CC BY
18
УДК 616.081.51:575
Н.А.Шишкова, А.Н.Мокриевич, М.Е.Платонов, Т.Э.Светоч, Л.И.Маринин
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ГНЦ ПМБ
ФГУНГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
В работе представлены данные по VNTR - типированию сибиреязвенных штаммов из коллекции ГНЦ ПМБ. Всего проанализировано 25 штаммов Bacillus anthracis, имеющих разное происхождение и территориальную принадлежность. Использование схемы типирования по P.Keim et al. позволило соотнести российские штаммы со штаммами других коллекций. Было обнаружено 4 новых аллели: Dakkar - VrrA (296), 157 - VrrB2 (180), Dakkar -VrrC2 (478) и M-29 - pXO1 (138). Большая часть штаммов относится к группе A (величина VrrB1 фрагмента равна 229 п.о.) и лишь два штамма (1051 и 157) имеют величину VrrB1 фрагмента 256 п.н. Не укладываются ни в один из 89 описанных P.Keim et al. генотипов следующие штаммы из коллекции ГНЦ ПМБ: 1«Коломна», Ч-7, 15, M-29, 34, 81/1, 157, 228, 1051 и Dakkar. Показано генетическое разнообразие сибиреязвенных штаммов, выделенных из разных источников и находящихся в коллекции ГНЦ ПМБ.
Ключевые слова: B. anthracis, типирование, штамм, геном.
Bacillus anthracis представляет собой вид бацилл с исключительно мономорфным геномом. Только в середине 90-х американским исследователям [2] удалось обнаружить в геноме B. anthracis открытую рамку считывания (ОРФ) vrrA, которая содержала различное число тандемно расположенных повторяющихся последовательностей в зависимости от исследуемого генома (от 2 до 6). Предварительные данные по генетической вариабельности штаммов сибиреязвенного микроба PJ.Jackson et al. [3] получили, используя систему анализа по одному вариабельному локусу vrrA. Авторы обнаружили 5 аллелей этого локуса с размерами ампликонов от 142 до 190 пар оснований.
Основные исследования по типированию штаммов сибиреязвенного микроба были проведены P.Keim et al. [4, 5]. Первоначально применительно к сибиреязвенному микробу был адаптирован метод определения полиморфизма длины амплифици-рованных фрагментов. С помощью метода анализа полиморфизма длины вариабельных фрагментов в геноме B. anthracis было обнаружено еще семь вариабельных фрагментов ДНК, которые могут быть идентифицированы с помощью ПЦР-анализа [4]. Благодаря значительному разнообразию VNTR-
последовательностей, VNTR-анализ обладает большой разрешающей способностью по сравнению с другими системами молекулярного типирования. P.Keim et al. [5] разработали систему многолокус-ного анализа вариабельных тандемных повторов (MLVA - Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis), позволяющую дифференцировать штаммы B. anthracis по восьми маркерным локусам.
В табл. 1 представлены результаты сравнения величин фрагментов вариабельных областей генома сибиреязвенного микроба. Детальный анализ 426 сибиреязвенных штаммов показал, что ПЦР фрагменты, синтезирующиеся с помощью этих праймеров, варьировали в широких пределах и составили для vrrA 289-337 нуклеотидов (А = 48); vrrB1 184256 (А = 72); vrrB2 153-171 (А = 18); vrrC1 400-685 (А = 285); vrrC2 532-607 (А = 75); cg3 153-158 (А = 5); pXO1 117-141 (А = 24); pXO2 135-155 (А = 20). Исходя из представленных P.Keim et al. данных, все изученные штаммы B. anthracis можно условно подразделить на 4 группы.
В первую группу входят штаммы, имеющие величину vrrA фрагментов преимущественно 313 нуклеотидов, vrrB1 - 229 нуклеотидов, vrrB2 - 162 нуклеотида, vrrC1 - 613 нуклеотидов, vrrC2 - 604 нуклеотида,
Таблица 1
Величины фрагментов вариабельных областей генома B. anthracis (по P.Keim)
vrrA vrrB1 vrrB2 vrrC1 vrrC2 cg3 pXO1 pXO2
289 184 153 400 532 153 117 135
301 193 162 502 604 158 120 137
313 220 171 520 607 123 139
325 229 538 126 141
337 256 583 129 143
613 132 145
685 135 147
141 149
155
бо
cg3 - 153 нуклеотида, величины фрагментов рХО1 и рХО2 колеблются в значительных пределах.
Во вторую группу включены штаммы, практически все имеющие величину фрагмента vrrA 313 нуклеотидов, vrrB1 - преимущественно 229 нуклеотидов, vrrB2 - 162 нуклеотида, vrrC1 - 613 нуклеотидов, но vrrC2 фрагменты в этой группе штаммов уже имеют величину 532 нуклеотида и cg3 фрагменты - 158 нуклеотидов, величины фрагментов рХО1 и рХО2 также колеблются.
В третью группу входят штаммы, имеющие величину vrrA фрагмента 313 нуклеотидов, vrrB1 - 229 нуклеотидов, vrrB2 - 162 нуклеотида, но vrrC1 фрагменты уже имеют величину 538 нуклеотидов, vrrC2 -604 нуклеотида, cg3 - 158 нуклеотидов, величины фрагментов рХО1 и рХО2 значительно колеблются.
В четвертую группу входят штаммы, имеющие низкую величину vrrA фрагмента - 301 нуклеотид, vrrB1 фрагмент варьирует в этой группе от 184 до 256 нуклеотидов, vrrB2 - в основном 171 нуклеотид, vrrC1 - 583 нуклеотида, vrrC2 - 532 нуклеотида, cg3 - 158 нуклеотидов, размеры рХО1 и рХО2 фрагментов колеблются.
При исследовании с помощью MLVA штаммов B. anthracis со всего мира (за исключением России) было выявлено 89 генотипов, которые образуют шесть больших групп, представляющих все мировое разнообразие генотипов B. anthracis. При этом было выявлено, что одни генотипы имеют широкое распространение по всему миру, в то время как другие ассоциированы с определенными географическими регионами. P.Keim et al. [5] исследовали только один штамм российского происхождения - СТИ-1. Отсутствие восьмого маркерного локуса, ассоциированного с плазмидой pXO2, не дало возможности американским ученым отнести этот штамм к какому-либо из 89 генотипов, но было четко доказано, что он относится к подгруппе A1.a.
Как следует из краткого обзора, штаммы многих географических ареалов уже исследованы по представленной схеме с целью изучения их генетического разнообразия. Детальный анализ полной картины полиморфизма фрагментов позволил нам соотнести российские штаммы со штаммами других коллекций. Учитывая вышеизложенное, нами была проведена аналогичная работа по MLVA-генотипированию штаммов B. anthracis из коллекции ГНЦ ПМБ.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использовали сибиреязвенные штаммы B. anthracis из коллекции ГНЦ ПМБ. Штаммы выделены из различных источников в разных регионах России и за рубежом. Перечень штаммов приведен в табл. 2. Тотальную ДНК из исследуемых штаммов выделяли методом фенольной экстракции.
Праймеры для MLVA были синтезированны на фирме Amersham Pharmacia Biotech в соответствии с последовательностями, приведенными в работе
P.Keim et al. [5]. Все обратные праймеры несут на 5’-конце флюоресцентную метку Cy5 для использования в автоматическом секвенаторе ALFexpress II фирмы Amersham Pharmacia Biotech. При клонировании ам-пликонов в векторе pUC19 использовали немеченые праймеры, синтезированные фирмой «Литех». Эти же праймеры для подготовки фрагментов ДНК для сикве-нирования были синтезированы фирмой «Литех».
ПЦР проводили с использованием набора Ready-to-go-Beads фирмы Amersham Pharmacia Biotech на термоциклере Терцик (Москва) по следующей программе: предварительная денатурация - 95 °С, 5 мин; далее 35 циклов: денатурация - 95 °С, 30 с, отжиг -60 °С, 30 с, элонгация - 72 °С, 1 мин; заключительная элонгация - 72 °С, 5 мин.
Количество матричной ДНК составляло 1 нг, конечная концентрация праймеров - 0,2-0,4 мкМ. Для определения нуклеотидных последовательностей vrr-областей ПЦР-ампликоны клонировали в векторе pUC19 и секвенировали с праймеров M13 с использованием ALFexpress™AutoRead™Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Определение нуклеотидных последовательностей и размеров фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ALFexpressII фирмы Amersham Pharmacia Biotech в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя.
Продукты MLVA PCR анализировали электрофорезом на автоматическом флюоресцентном ДНК секвенаторе ALFexpress II. Каждая реакционная смесь анализировалась отдельно. В качестве внешних стандартов использовали коммерческие маркеры молекулярных масс: ALFexpress™Sizer™ 50, ALFexpress™Sizer™ 150, ALFexpress™Sizer™ 200, ALFexpress™Sizer™ 250, ALFexpress™Sizer™ 300, ALFexpress™Sizer™ 50-500, ALFexpress™Sizer™ 600-1600 фирмы Amersham Pharmacia Biotech и смесь семи ампликонов VNTR локусов штамма Ч-7 (pXO2 -137 bp; CG3 - 153 bp; VrrB2 - 162 bp; VrrB1 - 229 bp; VrrA - 314 bp; VrrC2 - 532 bp; VrrC1 - 613 bp), названную нами Ext std H7. Для анализа использовали программное обеспечение ALFwin™Fragment Analyser
1.00 фирмы Amersham Pharmacia Biotech. Детекцию пиков проводили при следующих установочных параметрах (settings): peak shape - 10; min height - 1,0; baseline type - minima detection; sensitivity - 100.
Для анализа гомологии нуклеотидных последовательностей использовали алгоритм AlignX программы Vector NTI.
Кластерный анализ проводили при помощи программы START (Sequence Type Analysis and Recombinational Tests) (версия 1.0.8) методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением - UPGMA (от англ. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) [6].
Результаты и обсуждение
Результаты по определению величин фрагментов vrr областей сибиреязвенных штаммов из коллекции
Таблица 2
Величины фрагментов vrr областей штаммов B. anthracis из коллекции ГНЦ ПМБ
Размеры Vrr фрагментов, п.н.
VrrA VrrB1 VrrB2 VrrC1 VrrC2 Cg3 PXO1 PXO2
№
Штамм. Источник.
1 1«Коломна». Труп коровы. Московская область 325
2 5«Тула». Корова. Тульская область 325
3 7(992). Труп коровы. Новгородская область 313
4 Ч-7(54). Труп человека 314
5 8 (2099). Труп коровы. Татарстан 325
б 10«Калуга». Труп коровы. Калужская область 313
7 11(1940). Труп яка. Таджикистан 313
8 15(1345). Труп коровы. Таджикистан 313
9 М-29(№ 1). Больной человек. Саратовская область 313
10 32(603). Корова. Казахстан 313
11 34(738). Труп коровы. Казахстан 313
12 35(1529). Труп коровы. Чувашия 313
13 61(1017). Корова. Кокчетавская область 313
14 71/12. 2-я вакцина Ценковского 313
15 81(638). Труп овцы. Казахстан 313
16 81/1. Больной человек. Ставропольский край 314
17 157(Б-1107). Труп коровы. Эстония 301
18 173(2-668). Труп человека. Свердловск 313
19 174(3-706). Труп человека. Свердловск 313
20 174/^. Вариант штамма 174 313
21 228. Труп овцы. Табахмельский биокомбинат 325
22 И-271. Труп оленя. Ямало-Ненецкий округ 313
23 И-272. Труп оленя. Ямало-Ненецкий округ 313
24 1051/35. Труп лошади. Уфа 301
25 Dakkar 296*
* Новые локусы.
ГНЦ ПМБ представлены в табл. 2.
В качестве контрольных были отобраны 3 штамма - 1«Коломна», Ч-7, 81/1. Для них провели полный сиквенс всех восьми маркерных локусов. Величины фрагментов vrr областей данных штаммов, определенные на основании сиквенса, представлены в табл. 3.
Для уточнения размеров новых аллелей, которые отличаются от описанных P.Keim et al., выполнено секвенирование отдельных ПЦР-ампликонов.
VrrA-локус. На рис. 1 приведены данные сиквенса последовательности VrrA-локуса у штаммов Ames, Ч-7 и Dakkar.
Согласно данным P.Keim et al. [5], VrrA фрагмент B. anthracis имеет 5 аллелей и последовательность, состоящую из 12 нуклеотидов, которая может повторяться у разных штаммов до 6 раз. Из пред-
Таблица 3
Величины фрагментов vrr областей штаммов B. anthracis из коллекции ГНЦ ПМБ, определенные на основании сиквенса
Штамм VrrA VrrB1 VrrB2 VrrC1 VrrC2 Cg3 PXO1 PXO2
1«Коломна» 325 229 162 616 601 153 135 137
Ч-7 314 229 162 613 532 153 135 137
81/1 314 229 162 613 604 153 135 137
229 162 616 601 153 135 137
229 162 613 601 153 136 135
229 162 613 601 153 136 135
229 162 613 532 153 135 137
229 162 613 601 153 135 137
229 162 613 601 158 136 137
229 162 538 601 158 132 137
229 162 538 601 153 130 137
229 162 613 601 153 1З8* 137
229 162 - 532 158 133 135
229 162 583 532 153 132 135
229 162 613 601 153 134 135
229 162 613 601 153 138 135
229 162 613 532 153 135 135
229 162 613 601 153 135 135
229 162 613 604 153 135 137
256 180* 583 532 158 138 137
229 162 613 532 153 135 137
229 162 613 532 153 135 137
229 162 613 601 153 139 137
229 162 583 532 153 127 137
229 162 583 532 158 130 147
229 162 583 532 158 130 147
256 162 583 532 158 127 137
229 162 496 478* 158 134 145
ставленных результатов следует, что в случае штамма Dakkar обнаружена новая аллель УггА фрагмента, содержащая 3 повтора.
^гВ1-локус. По данным Р.Кет et а1. [5], УггВ1 фрагмент В. anthracis имеет 5 аллелей и последовательность, состоящую из 12 нуклеотидов, которая может повторяться у разных штаммов от 12 до 20 раз. В нашей коллекции представлены 2 аллели из 5 возможных - это 229 и 256 нуклеотидов, содержащие 17 и 20 повторяющихся последовательностей.
^гВ2-локус. Ниже приведены данные сиквенса последовательности УггВ2-локуса у штамма 157. Жирным шрифтом выделены прямой и обратный праймеры.
157 - УггВ2 - 180
СЛСЛСССТЛТТСТТТЛТСЛЛЛСТ СЛТСААООТ
САССААООС САССАТОАТ САТСАСООТ САССАСООТ САТСААвОС САССАСООТ СААСАСАОТ СААСАОСАС СААСАОСАС СААСААТАТ СААСААТАТ СААСААТАТ СААСААТАТ СААСААТАТ СЛЛСЛЛСЛЛ ТСТТСЛССТТССС
Согласно данным Р.Кет et а1. [5], УггВ2 фрагмент В. anthracis имеет 3 аллели и последователь-
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
VrrA Ames VrrA H-7 VrrA Dakkar Consensus
(1
(1
(1
(1
( 51 ( 51 ( 51 ( 51
(101
(101
(100
(101
(151
(151
(144
(151
(201
(201
(194
(201
(251
(251
(232
(251
(301
(301
(301
(301
CGC (150
CGC (150
CGC (150
CGC (150
CACAAC TAC CACCGAT GG CACAAAAAAAGAAAG GGTTjCT TG СTAAACTС (50)
cacaactaccaccgatggcacaaaaaaagaaagggttScttgctaaactс (50)
CAC AAC TAC CACCGAT GG CACAAAAAAAGAAAG GGTTTCTTGC TAAACTС (50) CAC AA С T AC CAC CGAT GG CACAAAAAAAGAAAG GG T т|сT TG С TAAAC T С (50)
TTTAAAAAACACGATCCAACGGAAcBtTtEaTGCAAATGGTTCCGCCTTA (100) TTTAAAAAACACGATCCAACCGAACCT TTCATGCAAATGGTTCCGCC ТТА (100) TTTAAAAAACACGATCCAACCGAAC-TTTTATGCAAATGGTTCCGCCTTA (100) TTTAAAAAACACGATC CAAC CGAACCT TTCATGCAAATGG TT CCGCC TTA (100)
TCGACAAATGGAAGGACCAC CGCCAATGATGCACCAACAACAGCAACCGC TCGACAAAT GGAAGGACCAC CGCCAATGATGCACCAACAACAGCAAC CG С
TCGACAAATGGAAGGACCAC CGCCAATGATGCACCAACAAC------CGC
TCGACAAATGGAAGGACCACCGCCAATGATGCACCAACAACAGCAACCGC
CAC CC CAATAT CGACAGCAATATCAACAACAATATCAACAACAATATCAA (2 00) CAC С С СAAT AT С GA СAGC AA ТА T CAAC AA СAAT AT С AA CAAC AAT AT СAA (200) CACCCCAATATCGACAGCAATATCAACAACAATATCAACAACAATATCAA (2 00) CACCCCAATATCGACAGCAATATCAACAACAATATCAACAACAATATCAA (2 00)
CAA CAAT AT CAACAAC AA TА С С С GC AA CAAT AC T СA СA G С AA TAC CAAC С (250) CAACAATAT CAACAACAATACC CGCAACAATAC TCACAGCAATACCAAC С (2 50)
CAA-------------С AATACC CGC AA CAAT AC TCACAGC AATAC CAAC С (250)
CAACAATAT CAACAACAATACC CGCAACAATAC TCACAGCAATAC CAAC С (250)
ATACATGCAGC АТС AT CC CGAGCAAAT GATCCC TCC TC|-AAATGT AT GAA (300) ATACATGCAGCATCATCCCGAGCAAATGATCCC ТСС TC-AAATGTATGAA (300) ATACATGCAGCATCATCCCGAGCAAATGATCCCTCCTCCAAATGTATGAA (300) ATACATGCAGCАТСATCCCGAGCAAATGATCCC ТСС TC[AAATGTATGAA (300)
TCAAACGAAAC GCGC (315)
TCAAACGAAACGCGC (315)
TCAAACGAAACGCGC (315)
TCAAACGAAACGCGC (315)
Рис. 1. Сиквенс последовательности VrrA-локуса у штаммов Ames, Ч-7 и Dakkar:
«-» - нуклеотид отсутствует, серым выделены полиморфные сайты
ность, состоящую из 9 нуклеотидов, которая может повторяться у разных штаммов от 13 до 15 раз. В нашей коллекции представлены штаммы, величина VrrB2 фрагмента у которых составляет 162 нуклеотида (практически у 100 % штаммов), и лишь у одного штамма 157 выявлен VrrB2 фрагмент величиной 180 нуклеотидов, содержащий 16 повторов, эта аллель не обнаружена P.Keim et al.
VrrCl-локус. По данным P.Keim et al. [5], VrrC1 фрагмент B. anthracis имеет 7 аллелей и последовательность, состоящую из 36 нуклеотидов, которая может повторяться у разных штаммов до 12 раз. В нашей коллекции представлены 4 из 7 аллелей - 500, 538, 583 и 613 нуклеотидов. Результаты сиквенса VrrC1 фрагмента штамма 1«Коломна» из нашей коллекции показали, что данный штамм имеет вставку ААА в консервативной области.
VrrC2-noKyc. Ниже приведены данные сиквенса последовательности ^Л2-локуса у штамма Dakkar. Жирным шрифтом выделены прямой и обратный праймеры.
Dakkar - VrrC2 - 478
CCAGAAGAAGTGGAACCTGTAGCAC
TTGAGGAAATGCAACAAGAAATGGTGTTAAATGAAGCAATTGAAC
AAAAGAAГОAATTCATACATGTTGCTGAGGCTGATGAACAAACGA
AAAAAGATGTTCAAAGCTTTGCGGATGTTTT
ЛАТТОСАОЛАОЛАСЛАТС ООТТОТАОАООЛЛАСАСС ООТСОТАОЛЛОЛАСЛАТС
АОТТОТАОАООЛЛОСАСС ОАТТОСАОЛЛОЛЛСЛЛСО АОТТОТАОАООЛААСАСС
ООТСОТАОЛЛОЛАСЛАТС АОТТОТАОАООЛЛОСАСС ОАТТОСАОЛАОЛЛСАОТС
АОТТОТАОАООЛААСАСС ООТСОТАОЛЛОЛАСЛАТС АОТТОТАОЛАОЛАОСАСС
ТОСТОТАОЛАОАССЛЛСС АОТТОТОСЛЛЛААОЛЛОЛ ACCAAAACGTGAGAAAAAGCGTCACGTACCATTTAATG ГГО^А! GTTGAAACAA
GATAGAGCGCGATTAATGGAAAGAC
Согласно данным Р.Кет et а1. [5], УггС2 фрагмент В. anthracis имеет 3 аллели и последовательность, состоящую из 18 нуклеотидов, которая может повторяться у разных штаммов до 21 раза. Из представленных результатов следует, что в случае штамма Dakkar обнаружена новая аллель УггС2 фрагмента, содержащая 14 повторов.
CG3-локус. По данным Р.Кет et а1. [5], СО3 фрагмент В. anthracis имеет 2 аллели с величиной
153 и 158 нуклеотидов. В нашей коллекции в основном представлены штаммы с величиной CG3 фрагмента в 153 нуклеотида.
рХОІ-фрагмент. Ниже приведены данные сиквенса последовательности pXO1 у штамма М-29 (№ 1). Жирным шрифтом выделены прямой и обратный праймеры.
M-29 (№ 1) - pXO1 - 138
CAATTTATTAACGATCAGATTAAGTTCA TTATTAACTCATAAGTAATGTATTAAAAATTTTCAAATGGATTT AATAATAATAATAATAATAATAATAATAAT AACGGGACCAGCCATTATGAAGCAACTAATTCTAGA
Согласно данным P.Keim et al. [5], рХО1 фрагмент B. anthracis имеет 8 аллелей и последовательность, состоящую из 3 нуклеотидов (AAT), которая может повторяться у разных штаммов от 3 до 11 раз. Из представленных результатов следует, что у штамма М-29 (№ 1) обнаружена новая аллель рХО1 фрагмента, содержащая 10 повторов AAT.
рХ02-фрагмент. Далее приведены данные сик-венса последовательности pXO2 у штамма И-272. Жирным шрифтом выделены прямой и обратный праймеры.
И-272 - pXO2 - 145
TCATCCTCTTTTAAGTCTTGGGT
TATATTTATCTACCTTTGCGGTATGTGAAATT
AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT
CAAAAGAAAAAAGGAAGGGGAATACCCCCCTCCTTTACTTGTAC
TTT
TGTCGTCGGAGTTCATCACAC
По данным P.Keim et al. [5], рХО2 фрагмент B. an-thracis имеет 9 аллелей и последовательность, состоящую из 2 нуклеотидов (AT), которая может повторяться у разных штаммов от 3 до 11 раз. Большинство представленных в коллекции ГНЦ ПМБ штаммов по величине рХО2 фрагмента относятся к одному типу и имеют величину рХО2 фрагмента 135 нуклеотидов, содержащую 7 AT повторов. Обнаружен также штамм с 11 AT повторами - штамм И-272.
Всего было проанализировано 25 штаммов B. anthracis из коллекции ГНЦ ПМБ. При этом было обнаружено 4 новых аллели: Dakkar - YrrA (29б), 157 - YrrB2 (180), Dakkar - YrrC2 (478) и M-29 (№ 1) - pXO1 (138).
В ходе исследований фрагментов ДНК выяснено, что большая часть штаммов относится к A группе - величина YrrB1 фрагмента равна 229 п.н., и лишь два штамма - 1051/35 и 157, имеющие величину YrrB1 фрагмента равную 25б п.н., можно отнести к группе В. К подгруппе A1^ относятся штаммы 1«Коломна», 5^^^», 7 (992), 8 (2099), 10«Калуга», М-29 (№ 1), 35 (1529), б1 (1017), 81 (б38) и 174/3Y. К подгруппе A3^ относятся штаммы 71/12, 173 (2-бб8) и 174(3-70б). К подгруппе A3^ относятся штаммы И-271 и И-272. К группе A4 относится штамм 11 (1940). Не укладываются ни в один из 89 описанных
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное с помощью алгоритма UPGMA на основании результатов P.Keim et al. [5] и полученных в данной работе. Штамм 32(603) не использовался для построения дерева, т.к. у него отсутствует Vrrd-локус
P.Keim генотипов следующие штаммы из коллекции ГНЦ ПМБ: 1, Ч-7, 15 (1345), M-29 (№ 1), 34 (738), 81/1, 157, 228, 1051/35 и Dakkar.
Штамм Ч-7 по локусу CG3 является типичным представителем подгруппы A1.a, т.к. имеет аллель CG3-153, которая, согласно данным P.Keim et al. [4],
б4
является определяющим диагностическим маркером для подгруппы A1.a. Однако аллель 532 локуса VrrC2 не встречается ни у одного представителя подгруппы А1.а. Таким образом по совокупности всех восьми маркеров штамм Ч-7 не может быть отнесен ни к одному из 89 описанных P.Keim генотипов. Аналогичная картина наблюдается и со штаммами 1«Коломна» и 81/1. Они не могут быть отнесены ни к одному из генотипов подгруппы А1.а по локусу PXO1. Найденные новые аллели также формируют новые генотипы.
VNTR анализ по локусу vrrA показал, что 17 % штаммов составляют VNTR5 категорию, 73 % штаммов относятся к категории VNTR4, и только три штамма (10 %) попадают в категорию VNTR3. Не было выявлено штаммов категорий VNTR2 и VNTR6. Такое распределение подтверждает данные Jackson et al. [3] о превалировании VNTR4 типа в мировой коллекции штаммов и совпадает с ранее полученными результатами Е.А.Цыганковой и сотр. [1].
На основании полученных результатов было построено филогенетическое дерево (рис. 2). Несомненно, метод MLVA является одним из наиболее перспективных современных методов генотипи-рования и применение его для типирования разных штаммов B. anthracis позволит значительно расширить представления о генетическом разнообразии возбудителя сибирской язвы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Генетическое разнообразие локуса vrrA у штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории стран СНГ. В кн.: Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств. Оболенск; 2006. С. 125-6.
2. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of
a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species. J. Bacteriol. 1996; 178(1):377-84.
3. Jackson P.I., Walters E.A., Kalif A.S., Richmond K.L., Adair D.M., Hill K.K. et al. Characterization of the Variable-Namber Tandem Repeats in vrr A from different Bacillus anthracis isolates. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63(4):l400—5.
4. Keim P., Kalif A., Schupp J., Hill K., Travis S., Richmond K. et al. Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers. J. Bacteriol. 1997; 179(3):818-24.
5. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K., Schupp J.M., Okinaka R. et al. Multiple-locus VNTR analysis (MLVA) reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182:2928-36.
6. Jolley K.A. et al. Sequence type analysis and recombinational tests (START). Bioinformatics. 2001; 17:1230-1.
N.A.Shishkova, A.N.Mokrievich, M.E.Platonov, T.E.Svetoch, L.I.Marinin
Study of the Genetic Diversity of the Anthrax Microbe Strains from the Collection of SRC AMB
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Data on VNTR typing of anthrax strains from SRC AMB collection are presented. 25 Bacillus anthracis strains of different origin and isolated in different territories have been analyzed. Application of the typing scheme of P.Keim et al. enabled to correlate Russian strains with strains of other collections. 4 new alleles: Dakkar-VrrA(296), 157-VrrB2(180), Dakkar-VrrC2(478) and M-29-pXO1(138) were determined. Major part of the strains refers to the A group (the size of VrrB1 fragment is 229 b.p.) and only two strains (1051 and 157) possess VrrB1 fragment of 229 b.p. The following strains of SRC AMB collection: 1 Kolomna, Ch-7, 15, M-29, 34, 81/1, 157, 228, 1051 and Dakkar do not go in any of 89 genotypes described by P.Keim et al. Genetic diversity of the anthrax strains isolated from different sources and presented in SRC AMB collection is shown.
Key words: B. anthracis, typing, strain, genome.
Об авторах:
Шишкова Н.А., Мокриевич А.Н., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Маринин Л.И. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Оболенск. E-mail: firstova@obolensk.org
Authors:
ShishkovaN.A., Mokrievich A.N., PlatonovM.E., Svetoch T.E., Marinin L.I. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk. E-mail: firstova@obolensk.org
nociynHHa 25.02.10.
