CC BY
22
УДК 577.15:57.086.83:633.34.
Кузьмша Н.В., Осташв Д.Д., Яремчук 1.М., Кушшрнк Б.О., Корнят С.Б., МнколаУв О.О. ®
1нститут бюлогп тварин НААН Украгни, Львт
1ЗОФЕРМЕНТНИЙ СПЕКТР СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗИ СПЕРМИ БУГА1В I КНУР1В
Вивчали ¡зоферментний спектр супероксиддисмутази (СОД) цыьног сперми, плазми та спермпв бугагв I кнургв. Методом електрофорезу в 10% полшкрилам^ному гел1 I специфтним фарбуванням виявлено 5 смуг бытв з СОД-активтстю ^1 - S5). Встановлено, що ¡зоферментний спектр СОД характеризуется видовою специфттстю: швидюстю мхграцп та ¡нтенсивтстю прояву ¡зоформ ферменту. У спермых бугагв I кнургв вгдсутнг S1- та S2-смуги, на вгдмгну в1д цыьног сперми та плазми. Ыдивгдуальнг особливост1 сперми плгдникгв проявляються ргзною ¡нтенсивтстю S1, S3 та S5-¡зоформ СОД.
Ключовi слова: супероксиддисмутаза, ¡зоформи, сперма, електрофорез, видова специфттсть.
Вступ. Генеращя активних форм кисню (АФК) - необхщна умова для дозрiвання, юнування та здатност спермив заплщнювати ооцит [1, 2]. Проте, тсля еякуляци i в процес виживання надмiрно високе утворення АФК призводить до пошкодження мембран, втрати рухливост та загибелi статевих клггин [3, 4]. Вмют АФК на оптимальному рiвнi пщтримуеться антиоксидантною системою, ключову роль в якш вiдiграe супероксиддисмутаза (СОД) [5]. Доведено, що СОД забезпечуе захист структур статевих кл^ин i в цьому процесi важливе значення мають И iзоформи [5].
Оскшьки фiзiолого-бiохiмiчна характеристика сперми та придатшсть до технолопчно! обробки залежить вщ виду самцiв, вивчали спектр та актившсть бiлкiв СОД у еякулятах буга1в та кнурiв.
Матер1алн 1 методн. Для дослщжень використовували свiжоотриманi еякуляти буга1в (п=12) та кнурiв (п=7). Дослiджували iзоформи СОД у цшьнш спермi, спермiях i плазма Для отримання спермив цiльну сперму центрифугували при 3000 об./хв., плазму вщбирали, а сперми тричi вщмивали охолодженим 0,9% розчином NaCl. 1зоформи СОД виявляли пiсля електрофорезу у 10% полiакрiламiдному гелi (ПААГ). Готували пробi: для чого цiльну сперму, плазму та сперми розбавляли 1:4 Трис-глщиновим буфером, рН 8,3; додавали 0,05 мл 40% сахарози. У лунки концентруючого гелю вносили 0,04 мл проби (концентращя бшка 50-100 мкг).
Фарбування пластин гелю для виявлення iзоформ СОД здшснювали методом ВеаиЛатр i Fridovich [6] в нашш модифкацп [7]: пiсля електрофорезу ПААГ занурювали в розчин, що мктив 1,23 мМ нiтросинього тетразолш (НСТ)
® Кузьмша Н.В., Осташв Д.Д., Яремчук 1.М., Куштрик Б.О., Корнят С.Б., Микола1в О.О., 2010
151
в 0,15 М Na/K фосфатному буфера рН 7,8, на 15 хв. в темной при юмнатнш температурi i тричi промивали дистильованою водою. Потiм заливали шкубацшним середовищем, що мiстило - 28 мМ ТЕМЕД i 0,028 мМ рибофлавш в 0,15 М Na/K фосфатному буферi, рН 7,8. 1нкубували в темнотi протягом 20 хв. Шсля шкубацп пластини промивали i опромiнювали ультрафiолетом 7 хв. для генераци супероксиданiонрадикалiв рибофлавiном. У результат фотохiмiчноl реакци вiдновлення НСТ до штроформазана супероксидними анiонрадикалами пластини набували темно-фiолетового забарвлення, окрiм зон з iзоформами СОД, якi залишалися прозорими внаслщок перехоплення супероксиданiонрадикалiв супероксиддисмутазою.
Результати дослщжень. Електрофорезом в 10 % ПААГ, у спермi буга!в та кнурiв виявлено п'ять iзоформ СОД, яю за швидкiстю руху у ПААГ позначили, вщ найменш - до максимально рухливо!, як S1, S2, S3, S4 та S5 (Рис. 1).
Рис. 1. 1зоферменти СОД сперми.
а) сперма бугая; б) сперма кнура. 1. цшьна сперма; 2. плазма сперми; 3. сперми. S1 - S5 - iзоформи ферменту
Рис. 2. ¡нднвщуальш особливосп iзоферментного складу СОД сперми плiдникiв.
1-3 треки - сперма буга!в; 4-6 треки -сперма кнурiв.
Встановлено, що спектр iзоферментiв СОД характеризуеться видовими вщмшностями, якi виражаються в рiзнiй швидкостi м^раци й iнтенсивностi прояву фракцш у ПААГ. Так, бшки СОД сперми кнурiв, порiвняно з спермою буга!в, мають меншу електрофоретичну рухливкть. Для всiх отриманих
152
спекав характерш слабкий прояв i мшоршсть S1-смуги, а також висока актившсть S4-смуги.
1ндивщуальш особливостi iзоформ СОД в еякулятах проявляються рiзною iнтенсивнiстю S1, S3 та S5-смуг, що свiдчить про 1х неоднаковий внесок в сумарну актившсть ферменту (Рис. 2).
Встановлено, що у профЫ iзоферментiв СОД спермнв як буга1в, так i кнурiв вiдсутнi S1- i S2-смуги (Рис. 1, 3), а склад ферменту плазми i цшьно! сперми подiбнi мiж собою (Рис. 3).
О 4J 100,0
Ъ a 80.0
a
- 60,0
2 40,0
i 20.0
EJ
0.0
1 2 г =
■ ■_ •о
1 1 | -i
□ □!□ lu__1 | О s n s
S2 Si £5 S,s2Si S4£5 81MM ss
ч
8 тол
60.0 60.0 I 40.0 20.0 0,0
„.J |= Dlol a
12 3 12 3
а) _ б)
Рис. 3. Вщсоток пофюрм у СОД-активностi сперми.
а) сперма бугая; б) сперма кнура. 1 - цшьна сперма; 2 - плазма сперми; 3 - сперми. S1 - S5 - iзоформи ферменту.
Висновки:
1. В цiльнiй cnepMi буга1в i KHypiB виявлено 5 iзоформ СОД.
2. 1зоферменти СОД KHypiB i буга1в вiдрiзняються мiж собою за електрофоретичною pyхливiстю i штенсившстю прояву окремих фpакцiй.
3. В спектрах бшюв СОД спермпв, як буга1в так i кнypiв вщсутш S1 та S2 смуги СОД-активност1
4. Iндивiдyальнi особливостi плiдникiв за СОД-актившстю проявляються piзною iнтенсивнiстю S1, S3, S5-CMyr.
Л1тература
1.P. Vemet, N. Analysis of Reactive Oxygen Species Generating Systems in Rat Epididymal Spermatozoal / Vernet P., Fulton N., Aitken R. J. // Biology of Reproduction — 2001. — Vol. 65. — P. 1102-1113.
2.Aitken R.J. Redox activity associated with the maturation and capacitation of mammalian spermatozoa / Aitken R.J, Ryan A.L, Baker M.A, McLaughlin E.A. // Free Radic Biol Med. — 2004; — Vol. 36. — P. 994 -1010.
3.Ozgocmen S. Antioxidant status and lipid peroxidation in seminal plasma and spermatozoa of patients with ankylosing spondylitis/ Ozgocmen S., Sogut S., Fadillioglu E., Ardicoglu A., Ardicoglu O. // Rheumatology — 2003; — Vol. 42. — P. 805-807.
4.Thimmappa R. Induction of Oxidative Stress by Organic Hydroperoxides in Testis and Epididymal Sperm of Rats In Vivo // Journal of Andrology, — 2007 — Vol. 28. — P. 41533-41545.
153
5.Potts R.J. Antioxidant capacity of the epididymis / Potts R.J., Jefferies T.M., Notarianni L.J. // Human Reproduction. — 1999 — Vol. 14. — P. 2513-2516.
6.Beauchamp C. Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels [Text] / Beauchamp C., Fridovich I. // Anal. Biochem. — 1971. — Vol .44. — P. 276-287.
7. Кузьмша Н.В. Актившсть супероксиддисмутази i глутатюнпероксидази в рiзних органах i KpoBi KopiB / Кузьмша Н.В., Осташв Д.Д. // Бюлопя тварин — 2008 — № 12. — С. 423-429.
Summary
Kuz'mina N. V., Ostapiv D. D., Yaremchuk I. M., Kushnirik B. O., Kornyat S. B., Mykolayiv O. O.
Institute of biology of animals UAAS, Lviv ISOENZYME SPECTRUM OF SUPEROXIDE DISMUTASE OF BULLS' AND BOAR' SPERM
The isoenzyme spectrum of superoxide dismutase of thick sperm, plasma of bulls and boars' spermatozoa was studied. Using electrophoresis method in 10 % polyacrylamide gel with specific coloring 5 strips with superoxide dismutase activity (S1 - S5) were revealed. It was established that isoenzyme spectrum of superoxide dismutase is characterized by typical specific features: speed of migration and display of enzyme isoforms. In bulls and boar spermatozoa S1 and S2 strips are absent in contrast to the thick sperm and plasma. Individual characteristic features of sire sperm are displayed with different intensity S1, S3 and S5 isoforms of superoxide dismutase.
Стаття надшшла до редакцИ 4.03.2010
154
