CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО... 41
УДК 616-006.81-085.371:616.15-097 Н.В. Голубцова1, И.НМихайлова1, В .В .Новиков2,'КА. Барышников1, Н.Б. Преснякова2,Е.В.Огородникова1, Н.Н. Петенко1, КА. Парсункова3, О.С. Бурова1, Г.З. Чкадуа1, Л.В. Демидов1, А.Ю. Барышников1
ИЗМЕНЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ РАСТВОРИМЫХ МОЛЕКУЛ HLA I КЛАССА, АНТИГЕНА CD8 И РАСТВОРИМОГО КОМПЛЕКСА HLA-I-CD8
У БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ В ПРОЦЕССЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ
1РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 3ГУП «МНКЦ «Интермедбиофизхим»», Москва
Контактная информация:
Голубцова Наталья Валерьевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)612-96-16 e-mail: ngolubcova@mail.ru
Статья поступила: 20.07.2010, принята к печати 22.07.2010.
Резюме
Исследовано сывороточное содержание растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии дендритными клетками. Полученные данные о нормализации уровня растворимых молекул HLA I класса, понижении уровня CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у большинства пациентов позволяют дополнить представления о возможных механизмах реализации иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии дендритными клетками.
Ключевые слова: растворимые антигены, иммунная система, вакцина, дендритные клетки, меланома.
N.V. Golubzsova1,1.N. Mikhailova1, V. V Novicov2, K.A. Baryshnikov1, N.B. Presniakova2, E.V. Ogorodnikova1, N.N. Petenko1, K.A. Parsunkova3, O.S. Burova1, G.Z. Chkadua1, L. V. Demidov1, A. Yu. Baryshnikov1 VARIATION FEATURES OF SOLUBLE HLA CLASS I MOLECULES,
CD8 ANTIGEN AND SOLUBLE COMPLEX HLA I-CD8 IN PATIENTS WITH DISSEMINATED MELANOMA DURING VACCINOTHERAPY
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod
3«Intermedbiophyshem», Moscow
Abstract
In this study we have examined the content of the soluble molecules HLA class I, CD8 antigen and HLA-I-CD8 complex in serum of patients with disseminated melanoma befor and after dendrtiic vaccination. We have observed that the level of HLA class I was comparable with the level of HLA class I in healthy donor. However the level of CD8 and HLA-1-CD8 was dramatically reduced. The data obtained increase our knowledge in innune response in patients with disseminated melanoma.
Key words: soluble antigens, immune system, vaccine, dendritic cells, melanoma.
Введение
В настоящее время получено достаточное количество данных о том, что многие поверхностные антигены клеток иммунной системы могут находиться не только в мембранной, но и в растворимой форме, принимая непосредственное участие в реализации иммунного ответа [3; 4; 9; 10]. К белкам, способным регулировать иммунные механизмы и выступать в качестве факторов ухода опухоли от иммунологического надзора относятся растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. Каждая из растворимых дифференцировочных молекул или растворимых молекул гистосовместимости может быть представлена несколькими изоформами, образующимися за счет шеддинга (протеолитического отщепления мембранных белков с поверхности клеток) с мембраны клетки или альтернативного сплайсинга матричной РНК [11]. Они осуществляют множественные функции, модулируя иммунные реакции путем связывания с лигандами своих мембранных гомологов на поверхности клеток, являются межклеточными белковыми коммуникаторами.
Нарушение равновесного содержания растворимых форм мембранных антигенов в межклеточном пространстве и биологических жидкостях организма приводит к модуляции межклеточных мембранных взаимодействий и, соответственно, иммунного ответа. Молекулы НЬА I класса (НЬА-1) - чрезвычайно важные для осуществления иммунного ответа полиморфные трансмембранные белки, обеспечивающие распознавание иммунной системой чужеродных антигенов и аутоантигенов.
Растворимую форму сывороточного НЬА-1 секретируют ш vivo как Т-, так и В-лимфоциты. СБ8 антиген является поверхностным гликопротеином, найденным на мембране большинства цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов и части натуральных киллеров. Он обеспечивает эффективное взаимодействие клеток при презентации антигенов цитотоксическим Т-лимфоци-там, является корецептором Т-клеточного рецептора и обеспечивает распознавание антигенов, презентируе-мых в контексте молекул главного комплекса системы гистосовместимости 1 класса. Растворимый СБ8 антиген продуцируется активированными СБ8-положи-тельными цитотоксическими клетками.
Сывороточный уровень растворимого CD8 антигена служит маркером активации цитотоксических клеток. В то же время, взаимодействуя с молекулами HLA I класса, он тормозит цитотоксическое действие клеток, препятствуя их активации и пролиферации. Сохранение растворимыми сывороточными антигенами способности связывать растворимые гомологи мембранных партнеров подразумевает возможность существования в биологических жидкостях белковых комплексов, например, растворимый ассоциат молекул HLA I класса и CD8 антиген (HLA-I-CD8) [9; 11]. Количественное содержание такого растворимого комплекса изменяется при развитии заболеваний различной этиологии, в частности в области онкогематологии.[5; 11-14].
Одним из направлений в лечении онкологических заболеваний является применение методов вакцинотерапии [2; 6; 7]. Принцип вакцинотерапии основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов. Т-клетки, играющие роль в клеточно-опосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикацией по антигенам главного комплекса гистосовместимости. Одним из постоянных объектов для изучения вакцинотерапии является меланома - опухоль, растущая из меланоцитов, которая считается «антигенной опухолью», экспрессирующей опухолеассоциированные антигены. Специфический клеточный иммунный ответ на меланомные антигены происходит путем узнавания чужеродных пептидов рецепторами Т-клеток посредством молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) дендритных клеток. Изучение путей иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии является актуальным [2; 8].
Целью настоящей работы явилось исследование сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии дендритными клетками
Материалы и методы
Исследовали образцы сывороток крови больных диссеминированной меланомой (n = 55), которые после хирургического удаления опухоли получали вакцину (в среднем 7 вакцинаций). Забор крови проводился до вакцинации и далее перед каждым введением вакцины (интервалы между вакцинациями - 1 мес.). В качестве контроля использовались сыворотки здоровых доноров (n = 32).
В качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных аутологичным опухолевым лизатом.
Определение уровня растворимых молекул HLA I класса и CD8 антигена проводилось иммунофермент-ным методом с использованием меченых пероксидазой хрена МКА ИКО-53 и ИКО-31 (НПЦ «Медбиоспектр», Россия) и поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека, применяемых в качестве «первых» антител для сорбирования в лунки планшетов для иммунофер-ментного анализа [1].
Для определения растворимых комплексов HLA-I-CD8 в качестве «первых» антител для сорбции использовали МКА ИКО-53 против молекул HLA I класса; в качестве иммуноферментного конъюгата применяли МКА ИКО-31 против CD8 антигена. Учет результатов проводился спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Результаты выражали в условных единицах (МЕ/мл).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием методов описательной статистики. Применялся t-критерий Стьюдента; использовались непараметрические методы: U-тест Манна-Уитни (для независимых выборок) и тест Вилкоксона (для зависимых выборок). Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости p<0,05. Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Мейер. Сравнение двух кривых выживаемости проводили с помощью логранкового критерия. Проведение статистического анализа данных проводилось с помощью пакета программ EXCEL 2003, sTatIStICA 6.0 и SPSS 13.0.
Результаты и обсуждение
Первоначально проведенный сравнительный анализ исследуемых показателей свидетельствовал о том, что уровни сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных диссеминированной меланомой, получавших аутологичную дендритную вакцину, достоверно превышали значения содержания исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови здоровых доноров (p< 0,05). По окончании вакцинотерапии дендритными клетками достоверного изменения сывороточного содержания исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой выявлено не было (p>0,05) (табл. 1).
Показатели уровней сильно варьировали. Значения сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса колебались от 69,0 МЕ/мл до 8008,9 при нормальных значениях в контрольной группе (доноры) 1011,53± 117,8 МЕ/мл; у антигена CD8 , при норме у доноров 377,18±30,0 МЕ/мл, максимальное полученное значение равнялось 1793,1, а минимальное - 125,1 МЕ/мл. При норме 513,51±51,0.МЕ/мл, значения сывороточного содержания растворимого комплекса HLA-I-CD8 колебались от 74,8 до 1981,4 МЕ/мл. Мы проанализировали полученные результаты и перевели их в относительные в зависимости от нормы (контроль). Сывороточный уровень (СУ) растворимых антигенов рассчитывали по формуле:
„тг опыт - контроль лппп,
СУ =---------------------х 100%
контроль
Полученные показатели представлены в табл. 2
Поскольку в процессе вакцинотерапии сывороточные уровни исследуемых растворимых антигенов у пациентов (n = 55) сильно колебались, они были разделены на 2 группы: 1 -пациенты с изначально повышенным содержанием сывороточного уровня, 2 - больные с пониженным сывороточным содержанием растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA-I-CD8 (табл. 3). В ходе вакцинотерапии у пациентов 1 группы с изначально повышенным (203,03±210,6 %) содержанием сывороточного уровня HLA I наблюдали его снижение к концу лечения на 40 %, причем в течение первых трех вакцинаций уровень еще больше повышался (до 223 %), а затем падал до 165,8 %. Во 2 группе (n = 22) с изначальнопониженным содержанием сывороточного уровня растворимой формы молекул HLA I класса (66,60±65,1 %) в конце лечения наблюдалось умеренное повышение до 77,47±46,4 % (рис. 1). Был проведен анализ выживаемости пациентов в обеих группах (рис. 2). В группе 1 умерло 54,5% (18 из 33 пациентов), в группе 2 - 72,7% (16 больных из 22) пациентов. Медиана выживаемости составила в группе 1= 30±6,2 мес., в группе 2 - 22±8,9 мес. (р=0,589).
Коли —с-Группа 1 -и—Группа 2
Рис. 1. Изменение содержания уровня растворимой формы молекул HLA I класса в сыворотке у пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии.
Вр—мя, м—с.
Рис. 2. Выживаемость пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в зависимости от начального уровня растворимой формы молекул HLA I класса.
Колич—ство вакаинааий —♦— Группа 1 А Группа 2
Рис. 3. Изменение содержания в сыворотке уровня растворимой формы антигена CD8 у пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии.
группа CD8
^ группа 1 * • группа 2 +
+
0 20 40 60 80
Время, мес.
Рис. 4. Выживаемость пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в зависимости от начального уровня растворимой формы антигена CD8.
Вр—мя, м—с.
Рис. 5. Изменение содержания в сыворотке уровня растворимого комплекса HLA I -CD8 у пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии.
Рис. б. Выживаемость пациентов диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в зависимости от начального уровня растворимого комплекса HLA I -CDS.
44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО...
Таблица 1
Распределение сывороточного содержания растворимых молекул ЫЬЛ I класса, антигена СБ8 и растворимого комплекса ЫЬЛ-1-СБ8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (М±т), МЕ/мл____________________________________________________________________
Антиген Контрольная группа (доноры) п = 32 Пациенты до лечения п = 55 Пациенты после лечения п =55
ЫЬЛ I 1011,53±117,8 1501,50±1824,2* 1507,00±1890,5
СБ 8 377,18±30,0 489,43±331,0* 474,46±246,5
ЫЬЛ-ЬСБ 8 513,53±51,0 599,67±444,4* 532,15±341,4
* статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р < 0,05)
Таблица 2
Относительные показатели сывороточных уровней растворимых молекул ЫЬЛ I класса, антигена СБ8 и растворимого комплекса ЫЬЛ-1-СБ8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (М±т), %______________________________________________________________
Антиген Контрольная группа (доноры) п = 32 Пациенты до лечения п = 55 Пациенты после лечения п =55
ЫЬЛ I 100,0 148,45±180,2* 149,84±186,4
СБ 8 100 129,91±87,4* 126,10±65,2
ЫLЛ-I-CБ 8 100 112,34±80,4* 104,21±66,46
* статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р < 0,05)
Таблица 3
Относительные значения содержания в сыворотке растворимых молекул ЫЬЛ I класса, антигена СБ8 и растворимого комплекса ЫЬЛ-1-СБ8 в группах больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (М±т), %__________________________________________________________
Антиген Группа 1 (с повышенными значениями) Группа 2 (с пониженными значениями)
до лечения после лечения до лечения после лечения
HLA I (п=33) 203.03+210,6*'** (п=33) 165,80±97,2*** (п=22) 66,60±65,1*** (п=22) 77,47±46,4***
СБ 8 (п=46) 137,54±92,36* (п=46) 131,51±72,1* (п=9) 88,0±38,7 (п=9) 57,25±8,6*
ЫLЛI-CБ 8 (п=31) 141,02±102,9*** (п=31) 118,94±55,6** (п=24) 85,00±44,9** (п=24) 40,26±4,8***
* статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (доноры) (р<0,05); ** статистически достоверные различия между группами 1 и 2 (р < 0,05).
В зависимости от изменения содержания уровня растворимой формы антигена СБ8 в образцах сыворотки крови пациентов относительно контроля (содержание у здоровых доноров составило 377,18±30,0 и/т1), больные были разделены на 2 группы:
- группа 1: пациенты с повышенным содержанием сывороточного уровня растворимой формы антигена СБ8 (п = 46),
- группа 2: пациенты с незначительно пониженным содержанием уровня (п = 9).
В процессе вакцинотерапии у пациентов 1 группы с повышенным содержанием сывороточного уровня изменений к концу лечения выявлено не было. У больных группы 2 (п = 9) с незначительно пониженным начальным сывороточным содержанием растворимой формы антигена СБ8 отмечено дальнейшее
понижение этого показателя (рис. 3). Не обнаружено статистически значимых различий в выживаемости пациентов в зависимости от изменения содержания уровня растворимой формы антигена СБ8 у больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в образцах сыворотки крови пациентов относительно контроля (рис. 4). В группе 1 на момент анализа умерло 63,0 % (29 из 46), в группе 2 - 55,5 % (5 из 9) пациентов. Медиана выживаемости пациентов в 1 группе составила 30±4,5 мес., в группе 2 - 30±19,3 мес. (р=0,346).
Среднее значение концентрации сывороточного уровня растворимого комплекса ЫЬЛ-1-СБ8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками у здоровых доноров составило 513,53±51,0 и/т1.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОГО... 45
В зависимости от изменения содержания уровня в образцах сыворотки крови пациентов относительно нормы больные были разделены на 2 группы:
- группа 1: пациенты с изначально повышенным содержанием растворимого комплекса HLA-I-CD8 (n = 31),
- группа 2: пациенты с незначительно пониженным содержанием уровня (n = 24).
В процессе вакцинотерапии у пациентов 1 группы с изначально повышенными значениями наблюдалось понижение сывороточного уровня. У пациентов 2 группы с незначительным пониженным содержанием сывороточного уровня растворимого комплекса HLA-I-CD8 в конце лечения наблюдалось его дальнейшее понижение (рис. 5). Проведенный анализ не выявил статистически значимых различий в выживаемости больных в зависимости от изменения содержания уровня растворимого комплекса HLA I -CD8 в образцах сыворотки крови пациентов в ходе вакцинотерапии относительно контроля (рис. 6). На момент анализа умерло 61,3 % (19 из 31) в группе 1 и 62,5 % (15 из 24) пациентов в группе 2. Медиана выживаемости пациентов в 1 группе составила 30±4,9 мес., в группе 2 - 30±10,4 мес. (р=0,578).
Заключение
Проведенный анализ растворимых антигенов показал, что уровни содержания в сыворотке растворимых молекул HLA I класса, CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у больных диссеминированной меланомой достоверно превышали значения содержания исследуемых растворимых антигенов в сыворотке крови здоровых доноров. При этом все больные, получавшие вакцину, делились на две ограниченные группы (с повышенным уровнем антигенов и пониженным уровнем антигенов) относительно контрольной группы (доноры с нормальными значениями). Установлено, что при вакцинотерапии дендритными клетками наблюдается снижение уровня
растворимых молекул HLA I класса у больных с повышенными значениями и повышение до нормальных значений у больных с пониженным содержанием растворимого сывороточного HLA I.
Достоверных изменений в содержании растворимых форм CD8 антигена в образцах сыворотки крови пациентов с повышенными показателями выявлено не было, но была отмечена тенденция к понижению сывороточного содержания в группе с пониженными значениями относительно нормальных значений контрольной группы.
Было выявлено понижение сывороточного содержания растворимого комплекса HLA-I-CD8 в образцах сыворотки крови больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии в обеих группах.
Нами не обнаружено статистически значимых различий в выживаемости больных в зависимости от исходного уровня растворимых антигенов. Изучение сывороточного содержания растворимых антигенов в образцах сыворотки крови больных диссеминированной меланомой в дальнейшем может помочь в изучении путей иммунного ответа в процессе вакцинотерапии.
Полученные данные о нормализации уровня растворимых молекул HLA I класса, понижении уровня CD8 антигена и растворимого комплекса HLA-I-CD8 у большинства пациентов позволяют дополнить представления о возможных механизмах реализации иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии дендритными клетками.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-
технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
Литература
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Медицина, 1997. - 212 с.
2. Барышников АЮ. Принципы и практика вакцинотерапии рака. - Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, 2004. - Т. 2.
3. Барышников АЮ. Биотерапия опухолей: неудачи и перспективы // Маммология. - 2007. - №1. - С. 13-6.
4. Барышников АЮ, Демидов Л.В, Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
5. Гостюжова ЕА., Преснякова Н.Б., Волкова С А, Новиков ВВ. Изучение мониторинговой роли сывороточного пула растворимых дифференцировочных антигенов и молекул гистосовместимости при хроническом миелолейкозе // Российский биотерапевтический журнал - Материалы VII Всеросс. Научнопрактической конфер. «Отечественные противоопухолевые препараты». - 2009. -Т. 8, № 2. - С. 60.
6. Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Демидов Л.В. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, №3. - С. 8-18.
7. МоисеенкоВМ. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практическая онкология. - 2001. - Т. 4, № 8. - С. 58-64.
8. Моисеенко ВМ., Балдуева И А. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии // Медицинский академический журнал. - 2007. - Т. 7, № 4. - С. 17-35.
9. Новиков В.В, Караулов А.В., Барышников АЮ. Растворимые формы мебранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. - 2007. - № 4. - С. 249-53.
10. Новиков В.В., Евсегнеева И.В. Новые дифференцировочные антигены человека, утвержденные на VII Международном воркшопе // Росссийский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т. 2, № 3. - С. 3-6.
11. Новиков В.В, Караулов А.В., Барышников АЮ. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. - М.: изд-во МИА, 2008. - 243 с.
12. Contini P, ZochiM.R., Pierri I. et al. In vivo apoptosis of CD8 (+) lymphocytes in acute myeloid leukemia patients: involvement of soluble HLA-I and Fas ligand // Leukemia. - 2007. - 2. - P. 253-60.
13. Puppo F, et al. Soluble HLA antigens: new roles and uses // Immunol. Today. - 1997. - Vol. 18(4). - P. 54-155.
14. Puppo F,Ghio M, Contini P. et al Immunoregulatory role of soluble HLA molecules: a new skin for an old subject? // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). - 1998. - Vol. 46(3). - P. 157-60.
