CC BY
18
УДК 636.2:577.15:612.616.
Кузьмша Н.В., npoB^axiBe^, Осташв Д.Д., док. с/х наук, пров. наук. сшвроб^ник Яремчук 1.М., наук.спiвробiтник © 1нститут бюлогИ тварин НААН Украши, Львгв
1ЗОФОРМИ АСПАРТАТАМ1НОТРАНСФЕРАЗИ В ЕЯКУЛЯТАХ БУГА1В
Досл1джували iзоформи АСТ в еякулятах бугагв у зв 'язку з виживанням спермИ'в. У cnepMi midrnюв виявлено двi iзоформи аспартатамтотрансферази (АСТ1 та АСТ2), яю вiдрiзняютьcя мiж собою електрофоретичною рухливктю та ттенсивтстю зафарбування у 7,5% полiакриламiдному гелi. Мiж часом виживання спермпв та активтстю аспартатамтотрансферази кнуе корелящя - сильна пряма з АСТ1 (ц2АСТ1 = 0,88) i обернена - з АСТ2 (п2АСТ2 = 0,87). В процеЫ ткубування сперми cпiввiдношення iзоформ АСТ змтюеться -зростае вмкт АСТ1 i знижуеться - АСТ2. Кореляцтне вiдношення за часом виживання спермпв при ткубувант еякулятiв для iзоформ ферменту становить, вiдповiдно, до 100 год. - ц2АСТ1 = 0,68 i ц2АСТ2 =0,69 i быьше 100 год. - п2 АСТ1 = 0,92 i п2 АСТ2=0,69.
Ключоei слова: аспартатамтотрансфераза, iзоформи, виживання спермИ'в, сперма, електрофорез.
Вступ. Аспартатамтотрансфераза (ЕС 2.6.1.1 L-аспартат : 2-оксоглутарат амшотрансфераза, АСТ; глутамат: оксалоацетат трансамшаза, ГОТ), фермент класу трансфераз, що кат^зуе за участю коферменту тридоксаль-5'-фосфату, обернене перенесення амшогрупи (трансам^вання) вщ L-аспартату на а-кетоглутарат з утворенням оксалоацетату i L-глутамату. ACT мютиться в бшьшост тканин ссавщв, е внутршньокл^инним ферментом, складаеться переважно з двох субодиниць i юнуе у виглядi двох iзоформ -цитозольно! (цАСТ, мол.в. ~ 92,6 тис.) i мiтохондрiальноl (мАСТ, мол.м. ~ 89,8 тис.), яю вiдрiзняються мiж собою за фiзико-хiмiчними властивостями. Близько 1/3 загально! внутршньокл^инно! активностi ACT локалiзуеться в цитоплазмi клiтин, 2/3 - в м^охоц^ях [1, 2]. АСТ виконуе роль зв'язуючо! ланки мiж бiлковим i енергетичним обмiнами. Продукт l! реакци глутамат - вихiдна сполука катаболiзму амiнокислот; а оксалоацетат - один з головних регуляторних чинникiв, що визначае швидюсть функцiонування циклу трикарбонових кислот [3]. 1зоформи АСТ е компонентами малат-аспартаного шунту функцiонуючого в кликах печiнки, нирок та серця [4].
Визначення активностi АСТ в сироватщ або плазмi кровi широко використовуеться в клмчнш практицi для дiагностики захворювань серця, печiнки, кров^ опорно-рухово! системи та iнших. При порушенш цiлiсностi цитоплазматично! мембрани фермент видшяеться з пошкоджених клiтин в кров де його актившсть значно зростае. Для ензимодiагностики мае велике значення
© Кузьмша Н.В., Остатв Д.Д., Яремчук 1.М., 2010
93
знання про субкл^инну лок^зацш ферменту. Так, поява в позакл^иннш рщиш цАСТ, свщчить про запальний процес, а при виявленш м^охоч^ально! фракци - про значш пошкодження тканин, наприклад, некроз.
Актившсть аспартатамiнотрансферази проявляеться у спермi плщниюв. Встановлено, що величина активностi ферменту в еякулятах, поряд з шшими показниками, може служити маркером заплщнювально! здатностi спермив [58]. Тому метою роботи було вивчити iзоформи АСТ в еякулятах буга!в у зв'язку з виживанням спермив.
Матер1али i методи. Для дослiджень використовували свiжоотриманi еякуляти буга!в (n = 22), як належать НВО «Захщплемресурси». У спермi свiжоотриманiй та шкубованш при температурi +2-4°С (на першу, другу, третю та четверту доби) вивчали iзоформи бiлкiв АСТ (%) i виживання спермив (год.) до припинення прямолiнiйного поступального руху. 1зоформи АСТ виявляли пiсля електрофорезу у 7,5% полiакрiламiдному гелi (ПААГ), для чого цшьну сперму розбавляли 1:1 Трис-глщиновим буфером i додавали 0,05 мл 40% сахарози. У лунки концентруючого гелю вносили 0,04 мл проби (концентращя бшка 50-100 мкг). Фарбування пластин гелю для виявлення iзоформ АСТ здiйснювали методом [9] в нашш модифжаци: пiсля електрофорезу пластини ПААГ занурювали у середовище, що мiстило 0,5 мг/мл трщоксаль-5-фосфату, 30 мг/мл альбумiну, 0,2 М Ь,В-аспарагшово! кислоти, 0,1 М а-кетоглутарату та 150 мг дiазолiю синього С (мщного синього В) на 50 мл 0,2 М Na/K фосфатного буферу (рН 7,5) та шкубували 30 хв. при температурi 37°С. При шкубуванш гелю iзоформи аспартатамiнотрансферази зафарбовуються в червоно-коричневий колiр в наслiдок наступних реакцш:
1. аспартат + а-кетоглутарат ^ оксалоацетат + глутамат;
2. оксалоацетат + дiазолiй синiй С ^ зафарбований комплекс.
Пiсля фарбування гелi фiксують в 7% розчинi трихлороцотово! кислоти протягом 20 хв., а поим вщмивають залишки не зв'язано! фарби i зберiгають в 7% розчиш оцтово! кислоти.
Результати дослщжень. В дослiджених еякулятах буга!в виявлено двi iзоформи АСТ, якi в залежност вiд електрофоретично! рухливостi у 7,5 % ПААГ позначили як АСТ1 (менш рухлива) та АСТ2 (бшьш рухлива; рис. 1).
Рис. 1. Бшки АСТ сперми бугшв (АСТ1 i АСТ2 -поформн АСТ; 1 - 6 треки - свгжоотримана сперма бугаУв).
1 2 3 4 5 6
АСТ1 <-
АСТ2 <-
94
Як видно з рис. 1 iзоформи АСТ вiдрiзняються як за швидюстю руху в процес електрофоретичного роздшення бшюв, так i за iнтенсивнiстю прояву та площею зафарбованих смуг iзоформ ферменту.
Встановлена вщмшшсть свiдчить про неоднакову актившсть iзоформ ферменту у еякулятах буга1в, що, вiдповiдно, вказуе на яюсть статевих клiтин. Так, для сперми буга1в з часом виживання спермив менше 100 та бшьше 100 год. характерний рiзний вмкт iзоформ АСТ (табл. 1).
Таблиця 1
Вмкт 1зоформ АСТ (%) свгжоотрнманоУ сперми бугаУв та виживання
спермй'в
1зоформи АСТ Виживання, год.
<100 n=8 100-144 n=9 >144 n=5
АСТ1 37,6±1,45 64,4±2,03*** 68,5±1,80***
АСТ2 62,4±1,80 35,6±2,14*** 31,5±1,79***
Примггка:
■ р<0,001 р1зниця статистично в1ропдна пор1вняно з мшмальною величиною.
У свiжоотриманих еякулятах з величиною фiзiологiчного показника бiльше 100 год. вмкт АСТ1-iзоформи вищий на 26,8 - 30,9% (р<0,001), нiж при виживанш спермив менше 100 год (37,6±1,45%), а вмiст АСТ2-iзоформи, навпаки, нижчий. Ан^з кореляци свiдчить, що мiж iзоформами АСТ та тривалютю виживання статевих клiтин iснуe сильна залежшсть: для АСТ1 - пряма, а для АСТ2 -обернена. Кореляцшне вщношення за виживанням спермив для iзоформ становить: п2Аси = 0,88 та п2Астг = 0,87. Таким чином, стввщношення iзоформ ферменту у свiжоотриманих еякулятах буга1в е показником тривалостi виживання спермив.
В процес iнкубування сперми спiввiдношення iзоформ АСТ змiнюеться. В еякулятах з величиною фiзiологiчного показника менше 100 год. на другу добу шкубування, в порiвнянi з першою, зростае вмют АСТ1-iзоформи на 16,8 %, досягаючи свого максимуму на третю (61,43±2,41%, р<0,001), а вмiст АСТ2^зоформи, вiдповiдно, знижуеться з 65,5±1,20% (перша доба) до 39,0±2,70% (третя доба; рис. 1).
Рис. 1. Вмкт пофюрм АСТ при 1нкубуванн1 у еякулятах з виживання спермП'в менше 100 год.
При тривалост виживання спермив бшьше 100 год. вмют АСТЫзоформи зменшуеться на другу добу - на 12,9%, на третю повертаеться до вихщно!
95
величини (65,0±1,52%) i на четверту збшьшуеться на 5,8%, nopÍBMHO з першою добою (рис. 2). Отже, з вищою величиною фпюлопчного показника . 80,00
I U 70,00 i <
60,00 I 150,00 ■3 Í 40,00
% 30,00 0,00
tACTI
J--
К —AC 12
*
Рис. 2. Bmíct поформ АСТ при 1нкубуванн1 у еякулятах з виживання спермй'в бшьше 100 год.
перш друга третя четверга
доби
спiввiдношення iзоформ АСТ змшюеться у спермi меншою мiрою (р<0,05), порiвняно з низьким часом виживання спермй'в (р<0,001). 1з аналiзу кореляци випливае, що мiж часом шкубування сперми та вмiстом iзоформ АСТ юнуе сильна залежнiсть: для АСТ1 - пряма, а для АСТ2 - обернена. Кореляцшне вщношення за часом шкубування для iзоформ ферменту становить, вщповщно, до 100 год. - п2аст1 = 0,68 i г|2аст2 = 0,69 i бшьше 100 год. - п2 acti = 0,92 i п2 аст2 = 0,69.
Таким чином, при збшьшенш часу iнкубування еякулятiв вщбуваються змiни активностi АСТ-iзоформ, якi можуть свiдчити про оптимiзацiю забезпечення енерпею статевих клiтин в процесi виживання, а сшввщношення iзоформ ферменту у свiжоотриманiй спермi служить критерiем життездатност спермй'в.
Висновки.
1.В спермi буга!в виявлено двi iзоформи АСТ, як вiдрiзняються мiж собою за електрофоретичною рухливiстю та iнтенсивнiстю зафарбування у ПААГ.
2.Встановлена кореляцiя з часом виживання спермй'в - сильна пряма для АСТ1 (п2 аст1 = 0,88) та обернена - для АСТ2 (п аст2 = 0,87) iзоформ.
3.В процес iнкубування сперми сшввщношення iзоформ АСТ змiнюеться. Кореляцшне вщношення за часом шкубування еякуляив для iзоформ ферменту становить, вщповщно, до 100 год. - п2АСТ1 = 0,68 i п2АСТ2 =0,69 i бшьше 100 год. - п2 аст1 = 0,92 i п2 аст2=0,69.
Л1тература.
1.Биохимия. /Под ред. Е.С. Северина. — Москва: Мир. — 2003. — С. 119-124.
2.Leung F.Y. Isolation and purification of aspartate aminotransferase isoenzymes from human liver by chromatography and isoelectric focusing / Leung FY., Henderson A.R. //Clin. Chem. — 1981. —Vol.27. — N2. — P. 232-235.
3.Córdoba M. Heparin and quercitin generate differential metabolic pathways that involve aminotransferases and LDH-X dehydrogenase in cryopreserved bovine spermatozoa / Córdoba M., Pintos L.N., Beconi M.T. //Theriogenology. — 2007 — Vol. 67 — P. 648-654.
96
4.Mitchell M. Disruption of Mitochondrial Malate-Aspartate Shuttle Activity in Mouse Blastocysts Impairs Viability and Fetal Growth / Mitchell M., Cashman K. S., Gardner D., Thompson J., Lane M. // Biology of Reproduction. — 2009. — Vol. 80. — N. 2.— P. 295-301.
5.Nizanski W. Effects of three cryopreservation methods and two semen extenders on the quality of dog semen after thawing / Nizanski W., Dubiel A., Bielas W., Dejneka G.J. // Reprod. Fertil. Suppl. — 2001. — Vol. 57. — P. 365-369.
6.Gaczarzewicz D. Plasma membrane changes during the liquid storage of boar spermatozoa: a comparison of methods. / Gaczarzewicz D., Piasecka M., Udala J., Blaszczyk B., Stankiewicz T., Laszczynska M. // Acta Vet. Hung. — 2010. — Vol.58. — N.1. — P. 105-116.
7.Gundogan M., Yeni D., U^ar M., Ozen? E. Relationship between some reproductive parameters and biochemical properties of blood serum in rams. / Gundogan M., Yeni D., U?ar M., Ozen? E. // Arch. Androl. — 2004. — Vol.50. — N.6. — P. 387-390.
8.Kozdrowski R., Dubiel A. The effect of season on the properties of wild boar (Sus scrofa L.) semen. / Kozdrowski R., Dubiel A. // Anim. Reprod. Sci. — 2004. — Vol.80. — N. 3-4. — P. 281-289.
9.Alfano J. Isolation and characterization of a gene coding for a novel aspartate aminotransferase from rhizobium meliloti / Alfano J., Kahn M. // Journal of Bacteriology — 1993. — Vol. 175. — P. 4186-4196.
Summary Kuzmina N.V., Ostapiv D. D., Yaremchuk I. M.
Institute of animal biology NAAS of Ukraine ISOFORMS OF ASPARTATEAMINOTRANSFERASE IN BULL'S
EJACULATES
The isoforms of AST in bull's ejaculates in connection with survival of spermatozoa were studied. In sperm of bulls - sires were found two isoforms of aspartateaminotransferase (AST1 and AST2) that differby their elecroforetical mobility, and intensity of colouring in 7,5% poliacrylamide gel. Between time of survival of spermatozoa and activity of aspartateaminotransferase exists storng direct correlation for AST1 (n2ASTi = 0,88), and inverse -for AST2 (n2AST2 = 0,87). During the incubation of sperm correspondence of isoforms of AST changes: increases the content of AST1 and decreases AST2. Correlation ratio between time of incubation of ejaculates and isoforms of enzyme, to 100 hours, is: - tf2ACTi = 0,68 i tf2ACT2 = 0,69, and more than 100 hours: tf AST1 = 0,92 i tf AST2=0,69.
Cmammx nadiumna do pedaxu^ii 3.09.2010
97
