыльцы составила 50 % (клон № 277/22) и 80,9 % (клон № 208/173). Жизнеспособность пыльцы у этих клонов почти не
отличалась от жизнеспособности пыльцы деревьев из естественного древостоя.
Таблица 5 - Прорастание пыльцы деревьев -опылителей из естественного древостоя (над чертой -М±т, мкм, под чертой - Су,%)_
№ дерева
Место произ- Прорастание, Длина,
растания
%
492 476 22 1А 3ш
Ермаковский район
Шушенский район
96,8 81,7 75,4 81 83,3
138,5±6,15
24,3 164,9±14,35
46,9 105,1±9,89
50,7 132,6±6,01
24,1 138,5±9,78 39,5
Таблица 6 - Прорастание пыльцы клоновых деревьев
сосны сибирской
№ клона Прорастание, % Длина пыльцевых трубок, мкм
142/1 11,8 36,0±3,78
181/141 12,8 28,8±0,89
155/15 34,4 58,9±1,25
162/122 32,6 32,10±2,49
180/140 30,5 43,0±2,22
153/13 14,3 33,4±3,81
277/22 50,0 120,4±3,30
288/34 2,8 80±0,1
171/141 10,6 25,2± 3,71
208/173 80,9 57,4±3,12
358/70 37,4 65,3±5,91
144/6 24,8 22,1±6,42
Гистохимический показатель качества пыльцы
Гистохимический тест пыльцы опытных деревьев сосны сибирской из естес твенного древостоя показал умеренное накопление крахмала в теле пыльцевого зерна (рис. 2а), так как большинство пыльцы давало слабое окрашивание (78 - 95 % у разных деревьев).
Пыльца от деревьев на клоновой плантации также показала умеренное накопление крахмала в теле пыльцевого зерна (рис. 2б). Однако, у четырех кл о-нов (№ 145/4, 146/60, 153/13 и 162/22) половина тестируемой пыльцы вообще не содержала крахм ала.
По результатам гистохимического окрашив ания пыльцы на содержание крахмала показано умеренное накопление его в теле пыльцевого зерна. Да н-ный показатель применяют в качестве теста, опр е-деляющего жизнеспособность пыльцы.
Цитологический анализ пытьцы с клоновой плантации
Цитологический анализ пыльцевых зерен, окрашенных сафранином, деревьев с клоновой пла н-тации показал, что пыльца ок азалась недоразвитой,
-«»
одноклеточной и содержала только одно ядро вег е-тативной клетки (рис. 3). Только у двух клонов (№ 208/173 и 277/22) пыльцевые зерна имели двукле-точную пыльцу.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
EL
h П h
Ll
492 22
№ дерева
Э 70 £ 60 -I
ср
о 50 -
со
40 30 20 -10 -0
Г
III IIIIII III! h
ш
^ # ^
ЧФ ф .ф
№ клона
Рисунок 2 - Гистохимический тест на содержание крахмала в пыльце. А- естественный древостой; Б-
клоновые плантации (I I - нет окрашивания; [_I -
слабое окрашивание; С_I - сильное окрашивание)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования, пыльца, впервые продуцируемой клоновыми деревьями кедра сибирского в 13- 14- летнем возрасте, оказалась низкого качества. Только у двух клоновых деревьев (из 23 пылящих) формировались двуклеточные пыльцевые зерна, которые прорастали в культуре in vitro.
Таким образом, для проведения гибридизацио н-ных работ на молодой клоновой прививочной пла н-тации необходимо использовать пыльцу с деревьев из естественного древостоя более старшего возра ста.
Рисунок 3 - Одноядерная пыльца клонового дерева
(146/60). Окраска сафранином. Увеличение 7х20.
(Стрелкой показано ядро)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Дженсен, У. Ботаническая гистохимия [Текст] / У. Дженсен.- М.: Мир, 1965.- 380 с.
Ирошников, А.И. Полиморфизм популяции кедра сибирского / А.И. Ирошников // Изменчивость древесных растений Сибири: сб. ст.- Красноярск, 1974.- С. 77103.
Минина, Е.Г. Морфогенез и проявление пола у хвойных [Текст] / Е.Г. Минина, Н.А. Ларионова.- М.: Наука, 1979.-215 с.
Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений [Текст] / З.П. Паушева.- М.: Колос, 1974.- 256 с.
Титов, Е.В. Гибридизация кедра сибирского: учеб. пособие [Текст] / Е.В. Титов.- Воронеж: Воронеж. гос. ле-сотехн. акад., 2006.- 127 с.
Третьякова, И.Н. Эмбриология хвойных (Физиологические аспекты) [Текст] / И.Н. Третьякова.- Новосибирск: Наука, 1990.- 157 с.
Johansen, D.A. Plant microtechnique / D.A. Johansen. - New York. - 1940.- 206 pp.
Nygaard, P. Studies in germination of pine pollen in vitro. Growth condition and effects pH and temperature on germination, tube growth and respiration / P. Nygaard // Physiol. plant. - 1969. - V. 22.- №3. -P. 338-346.
а
б
Поступила в редакцию 12 января 2008 г. Принята к печати 27 августа 2008 г.
