CC BY
35
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ... 13
УДК 616-006.81-097:615.371
1 1 2 о 1 3
Н.В. Голубцова , И.Н.Михайлова , КА. Парсункова , Н.В. Балацкая , КА. Барышников , И.В. Евсегнеева ,
М.В. Огородникова1, И.В. Манина1, И.Н. Григорьева1, Е.В. Коржевская1, Г.З. Чкадуа1, Л.В. Демидов1,
А.Ю. Барышников1, , Ю.В. Шишкин1
ИЗМЕНЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 У БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ В ПРОЦЕССЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ
гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ГУП «МНКЦ «Интермедбиофизхим»», Москва
3Первый МГМУ имени И.М. Сеченова, кафедра клинической иммунологии и аллергологии, Москва Контактная информация:
Голубцова Наталья Валерьевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО адрес:115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)612-96-16 e-mail: ngolubcova@mail.ru
Статья поступила: 26.11.2010, принята к печати 25.10.2011
Резюме
Исследовано относительное содержание интерлейкина-2 (ИЛ-2) в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой (n=48) в процессе вакцинотерапии дендритными клетками. В зависимости от исходных уровней пациенты делились на две группы (с повышенными и пониженными значениями ИЛ-2) относительно показателей в контрольной группе доноров. Был проведен анализ выживаемости больных в зависимости от начального уровня относительного содержания ИЛ-2 в образцах сыворотки крови пациентов в обеих группах. Медиана выживаемости пациентов с исходно повышенными значениями ИЛ-2 составила 34,0+4,6 мес. В группе с пониженными значениями ИЛ-2 медиана выживаемости составила 24,0+16,7 мес. (р=0,131). Установлено повышение уровня относительного содержания ИЛ-2 у 85,4 % больных в ходе лечения.
Ключевые слова: цитокины, иммунная система, вакцина, дендритные клетки, меланома.
N.V. Golubzsova1,1.N. Mikhailova1, K.A. Parsunkova2, N.V. Balazskaya2, K.A. Baryshnikov1,1.V. Evsegneeva3,
M.V. Ogorodnikova1 I. V. Manina1,1.N. Grigorieva1, Е.V. Коrjevskaia1, G.Z. Chkadua1, L. V. Demidov,
A.Yu. Baryshnikov1'3, Yu. V. Shishkin1
VARIATION OF THE RELATIVE INTERLEUKIN-2 MAINTENANCE IN PATIENTS WITH DISSEMINATED MELANOMA DURING VACCINE THERAPY
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2«Intermedbiophyshem», Moscow
3I.M. SechenovMoscow State Medical University
Abstract
We have investigated the relative abundance of interleukin-2 (IL-2) in the serum of patients with disseminated malignant melanoma (n=48) during dendritic cell vaccine therapy. Depending on the baseline, patients were divided into two groups (with higher values of IL-2 and lower values) with respect to indicators in the control group of donors. The analysis was conducted in patient survival depending on the initial level of relative content of IL-2 in serum samples of patients in both groups. Median survival for patients with initially elevated values of IL-2 was 34,0±4,6 months. In the group with lower values of IL-2, median survival was 24,0±16,7 months (p=0,131). Established increase in the relative content of IL-2 in 85.4% of patients during treatment.
Key words: cytokines, immune system, vaccine, dendritic cells, melanoma.
Введение
В последнее время одним из методов лечения онкологических заболеваний, в частности меланомы, является вакцинотерапия [1; 2; 4; 9]. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевых антигенов [23].
Т-лимфоциты, играющие роль в клеточноопосредованном иммунитете, распознают аутологичные и аллогенные опухоли с рестрикцией по антигенам главного комплекса гистосовместимости. Активация иммунной системы может останавливать пролиферацию микрометастатичестких очагов опухолевых клеток, персистирующих в организме больных злокачественными новообразованиями после циторедуктивных вмешательств [1; 4; 5]. Меланома считается иммуногенной опухолью, экспрессирую-
щей опухолеассоциированные антигены, представляемые Т-лимфоцитами на основе молекул главного комплекса гистосовместимости ! класса. Специфический клеточный иммунный ответ на меланомные антигены происходит путем узнавания чужеродных пептидов рецепторами Т-клеток посредством молекул главного комплекса гистосовместимости дендритных клеток [7]. Вакцины с опухолеспецифичными антигенами вызывают специфический (Т-кле-точный) ответ иммунной системы [4].
Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется не только при взаимодействии клеток с антигеном или друг с другом, но и с помощью интерлейкинов [12; 26]. Характер опухолевого роста во многом зависит от эффективности иммунологических защитных механизмов и от способности трансформированных клеток уходить от иммунологического надзора.
Изменение равновесия клеточного ТМ и гуморального ТИ2 приводит к существенным изменениям иммунных реакций у больных с меланомой [17; 23; 30]. В некоторых работах было показано, что пациенты с метастатической меланомой на поздних стадиях течения заболевания существуют в состоянии ТИ2-опосредованного «хронического воспаления» [14; 16; 19], что обусловлено увеличением концентрации интерлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10) в периферической крови и продукцией инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Было выявлено, что преобладание данных цитокинов приводит к прогрессированию заболевания и увеличению процессов мета-стазирования [8; 13; 17; 18; 22; 24]. Пациенты с прогрессирующей меланомой имели преобладающие реакции ТИ2-типа против эпитопов МДСЕ-6 независимо от их стадии заболевания (стадия I в сравнении с IV), в то время как нормальные доноры и больные меланомой без текущего признака болезни имели выраженные ТЫ реакции или смешанные ТЫ/Т112 реакции на МДСЕ-6 пептиды [25]. Процент ШЫ-у-продуцирующих клеток значительно ниже у пациентов с меланомой независимо от стадии, чем у здоровых доноров [6; 20]. Стимулирование экспрессии ин-телейкинов ТЫ профиля (таких как ИЛ-2 и ШЫ-у) приводит к активации противоопухолевого клеточного иммунитета [17]. Показано, что наличие интерлейкинов ТЫ в зоне опухолевого роста предотвращает прогрессию болезни и приводит к регрессу, в то время как инвазия ТЬ2-опосредованными клетками увеличивает потенциал для метастазирования. Снижение в системном иммунном ответе может быть связано с синтезом опухолевыми клетками цитокинов-иммуно-супрессоров (ИЛ-10, ТСР-р, VEGF) и экспрессией на поверхности опухолевых клеток молекул FAS-L [21]. У пациентов с прогрессирующей меланомой циркулирующий профиль цитокинов отражает ТИ2-им-мунные реакции, в то время как пациенты, отвечающие на терапию, имеют профиль ТЫ [15]. Предполагается, что тактика лечения, направленная на активацию и поддержку ТЫ иммунного ответа, может иметь лучшую клиническую эффективность в отношении стабилизации и предотвращения опухолевого роста [22]. Существует гипотеза: в основе противоопухолевого иммунного ответа лежит реакция Т-кле-точного опосредованного иммунного ответа [29]. Результаты многочисленных исследований поддерживают гипотезу о том, что можно вызвать регресс меланомы путем секреции цитокинов ТЫ профиля активированными С04+ Т-лимфоцитами [11]. В некоторых работах показана корреляция между цитокинами ТЫ-профиля и случаями спонтанного регрессирования меланомы [27]. Однако достоверно не доказано, что подобные изменения иммунологического профиля вызывают регресс заболевания.
Цель настоящего исследования - изучение изменения относительного содержания сывороточного уровня интерлейкина-2 (ИЛ-2) у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками. Изучение изменения уровня цитокинов в ходе вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой позволит использовать их в качестве одного из критериев иммунологической эффективности противоопухолевой вакцинации [3; 9; 10; 28].
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы сывороток крови больных диссеминированной меланомой (п=48), полученные до начала вак-
цинотерапии аутологичными дендритными клетками и после 5 введения вакцины (интервалы между вакцинациями - 1 мес.). В качестве контроля использовались образцы сывороток крови здоровых доноров (n=102).
В качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных аутологичным опухолевым лизатом. Определение сывороточного уровня ИЛ-2 проводилось иммунофер-ментным методом с использованием диагностической тест-системы Bender MedSystems (Австрия). Учет результатов проводился спектрофотометрически при 1 = 450 нм.
Полученные результаты исследуемых показателей у пациентов анализировали относительно нормальных значений в группе здоровых доноров (контроль). Сывороточный уровень (СУ) ИЛ-2 рассчитывали по формуле:
„тг опыт - контроль лппг..
СУ =----------------------х 100%
контроль
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов описательной статистики. Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости p<0,05. Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Майер. Сравнение двух кривых выживаемости проводили с помощью логранкового критерия. Проведение статистического анализа данных проводилось с помощью пакета программ EXCEL 2003, STATISTICA 6.0 и SPSS 17.0.
Результаты и обсуждение
Перед началом вакцинотерапии среднее значение уровня ИЛ-2 в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой (n=48) составляло 18,10+12,30 пкг/мл и в ходе лечения повысилось до 21,33+24,79 пкг/мл. Среднее значение ИЛ-2 в контрольной группе здоровых доноров (n=102) составило 5,53+3,73 пкг/мл.
Однако значения сывороточного содержания исследуемого антигена у всех пациентов (n=48) колебались от 0,53 до 55,74 пкг/мл. Мы проанализировали полученные результаты и перевели их в относительные, в зависимости от нормы (контроль).
В зависимости от исходного уровня относительного содержания ИЛ-2 в образцах сыворотки крови всех пациентов (n=48) относительно контроля больные были разделены на 2 группы. Группу №1 составили пациенты с изначально повышенным относительным содержанием исследуемого цито-кина в сыворотке крови, а группу №2 - больные с пониженным содержанием уровня ИЛ-2 относительно средних значений данного маркера в сыворотке крови здоровых доноров (см. табл.).
Анализ сывороточного содержания ИЛ-2 выявил, что исходный уровень относительного содержания данного маркера в сыворотке крови пациентов группы №1 (n=41) был достоверно повышен в 3,7 раза по сравнению с контрольной группой здоровых доноров и в ходе лечения повысился в 4,4 раза относительно показателей в контрольной группе. В образцах сыворотки крови больных группы №2 (n=7) исходный уровень относительного содержания ИЛ-2 был достоверно снижен в 1,9 раза относительно показателей в контрольной группе здоровых доноров.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ... 15
В ходе лечения отмечена тенденция к понижению исследуемого маркера (ИЛ-2) у пациентов группы №2. Был проведен анализ выживаемости пациентов в двух группах больных, распределенных в зависимости от начального уровня ИЛ-2 (см. рис.). Медиана выживаемости в группе № 1 составила 34,0+4,6
время (мес)
Рис. Выживаемость больных диссеминированной меланомой в зависимости от начального уровня ИЛ-2 в сыворотке крови в группах №1 и №2.
Заключение
Исследовано относительное содержание ИЛ-2 у больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками.
На основании полученных данных было установлено, что при аутологичной вакцинации у большинства пациентов (85,4 % больных) наблюдается повышение уровня относительного содержания ИЛ-2 (ТЫ-тип цитокинов), которое свидетельствует об активации клеточного звена противоопухолевого иммунитета в ходе лечения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний», а также при поддержке Совета по грантам Президента РФ «НШ - 3482.2010.7»
Таблица
Относительное содержание ИЛ-2 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (М±т), %_________________________________________________________
Группы Среднее содержание ИЛ-2 (%)
До лечения После лечения
Все пациенты (п=48) 327,34+222,46* 385,73+448,20*
1. Группа №1 (п= 41); (повышены значения ИЛ-2) 374,19+206,30*, ** 443,39+460,99*, **
2. Группа №2 (п= 7); (понижены значения ИЛ-2) 52,90+32,29*' ** 48,02+32,83* **
3. Контрольная группа здоровых доноров (п= 102) 100,02+67,51* -
* статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р<0,05); ** статистически достоверные различия между группами №1 и №2 (р < 0,05).
Литература
1. Барышников А.Ю. Биотерапия опухолей: неудачи и перспективы // Маммология. - 2007. - №1. - С. 13-6.
2. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
3. Михайлова И.Н., Парсункова КА, Евсегнеева И.В. И др. Динамика цитокинов у больных с диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками // Иммунология. - 2010. - №3. - С. 131-5.
4. Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Демидов Л.В. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 8-18.
5. Моисеенко В М., Балдуева И А. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии // Медицинский академический журнал. - 2007. - Т.7, №4. - С. 17-35.
6. Botella-Estrada R, Escudero М., O'Connor J.E. et al. Cytokine production by peripheral lymphocytes in melanoma // Eur Cytokine Netw. - 2005. - 16(1). - P. 47-55.
7. Brady M.S., Eckels D.D., Lee F. et al. Cytokine production by CD4+ T-cells responding to antigen presentation by melanoma cells // Melanoma Res. - 1999. - 9(2). - P. 173-80.
8. Green D.S., Dalgleish A.G., Belonwu N. et al. Topical imiquimod and intralesional interleukin-2 increase activated lymphocytes and restore the Th1/Th2 balance in patients with metastatic melanoma // Br J Dermatol. - 2008. - 159(3). - P. 606-14.
9. Hersey P., Menzies S.W, Halliday G.M. et al. Phase I/II study of treatment with dendritic cell vaccines in patients: with disseminated melanoma //Cancer Immunol Immunother. - 2004. - 53(2). - P. 125-34.
10. Lauerova L, Dusek L, Simickova M. et al. Malignant melanoma associates with Th1/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response // Neoplasma. - 2002. - 49(3). - P. 159-66.
11. Lowes M.A., Bishop G.A., Crotty K. et al. T helper 1 cytokine mRNA is increased in spontaneously regressing primary melanomas // J Invest Dermatol. - 1997. - 108(6). - P. 914-9.
12. Machlenkin A., Goldberger O, Tirosh B. et al. Combined dendritic cell cryotherapy of tumor induces systemic antimetastatic immunity // Clin Cancer Res. - 2005. - 11(13). - 4955-61.
13. Mansfield A.S, Holtan S.G., Grotz T.E. et al. Regional immunity in melanoma: immunosuppressive changes precede nodal metastasis // Mod Pathol. - 2011. - 24(4). - P. 487-94.
14. Martrnez-Escribano J.A., Campillo J.A., Pinero A. et al. Prospective study of the levels of serum cytokines in patients with melanoma: prognostic value // Actas Dermosifiliogr. - 2005. - 96(2). - P. 83-91.
15. McCarter M., Clarke J., Richter D., Wilson C. Melanoma skews dendritic cells to facilitate a T helper 2 profile // Surgery. - 2005. - 138(2). - P. 321-8.
16. Minkis K., Kavanagh D.G., Alter G. et al. Type 2 Bias of T cells expanded from the blood of melanoma patients switched to type 1 by IL-12p70 mRNA-transfected dendritic cells // Cancer Res. - 2008. - 68(22). -P. 9441-50.
17. Missima F., Pagliarone A.C., Orsatti C.L. et al. The Effect of propolis on Th1/Th2 cytokine expression and production by melanoma-bearing mice submitted to stress // Phytother Res. - 2010. - 24(10). - P. 1501-7.
18. Nakai N., Katoh N., Germeraad W.T. et al. Immunohistological analysis of peptide-induced delayed-type hypersensitivity in advanced melanoma patients treated with melanoma antigen-pulsed mature monocyte-derived dendritic cell vaccination // J Dermatol Sci. - 2009. - 53(1). - P. 40-7.
19. Nevala W.K., Vachon C.M., Leontovich A.A. et al. Melanoma Study Group of the Mayo Clinic Cancer Center. Evidence of systemic Th2-driven chronic inflammation in patients with metastatic melanoma // Clin Cancer Res. - 2009. - 15(6). - P. 1931-9.
20. Rankin E.B., Yu D., Jiang J. et al. An essential role of Th1 responses and interferon gamma in infection-mediated suppression of neoplastic growth // Cancer Biol Ther. - 2003. - 2(6). - P. 687-93.
21. Redondo P. Update on melanoma: incidence, development and biological aspects // An Sist Sanit Navar. -2000. - 23(1). - P. 67-84.
22. Sasaki K., Pardee A.D., Qu Y. et al. IL-4 suppresses very late antigen-4 expression which is required for therapeutic Th1 T-cell trafficking into tumors // J Immunother. - 2009. - 32(8). - P. 793-802.
23. Sato T., Maguire H.C. Jr., Mastrangelo M.J., Berd D. Human immune response to DNP-modified autolo-
gous cells after treatment with a DNP-conjugated melanoma vaccine // Clin Immunol Immunopathol. -1995. - 74(1). - P. 35-43. '
24. Schaefer J. T., Patterson J. W., Deacon D.H. et al. Dynamic changes in cellular infiltrates with repeated cutaneous vaccination: a histologic and immunophenotypic analysis // J Transl Med. - 2010. - 8. - P. 79.
25. Tatsumi T., KiersteadL.S., Ranieri E. et al. Disease-associated bias in T helper type 1 (Th1)/Th2 CD4(+) T cell responses against MAGE-6 in HLA-DRB10401(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma // J Exp Med. - 2002. - 196(5). - P. 619-28.
26. Verdegaal E.M., Visser M., Ramwadhdoebe T.H. et al. Successful treatment of metastatic melanoma by adoptive transfer of blood-derived polyclonal tumor-specific CD4+ and CD8+ T cells in combination with low-dose interferon-alpha // Cancer Immunol Immunother. - 2011 Mar. - Epub ahead a print.
27. Wagner S.N., Schultewolter T., Wagner C. et al. Immune response against human primary malignant melanoma: a distinct cytokine mRNA profile associated with spontaneous regression // Lab Invest. - 1998. -78(5). - P. 541-50.
28. Willemsen R.A., Sebestyen Z., Ronteltap C. et al. CD8 alpha coreceptor to improve TCR gene transfer to treat melanoma: down-regulation of tumor-specific production of IL-4, IL-5, and IL-10 // J Immunol. -2006. - 177(2). - P. 991-8.
29. Winter H., Hu H.M., Poehlein C.H. et al. Tumour-induced polarization of tumour vaccine-draining lymph node T cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumour and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies // Immunology. - 2003. - 108(3). - P. 409-19.
30. Wong R., Lau R., Chang J. et al. Immune responses to a class II helper peptide epitope in patients with stage III/IV resected melanoma // Clin Cancer Res. - 2004. - 10(15). - P. 5004-13.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
